Способ получения искусственных семян на основе культуры каллусной ткани паслёна клубненосного (Solanum tuberosum L.) Российский патент 2023 года по МПК C12N5/04 

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии и физиологии растений, может быть использовано для массового получения однородного оздоровленного посадочного материала для семеноводческих хозяйств.

Уровень техники

Искусственные семена описываются как инкапсулированные в контролируемых (лабораторных) условиях такие растительные ткани (например, меристемы, каллус и т.д.) или скопления клеток, способные к регенерации целых растений, которые можно применять подобно обычным семенам и которые не теряют способности к формированию целого растения после хранения [Dhabhai R. Production and Applications of Artificial seeds: A Review / Dhabhai R., Prakash A. // International Research Journal of Biological Sciences, 2012, Vol. 1 No. 5, 74-78 pp., Hussain A. Synthetic seed: Prospects and limitations / Hussain A., Uma J., Jaiswal V.S. // Current Science, 2000, Vol. 78 No. 12, 1438-1444 pp.].

Понятие «искусственные семена» длительно связывали исключительно с процессом соматического эмбриогенеза [Murashige Т. Plant growth substances in commercial uses of tissue culture. In Frontiers of Plant Tissue Culture, edited by T. Thrope, pp.15-26, Calgary: International Association of Plant Tissue Culture (1978)], но сейчас ситуация изменилась, поскольку появились такие научные работы, в которых описано применение таких процессов, как пролиферация пазушных меристем, ее индукция, а также органогенез. Искусственный эндосперм искусственных семян содержит питательные вещества, витамины и гормоны, необходимые для развития проростка. Искусственная семенная оболочка защищает содержимое искусственных семян от контаминации и дегидратации.

Имеются работы по инкапсулированию фрагментов меристем растений рода Rauvolfia [Alatar A. Encapsulation of Rauvolfia tetraphylla microshoots as artificial seeds and evaluation of genetic fidelity using RAPD and ISSR markers / Alatar A., Faisal M.// Journal of Medicinal Plants Research, 2012, Vol. 6 No. 7, 1367-1374 pp., Mohammad F. Assessment of genetic fidelity in Rauvolfia serpentina plantlets grown from synthetic (encapsulated) seeds following in vitro storage at 4 ̊ C / Mohammad F., Alatar A. A., Ahmad N., Anis M., Hegazy A. K. // Molecules, 2012, Vol. 17, 5050-5061 pp.]

Вышеуказанные работы решали задачи по генетическому анализу и криосохранению растительного материала.

При выращивании культуры Solanum tuberosum L. основной задачей являются периодическое оздоровление, а также защита от контаминации.

Основным отличием предлагаемого способа от способа, использующего меристемы, является применение каллусной ткани (каллуса) при получении искусственных семян. Каллус - это дедифференцированная ткань в отличие от меристем и, таким образом, обладает большей однородностью, что снижает риск асинхронного развития искусственных семян.

Задача

Задачей создания нового способа получения искусственных семян на основе культуры каллусной ткани паслена клубненосного (Solanum tuberosum L.) является массовое получение однородного оздоровленного растительного материала, защищенного от контаминации.

Решение задачи

Поставленная задача решается использованием нового способа получения искусственных семян на основе культуры каллусной ткани паслена клубненосного (Solanum tuberosum L.), заключающемся в сегментировании каллусной ткани на фрагменты длиной 1-3 мм с последующей инкапсуляцией их в альгинатную оболочку, содержащую питательную среду с добавлением биоцида PhytoGlobe Belvetorix в 1% концентрации и ингибитор эндогенного этилена (нитрат серебра).

Раскрытие сущности изобретения

Сущность нового способа получения искусственных семян на основе культуры каллусной ткани паслена клубненосного (Solanum tuberosum L.) заключается в инкапсуляции фрагментов каллуса паслена клубненосного в капсулах из альгината кальция, содержащих биоцид. Питательные вещества поддерживают жизнеспособность фрагментов каллуса в капсулах, а содержание в гелевом матриксе биоцида защищает искусственные семена от контаминации. Кроме того, наличие в питательной среде стимуляторов роста способствует развитию проростков, а наличие ингибитора эндогенного этилена (нитрата серебра) улучшает морфологические характеристики проростков (удлиняются междоузлия, обильно образуются листовые пластинки). Таким образом, при воспроизведении культуры паслена клубненосного из искусственных семян можно получить однородные оздоровленные, хорошо растущие проростки.

Техническим результатом является массовое получение однородного оздоровленного растительного материала, защищенного от контаминации.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Искусственные семена получают из культуры каллусной ткани паслена клубненосного, культивируемой в условиях in vitro.

Фрагменты каллусной ткани диаметром 1-3 мм помещаются в гелеподобный 3% раствор альгината натрия, содержащий питательные вещества культуральных сред. В состав гелевого матрикса входят фитогормоны, ингибитор эндогенного этилена (нитрат серебра) а также биоцид PhytoGlobe Belvetorix. Затем фрагменты каллуса, диспергированные в гелевом матриксе, переносятся капельным методом в раствор хлорида кальция концентрацией 0,3 моль/л, что приводит к образованию капсул из альгината кальция. Затем капсулы дополнительно выдерживаются в растворе хлорида кальция в течение 15-25 минут до полного отвердевания, после чего промываются стерильной дистиллированной водой.

Состав питательной альгинатной среды, следующий:

Нитрат аммония (NH₄NO₃) - 1650 мг/л;

Хлорид кальция (CaCl₂ ⋅ 2H₂O) - 440 мг/л;

Сульфат магния (MgSO₄ ⋅ 7H₂O) - 370 мг/л;

Гидрофосфат калия (КH₂РО₄) - 170 мг/л;

Нитрат калия (КNО₃) - 1900 мг/л;

Борная кислота (Н₃ВО₃) - 6,2 мг/л;

Хлорид кобальта (CoCl₂ ⋅ 6Н₂О) - 0,025 мг/л;

Сульфат меди (II) (CuSO₄ ⋅ 5Н₂О) - 0,025 мг/л;

Сульфат железа (II) (FeSO₄ ⋅ 7Н₂О) - 27,8 мг/л;

Сульфат марганца (II) (MnSO₄ · 4Н₂О) - 22,3 мг/л;

Йодид калия (КI) - 0.83 мг/л;

Молибдат натрия (Na₂МoО₄ ⋅ 2Н₂О) - 0,25 мг/л;

Сульфат цинка (ZnSO₄⋅7H₂О) - 8,6 мг/л;

Натрий железная соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (NaFe-ЭДТА) - 5 мг/л;

Альгинат натрия - 30 г/л;

Сахароза - 20 г/л;

Тиамин - 0,5 мг/л;

Никотиновая кислота - 0,5 мг/л;

Пиридоксин - 0,5 мг/л;

Глицин - 2 мг/л;

Инозитол - 100 мг/л;

Бензиламинопурин (БАП) - 1 мг/л;

Нафтилуксусная кислота (НУК) - 0,1 мг/л;

PhytoGlobe Belvetorix - 10 мг/л;

Нитрат серебра (AgNO₃) - 1 мг/л;

pH - 5,6 - 6,0.

Осуществление изобретения

Реализация назначения с достижением технического результата показана при следующих манипуляциях: фрагменты каллусной ткани диаметром 1-3 мм помещаются в гелеподобный 3% раствор альгината натрия, содержащий питательные вещества культуральных сред. В состав гелевого матрикса входят фитогормоны, ингибитор эндогенного этилена (нитрат серебра) а также биоцид PhytoGlobe Belvetorix. Затем фрагменты каллуса, диспергированные в гелевом матриксе, переносятся капельным методом в раствор хлорида кальция концентрацией 0,3 моль/л, что приводит к образованию капсул из альгината кальция. Затем капсулы дополнительно выдерживаются в растворе хлорида кальция в течение 15-25 минут до полного отвердевания, после чего промываются стерильной дистиллированной водой.

Состав питательной альгинатной среды

Нитрат аммония (NH₄NO₃) - 1650 мг/л;

Хлорид кальция (CaCl₂ ⋅ 2H₂O) - 440 мг/л;

Сульфат магния (MgSO₄ ⋅ 7H₂O) - 370 мг/л;

Гидрофосфат калия (КH₂РО₄) - 170 мг/л;

Нитрат калия (КNО₃) - 1900 мг/л;

Борная кислота (Н₃ВО₃) - 6,2 мг/л;

Хлорид кобальта (CoCl₂ ⋅ 6Н₂О) - 0,025 мг/л;

Сульфат меди (II) (CuSO₄ ⋅ 5Н₂О) - 0,025 мг/л;

Сульфат железа (II) (FeSO₄ ⋅ 7Н₂О) - 27,8 мг/л;

Сульфат марганца (II) (MnSO₄ ⋅ 4Н₂О) - 22,3 мг/л;

Йодид калия (КI) - 0.83 мг/л;

Молибдат натрия (Na₂МoО₄ ⋅ 2Н₂О) - 0,25 мг/л;

Сульфат цинка (ZnSO₄⋅7H₂О) - 8,6 мг/л;

Натрий железная соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (NaFe-ЭДТА) - 5 мг/л;

Альгинат натрия - 30 г/л;

Сахароза - 20 г/л;

Тиамин - 0,5 мг/л;

Никотиновая кислота - 0,5 мг/л;

Пиридоксин - 0,5 мг/л;

Глицин - 2 мг/л;

Инозитол - 100 мг/л;

Бензиламинопурин (БАП) - 1 мг/л;

Нафтилуксусная кислота (НУК) - 0,1 мг/л;

PhytoGlobe Belvetorix - 10 мг/л;

Нитрат серебра (AgNO₃) - 1 мг/л;

pH - 5,6 - 6,0.

Изобретение относится к области биотехнологии. Сущность нового способа получения искусственных семян на основе культуры каллусной ткани паслёна клубненосного (Solanum tuberosum L.) заключается в инкапсуляции фрагментов каллуса паслёна клубненосного в капсулах из альгината кальция, содержащих биоцид. Питательные вещества поддерживают жизнеспособность фрагментов каллуса в капсулах, а содержание в гелевом матриксе биоцида защищает искусственные семена от контаминации. Кроме того, наличие в питательной среде стимуляторов роста способствует развитию проростков, а наличие ингибитора эндогенного этилена (нитрата серебра) улучшает морфологические характеристики проростков (удлиняются междоузлия, обильно образуются листовые пластинки). Способ позволяет массово получить однородный оздоровленный растительный материал, защищенный от контаминации.

Способ получения искусственных семян на основе культуры каллусной ткани паслена клубненосного (Solanum tuberosum L.), заключающийся во фрагментировании каллусной ткани Solanum tuberosum L. на фрагменты диаметром 1-3 мм, помещении их в гелеподобный 3% раствор альгината натрия, содержащий питательные вещества культуральных сред, при этом в состав гелевого матрикса входят фитогормоны, ингибитор эндогенного этилена (нитрат серебра), а также биоцид PhytoGlobe Belvetorix, перенесении капельным методом фрагментов каллуса, диспергированных в гелевом матриксе, в раствор хлорида кальция концентрацией 0,3 моль/л, дополнительном выдерживании образовавшихся капсул в растворе хлорида кальция в течение 15-25 минут до полного отвердевания, последующем промывании стерильной дистиллированной водой при следующем составе культуральной среды:

Нитрат аммония (NH₄NO₃) 1650 мг/л Хлорид кальция (CaCl₂ ⋅ 2H₂O) 440 мг/л Сульфат магния (MgSO₄ ⋅ 7H₂O) 370 мг/л Гидрофосфат калия (КH₂РО₄) 170 мг/л Нитрат калия (КNО₃) 1900 мг/л Борная кислота (Н₃ВО₃) 6,2 мг/л Хлорид кобальта (CoCl₂ ⋅ 6Н₂О) 0,025 мг/л Сульфат меди (II) (CuSO₄ ⋅ 5Н₂О) 0,025 мг/л Сульфат железа (II) (FeSO₄ ⋅ 7Н₂О) 27,8 мг/л Сульфат марганца (II) (MnSO₄ ⋅ 4Н₂О) 22,3 мг/л Йодид калия (КI) 0.83 мг/л Молибдат натрия (Na₂МoО₄ ⋅ 2Н₂О) 0,25 мг/л Сульфат цинка (ZnSO₄⋅7H₂О) 8,6 мг/л Натрий железная соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (NaFe⋅ЭДТА) 5 мг/л Альгинат натрия 30 г/л Сахароза 20 г/л Тиамин 0,5 мг/л Никотиновая кислота 0,5 мг/л Пиридоксин 0,5 мг/л Глицин 2 мг/л Инозитол 100 мг/л Бензиламинопурин (БАП) 1 мг/л Нафтилуксусная кислота (НУК) 0,1 мг/л PhytoGlobe Belvetorix 10 мг/л Нитрат серебра (AgNO3) 1 мг/л pH 5,6-6,0