НОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ПИРРОЛА С ИНГИБИРУЮЩЕЙ ГИСТОНДЕАЦЕТИЛАЗУ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2011 года по МПК C07D207/34 C07D207/42 C07D409/04 C07D405/04 A61K31/40 A61P35/00 

Изобретение относится к новым соединениям, полученным из пирролов, способу их получения и применению их в качестве лекарственных средств для лечения рака в составе фармацевтических композиций вследствие их ингибирующего действия на некоторые гистондеацетилазы.

Химический синтез соединений с три- и тетразамещенными кольцами пиррола можно проводить несколькими путями с применением методологий последовательного или конвергентного синтеза (Sundberg, in Comprehensive Heterocyclic Chemistry; Katrizki, A. and Rees, C. W. Eds.; Pergamon: Oxford, 1984; Vol. 4, p. 313). Один достаточно общий путь получения состоит в ароматизации замещенных пирролидинов (Fejes et al. Tetrahedron 2000, 56, 8545. Gupta et al. Synth. Commun. 1998, 28, 3151). Последние гетероциклические соединения можно, в свою очередь, получить в конвергентной форме с применением реакции циклоприсоединения между алкенами и азометинилидами (Ayerbe et al. J. Org. Chem. 1998, 63, 1795. Vivanco et al. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 6078). Известно также, что реакции сочетания производных карбоновых кислот с гидроксиламином приводят к образованию гидроксамовых кислот (Reddy et al. Tetrahedron Lett. 2000, 41, 6285), кроме того реакции между замещенными аминами и производными фосгена и тиофосгена приводят к получению посредством образования промежуточных изоцианатов и тиоцианатов соответствующих N-гидроксимочевин, N-гидрокситиомочевин, N-(алкил)аминомочевин и N-(алкил)аминотиомочевин (Jain et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003, 13, 4223).

С другой стороны, известно, что ингибиторы гистондеацетилазы (HDAC) представляют собой перспективный путь для лечения рака посредством механизмов блокирования роста некоторых опухолей (McLaughin et al. Biochem. Pharm. 2004, 68, 1139. Kramer et al. Trends Endocrin. Met. 2001, 12, 294. Archer et al. Curr. Opin. Genet. Dev. 1999, 9, 171). Хотя детализированные механизмы терапевтического действия вышеуказанных ингибиторов хорошо не известны, имеется общий консенсус в том, что ингибирование активных центров HDAC облегчает доступ некоторых генов к факторам транскрипции ацетилированием гистонов, локализованных в некоторых участках ДНК, которая кодирует белки регуляции клеточного цикла, такие как циклинзависимые киназы р21 (Archer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 6791). Другим преимуществом данной терапевтической цели является тот факт, что, как установлено, только приблизительно 2% транскрипции ДНК в мРНК модулируется ингибиторами HDAC (McLaughin et al. Biochem. Pharm. 2004, 68, 1139), которые должны иметь результатом низкую токсичность этих ингибиторов, которые наблюдали при клинических исследованиях (Van Lint et al. Gen. Express 1996, 5, 245. Glaseret al. Mol. Cancer Ther. 2003, 2, 151). Таким же образом установлено, что клиническую пригодность ингибиторов HDAC можно повысить при применении синергической комбинации с другими лечениями улучшением транскрипциональных профилей гена, которые затрудняют развитие резистенций (Keen et al. Cancer Res. Treat. 2003, 81, 177. Egger et al. Nature 2004, 429, 457).

Известны различные семейства ингибиторов HDAC, общие характеристики которых можно найти в различных обзорах (Villar-Garea and Esteller Int. J. Cancer 2004, 112, 171 and Curr. Drug Metab. 2003, 4, 11. Grozinger et al. Chem. Biol. 2002, 9, 3. McLaughlin et al, Drug Discov. Today 2003, 8, 793. Monneret Eur. J. Med. Chem. 2005, 40, 1, Biel et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 3186). В общих чертах структура наиболее активных ингибиторов характеризуется циклической или полициклической частью преимущественно гидрофобной природы, связанной углеродной промежуточной цепью с звеном, способным координировать с ионом металла активного центра HDAC. В частности, описан синтез 3-(4-ароил-1-метил-1Н-2-пирролил)-N-гидрокси-2-пропенамидов в качестве ингибиторов HDAC (cf. Mai et al. J. Med. Chem. 2004, 47, 1098). В этом случае промежуточная цепь является ненасыщенной и положения 3 и 5 кольца пиррола являются незамещенными, что приводит к линейной молекулярной геометрии.

Несмотря на количество ингибиторов, полученных синтетически, их терапевтическая пригодность не лишена проблем, среди них следует указать селективность ингибирования различных HDAC, некоторые из которых не являются пригодными терапевтическими мишенями в онкологии, токсичность и химическую нестабильность. В данном контексте настоящего изобретения описывается общий способ синтеза новых ингибиторов HDAC, который обеспечивает возможность образования большого числа функциональных групп, который приводит к получению химически стабильных молекул с различными полициклическими системами, размерами соединяющих цепей и звеньями координации с атомом металла ферментов, которые ингибируют.

Проблема, изложенная в настоящем изобретении, следовательно, должна быть разрешена предложением соединений и композиций с высокой селективностью при ингибировании различных HDAC, связанных с возникновением и развитием неопластических процессов, с высокой химической стабильностью и низкой токсичностью. Предложенное разрешение проблемы включает в себя применение производных пиррола формулы I. Указанные соединения имеют арильные или гетероарильные заместители в положениях 3 и 5, а также электронпритягивающие группы, такие как нитратная группа в положении 4, и гетерогенные группы в положении 2, которые состоят из соединяющих групп разной природы и групп N-гидроксимочевины, N-алкиламино(арил)мочевины, N-гидрокситиомочевины и N-(алкил)амино(арил)тиомочевины для координации иона металла HDAC. Эти производные пиррола демонстрирует высокую способность ингибировать пролиферацию клеток и рост опухоли.

Вкратце, предполагается, что настоящее изобретение разрешает проблему существующей потребности в ингибиторах гистондеацетилазы, делая доступными такие ингибиторы, обладающие такими преимуществами, как хорошие фармакологические свойства, стабильность в твердой фазе и в растворе, легкость и эффективность их химического синтеза и доступность и разнообразие исходных химических соединений.

Краткое описание графических материалов

На фигуре 1 показано действие, проявленное in vitro некоторыми из рассматриваемых соединений настоящего изобретения, на активность гистондеацетилаз клеточной линии HCТ116 (карциномы толстой кишки человека) по сравнению с TSA (акроним трикостатина А) и SAHA (акроним субероиланилида гидроксамовой кислоты), применяемыми в качестве положительного контроля.

На фигуре 2 показано влияние in vitro репрезентативных примеров рассматриваемых соединений настоящего изобретения, на активность гистондеацетилаз клеточной линии MOLT4 (фибробластный лейкоз человека) по сравнению с TSA и SAHA, применяемыми в качестве положительного контроля.

На фигуре 3 показаны количественные данные уровня ацетилирования, полученные с применением НРСЕ (высокоэффективный капиллярный электрофорез), гистонов Н3 и Н4 клеточной линии промиелоцитного лейкоза человека Jurkat, обработанной некоторыми рассматриваемыми соединениями настоящего изобретения при концентрации 10 мкМ.

На фигуре 4 показаны данные измерения процента апоптотических и некротических клеток в присутствии различных концентраций SAHA и двух рассматриваемых ингибиторов настоящего изобретения. Включены также данные, полученные с контрольным образцом и образцом, обработанным ДМСО. Показанные данные соответствуют данным модели НСТ116 карциномы толстой кишки человека.

На фигуре 5 показаны данные измерения процента апоптотических и некротических клеток в присутствии различных концентраций SAHA и двух рассматриваемых ингибиторов настоящего изобретения. Включены также данные, полученные с контрольным образцом и образцом, обработанным ДМСО. Показанные данные соответствуют данным модели HL60 острого миелоидного лейкоза человека.

На фигуре 6 показано ингибирование роста опухоли карциномы НСТ116 толстой кишки человека у «голых» мышей с отсутствием вилочковой железы, вызванное внутрибрюшинным введением некоторых рассматриваемых соединений настоящего изобретения. Ксеноимплантации осуществляли внутриселезеночным образом и ингибиторы инъецировали внутрибрюшинным образом согласно методу, детализированному в примере №18.

На фигуре 7 показана in vivo противоопухолевая активность некоторых рассматриваемых соединений настоящего изобретения, наблюдаемая у «голых» мышей с отсутствием вилочковой железы на модели МОLT4 фибробластного лейкоза человека. Ксеноимплантации осуществляли внутриселезеночным образом согласно методу, детализированному в примере №17.

Задачей настоящего изобретения являются производные пиррола общей формулы I:

Таким же образом, другой задачей настоящего изобретения являются способы получения соединений общей формулы I.

Другой дополнительной задачей изобретения является применение указанных производных для лечения разных форм рака ограничением роста опухоли посредством ингибирования действия некоторых гистондеацетилаз.

И наконец, данное изобретение имеет в качестве задачи получение фармацевтической композиции, которая может включать в себя любое производное пиррола общей формулы I и, по меньшей мере, один приемлемый фармацевтический эксципиент.

Подробное описание изобретения

Сначала настоящее изобретение предлагает некоторые соединения, являющиеся производными пиррола, которые имеют следующую формулу I:

где

R¹ и R³ независимо представляют собой фенильный радикал; моно- или полизамещенный в разных положениях кольца фенил или С5-С10-гетероарильную группу, которая содержит, по меньшей мере, один гетероатом из О, N или S;

R² представляет собой атом водорода или электронпритягивающую группу, такую как нитрогруппа; или амино- или амидогруппу;

R⁴ представляет собой атом водорода или неразветвленную, разветвленную или циклическую С1-С6-алкильную группу;

n равно числу метиленовых групп между 1 и 8 включительно;

Х представляет собой либо вторичную аминогруппу, атом кислорода либо ион серы;

Y представляет собой группу, выбранную из метилена, замещенного метилена и вторичного амина;

Z представляет собой либо атом кислорода, либо атом серы и

W представляет собой группу, выбранную из гидроксила, гидроксиамина, гидразина и алкил-, арил- или гетероарилгидразина.

В предпочтительном варианте осуществления соединениями формулы I являются

- 6-(3,5-дифенил-1Н-пиррол-2-карбоксамид)гексановая кислота следующей структурной формулы:

- 6-(4-нитро-3,5-дифенил-1Н-пиррол-2-карбоксамид)гексановая кислота следующей структурной формулы:

- N-(5-(гидроксикарбамоил)пентил)-3-фенил-5-(4-метоксифенил)-1Н-пиррол-2-карбоксамид следующей структурной формулы:

- N-(5-(гидроксикарбамоил)пентил)-5-фенил-3-(4-метоксифенил)-1H-пиррол-2-карбоксамид следующей структурной формулы:

- N-(5-(гидроксикарбамоил)пентил)-3-фенил-5-(4-метоксифенил)-4-нитро-1Н-пиррол-2-карбоксамид следующей структурной формулы:

- 1-(4-(3,5-бис-(3,5-диметоксифенил)-1Н-пиррол-2-карбоксамид)бутил)-3-гидроксимочевина следующей структурной формулы:

- 1-(4-(5-(4-метоксифенил)-4-нитро-3-(тиофен-2-ил)-1Н-пиррол-2-карбоксамид)бутил)-3-(2-метиламино)мочевина следующей структурной формулы:

Другой аспект изобретения относится к различным способам получения соединений общей формулы I. Затем будут описаны нижеследующие способы А-Е получения соединений формул (Ia), (Ib), (Ic) и (Id). Упомянутые соединения (Ia)-(Id) являются соединениями, общие формулы которых входят в диапазон общей формулы I.

Способ А

Способ А получения соединений общей формулы (Ia):

где R₁, R₂, R₃, R₄, X и n имеют значения, указанные выше, включает в себя реакцию смеси, состоящей из

а) 1Н-пиррол-2-карбоновой кислоты формулы II

b) соединения формулы III

НХ-(СН₂)_n-R⁵ (III),

где R⁵ представляет собой алкоксикарбонил,

с) реагента для активации карбоксильной группы и

d) третичного амина, выбранного из циклических или ациклических алифатических аминов с 3-10 атомами углерода и алканароматических аминов с 9-15 атомами углерода,

и реакцию полученного продукта со смесью гидроксида лития или натрия, диметоксиэтана и воды.

Для целей изобретения продукт реакции смеси четырех соединений пунктов от а) до d) можно получить добавлением одного из компонентов в органический растворитель при температуре от -85°С до +25°С, предпочтительно при температуре около 0°С, перед добавлением трех других компонентов. Затем указанную смесь выдерживают в течение некоторого времени для завершения реакции, в то время как температура смеси повышается до температуры окружающей среды. После завершения реакции сочетания сложный эфир, полученный после общего метода обработки, подвергают реакции со смесью гидроксида лития или натрия, диметоксиэтана и воды, таким образом получая, после соответствующей обработки, соединения общей формулы (Ia).

Способ В

Способ В получения соединений общей формулы (Ib):

где R₁, R₂, R₃, R₄, X и n имеют значения, указанные выше, включает в себя реакцию смеси, состоящей из

а) 1Н-пиррол-2-карбоновой кислоты формулы II

b) соединения формулы III

НХ-(СН₂)_n-R⁵ (III),

где R⁵ представляет собой алкоксикарбонил,

с) реагента для активации карбоксильной группы и

d) третичного амина, выбранного из циклических или ациклических алифатических аминов с 3-10 атомами углерода и алканароматических аминов с 9-15 атомами углерода,

и добавление к образовавшемуся продукту смеси гидрохлорида гидроксиламина и фенолфталеина в присутствии избытка метоксида натрия в метаноле.

Для целей изобретения продукт реакции смеси четырех соединений пунктов от а) до d) можно получить добавлением одного из компонентов в органический растворитель при температуре от -85°С до +25°С, предпочтительно при температуре около 0°С, перед добавлением трех других компонентов. Затем указанную смесь выдерживают в течение некоторого времени для завершения реакции, в то время как температура смеси повышается до температуры окружающей среды. После завершения реакции сочетания полученный сложный эфир добавляют к смеси гидрохлорида гидроксиламина и фенолфталеина в присутствии избытка метоксида натрия в метаноле. После завершения реакции и после соответствующей обработки получают соединения общей формулы (1b).

Способ С

Способ С получения соединений общей формулы (Ic)

где R₁, R₂, R₃, R₄, X, Z и n имеют значения, указанные выше, включает в себя реакцию смеси, состоящей из

а) 1Н-пиррол-2-карбоновой кислоты формулы II

b) соединения формулы III

НХ-(СН₂)_n-R⁵ (III),

где R⁵ представляет собой трет-бутоксикарбамоил (NHBoc) или бензилоксикарбамоил(NHCBz),

с) реагента для активации карбоксильной группы и

d) третичного амина, выбранного из циклических или ациклических алифатических аминов с 3-10 атомами углерода и алканароматических аминов с 9-15 атомами углерода,

снятие защиты у полученного продукта с применением обработки кислотой или гидролиза и реакцию продукта с фосгеном или его аналогами, такими как дифосген, трифосген или тиофосген, с получением изоцианата или тиоизоцианата, который обрабатывают гидроксиламином.

Для целей изобретения продукт реакции смеси четырех соединений пунктов от а) до d) можно получить добавлением одного из компонентов в органический растворитель при температуре от -85°С до +25°С, предпочтительно при температуре около 0°С, перед добавлением трех других компонентов. Затем указанную смесь выдерживают в течение некоторого времени для завершения реакции, в то время как температура смеси повышается до температуры окружающей среды. В зависимости от значения R₅ в соединении III, то есть в зависимости от того, представляет ли собой R₅ трет-бутоксикарбамоил (NHBoc) или бензилоксикарбамоил (NHCBz), последующие обработки будут разными. В случае, когда R₅ представляет собой NHBoc, образовавшийся продукт следует подвергнуть кислотной обработке, предпочтительно реакцией при температуре окружающей среды с трифторуксусной кислотой в галогенированном растворителе. Когда R₅ представляет собой NHCBz, образовавшийся продукт подвергают гидрогенолизу, предпочтительно реакцией с газообразным водородом или формиатом аммония в спирте с короткой цепью в качестве растворителя и в присутствии палладиевого гетерогенного катализатора. В обоих случаях после снятия защиты получают первичный амин, который обрабатывают фосгеном или одним из его производных, таких как дифосген или трифосген, или также тиофосген. Когда реакцию проводят с фосгеном, дифосгеном или трифосгеном, конечное соединение (Ic) будет иметь атом кислорода в качестве Z. Если, с другой стороны, обработку проводят тиофосгеном, Z будет атомом серы.

После реакции либо с фосгеном (дифосгеном, трифосгеном) или тиофосгеном получают соответствующие изоцианаты или тиоизоцианаты, которые обрабатывают in situ гидроксиламином для получения соединений формулы (Ic).

Способ D

Способ D получения соединений общей формулы (Id):

где R₁, R₂, R₃, R₄, X, Z и n имеют значения, указанные выше, и R₆ представляет собой Н, С1-С6-алкил, арил или гетероарил с 5 или 6 членами и с 1 или несколькими гетероатомами, выбранными из О, N или S, включает в себя реакцию смеси, состоящей из

а) 1Н-пиррол-2-карбоновой кислоты формулы II

b) соединения формулы III

НХ-(СН₂)_n-R⁵ (III),

где R⁵ представляет собой трет-бутоксикарбамоил (NHBoc) или бензилоксикарбамоил (NHCBz),

с) реагента для активации карбоксильной группы и

d) третичного амина, выбранного из циклических или ациклических алифатических аминов с 3-10 атомами углерода и алканароматических аминов с 9-15 атомами углерода,

снятие защиты у полученного продукта с применением обработки кислотой или гидролиза и реакцию продукта с фосгеном или его аналогами, такими как дифосген, трифосген или тиофосген, с получением изоцианата или тиоизоцианата, который обрабатывают гидразином или алкил-, арил- или гетероарилгидразинами.

Для целей изобретения продукт реакции смеси четырех соединений пунктов от а) до d) можно получить добавлением одного из компонентов в органический растворитель при температуре от -85°С до +25°С, предпочтительно при температуре около 0°С, перед добавлением других трех компонентов. Затем указанную смесь выдерживают в течение некоторого времени для завершения реакции, в то время как температура смеси повышается до температуры окружающей среды. В зависимости от значения R₅ в соединении III, то есть в зависимости от того, представляет ли собой R₅ трет-бутоксикарбамоил (NHBoc) или бензилоксикарбамоил (NHCBz), последующие обработки будут разными. В случае, когда R₅ представляет собой NHBoc, образовавшийся продукт следует подвергнуть кислотной обработке, предпочтительно реакцией при температуре окружающей среды с трифторуксусной кислотой в галогенированном растворителе. Когда R₅ представляет собой NHCBz, образовавшийся продукт подвергают гидрогенолизу, предпочтительно реакцией с газообразным водородом или формиатом аммония в спирте с короткой цепью в качестве растворителя и в присутствии палладиевого гетерогенного катализатора. В обоих случаях после снятия защиты получают первичный амин, который обрабатывают фосгеном или одним из его производных, таких как дифосген или трифосген, или также тиофосген. Когда реакцию проводят с фосгеном, дифосгеном или трифосгеном, конечное соединение (Ic) будет иметь атом кислорода в качестве Z. Если, с другой стороны, обработку проводят тиофосгеном, то Z будет атомом серы.

После реакции либо с фосгеном (дифосгеном, трифосгеном) или тиофосгеном получают соответствующие изоцианаты или тиоизоцианаты, которые обрабатывают in situ гидразинами или алкилгидразинами для получения соединений формулы (Id).

Способ Е

Способ Е представляет собой дополнительный способ получения соединений общей формулы (Id):

где R₁, R₂, R₃, R₄, X, Z и n имеют значения, указанные выше, и R₆ представляет собой Н, С1-С6-алкил, арил или гетероарил с 5 или 6 членами и с 1 или несколькими гетероатомами, выбранными из О, N или S, который включает в себя реакцию смеси, состоящей из

а) 1Н-пиррол-2-карбоновой кислоты формулы II

b) соединения формулы III

НХ-(СН₂)_n-R⁵ (III),

где R⁵ представляет собой 3-бензилоксиуреил или 3-алкил-, -арил- или -гетероарилуреил,

с) реагента для активации карбоксильной группы и

d) третичного амина, выбранного из циклических или ациклических алифатических аминов с 3-10 атомами углерода и алканароматических аминов с 9-15 атомами углерода.

Если описанную подробно выше реакцию сочетания проводят с N-бензилоксимочевинами или -тиомочевинами, необходимо только выделить соответствующие N-гидроксимочевины или -тиомочевины при помощи гидрогенолиза в присутствии подходящего катализатора. В случае N-алкил(арил, гетероарил)аминомочевин или -тиомочевин, если указанные радикалы уже введены в соответствующие предшественники (III), реакция сочетания дает непосредственно ожидаемые конечные соединения.

В качестве общего элемента способов А-Е реагентом активации карбоксильной группы предпочтительно является фенилдихлорфосфат, диэтилфосфоросиамидат (DEPC) или система, образованная 1-гидроксибензотриазолом и N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимидом.

Третичный амин в качестве компонента является общим реагентом для способов А и В, выбранным из циклических или ациклических алифатических аминов с 3-10 атомами углерода и алканароматических аминов с 9-15 атомами углерода. Такой третичный амин предпочтительно выбран из N-метилпирролидина или N-метилморфолина.

Предпочтительным является также проведение реакции между элементами от а) до d) каждого из способов А-Е с применением облучения микроволнами.

Получение предварительно указанных соединений формулы II проводят в органическом растворителе или в отсутствие его и при облучении микроволнами сначала реакцией смеси, включающей в себя:

а) нитроалкен с (Е)- или (Z)-конфигурацией следующей формулы IV

O₂N-CH=CH-R³ (IV)

где

R³ имеет значения, указанные выше;

b) имин с (Е)- или (Z)-конфигурацией следующей формулы V

R¹-CH=N-CH₂-COOR⁶ (V)

где

R¹ имеет значения, указанные выше, и

R⁶ представляет собой С1-С6-алкильную или арильную группу;

с) соль металла, предпочтительно выбранную из перхлората лития, перхлората серебра или ацетат серебра, и

d) третичное органическое основание (амин), выбранное из циклических или ациклических алифатических оснований с 3-10 атомами углерода и алканароматических оснований с 9-15 атомами углерода.

Для целей изобретения реакцию смеси, состоящей из четырех компонентов, указанных выше, можно проводить с применением облучения микроволнами или добавлением одного из компонентов в избытке относительно трех других в органическом растворителе и при температуре между -25°С и +25°С, предпочтительно при температуре около +25°С. После завершения реакции циклоприсоединения получают смесь 2-алкоксикарбонилпирролидинов, соответствующих заместителям, выбранным для каждой конкретной реакции. Эту смесь растворяют в циклическом простом эфире, таком как тетрагидрофуран, или ациклическом простом эфире с высокой точкой кипения, таком как бис-(2-метоксиэтиловый) эфир, известным также как «диглим», и добавляют окисляющий агент, такой как диоксид марганца, пероксид водорода или 2,3-дихлор-5,6-дициано-1,4-бензохинон. Спустя некоторое время при температуре между +60°С и 250°С получают смесь, состоящую из 2-алкоксикарбонил-NH-пиррола и соответствующего 2-алкоксикарбонил-4-нитро-NH-пиррола, компоненты которой можно разделить фракционной кристаллизацией или хроматографией. Кислоты общей формулы II получают посредством щелочного гидролиза ранее полученных сложных эфиров, предпочтительно обработкой их гидроксидом лития или натрия в смеси воды и диметоксиэтана.

Дополнительный аспект данного изобретения относится к применению этих соединений общей формулы I для лечения рака. Механизм действия этих соединений вследствие их антагонистических свойств в отношении гистондеацетилаз заключается в блокировании синтеза белков, ответственных за регуляцию таких процессов, как апоптоз или рост клеток и пролиферация клеток. Эти свойства предотвращают или блокируют связывание деацетилаз и родственных ферментативных комплексов с их природными субстратами, такими как остатки лизина, N-ацетилированного в ε-положении концевых лизинов гистонов, поэтому они остаются в моно- или полиацетилированном состоянии.

Последний аспект изобретения относится к композиции, которая состоит, по меньшей мере, из одного из соединений общей формулы I и одного или нескольких приемлемых фармацевтических эксципиентов. Соединения формулы I настоящего изобретения можно вводить в виде неразбавленного вещества, а также в форме фармацевтических препаратов, хотя введение соединения в комбинированной форме является предпочтительным. Комбинированную терапию предпочтительно проводят с применением препарата, который

i) содержит только соединение формулы I;

ii) содержит один или несколько эксципиентов и/или веществ-переносчиков и

iii) может содержать любое дополнительное терапевтически активное вещество.

Эксципиенты, вещества-переносчики и вспомогательные вещества должны быть фармацевтически и фармакологически толерантными таким образом, чтобы их можно было комбинировать с другими компонентами композиции или препарата и чтобы они не вызывали отрицательные действия в подвергаемом лечению организме.

Препараты включают в себя препараты, которые являются подходящими для перорального или парентерального введения (включая подкожное, внутрикожное, внутримышечное и внутривенное введение), хотя лучший путь введения будет зависеть от состояния пациента.

Препараты могут быть в форме однократной дозы, и их можно получать согласно известным методам в области фармакологии. Количества активных веществ для введения могут варьировать в зависимости от характеристик терапии, хотя они обычно варьируют между 1 мг и 500 мг в день в одной или нескольких дозах.

Для помощи лучшему пониманию вышеуказанных представлений ниже описываются некоторые рабочие примеры настоящего изобретения. Эти примеры являются только иллюстративными.

Пример 1

Получение 5-фенил-3-(4-метоксифенил)-1Н-пиррол-2-карбоновой кислоты следующей структурной формулы:

и 5-фенил-3-(4-метоксифенил)-4-нитро-1Н-пиррол-2-карбоновой кислоты следующей структурной формулы:

К смеси метил-N-фенилметилиденглицината (14,17 г, 80,0 ммоль) в ацетонитриле (800 мл) последовательно добавляют триэтиламин (12 мл, 80,0 ммоль), ацетат серебра (1,98 г, 11,9 ммоль) и (Е)-2-(4-метоксифенил)-1-нитроэтен (14,33 г, 80,0 ммоль). Развитие реакции контролируют тонкослойной хроматографией. После завершения реакции смесь фильтруют через подушку целита и промывают насыщенным раствором NH₄Cl (2 х 150 мл) и водой (2 × 150 мл). После сушки над MgSO₄ раствор упаривают при пониженном давлении, получая при этом 26,5 г смеси диастереомеров 5-фенил-3-(4-метоксифенил)-2-метоксикарбонил-4-нитропирролидина. 12,22 г (34,27 ммоль) этой смеси растворяют в бис-(2-метоксиэтиловом) простом эфире (343 мл) в атмосфере инертного газа и добавляют диоксид марганца (29,8 г, 343 ммоль). Реакционную смесь кипятят с обратным холодильником с перемешиванием в течение 48 ч. После этого времени температуру смеси доводят до комнатной, и смесь фильтруют через подушку целита. Полученный раствор концентрируют при пониженном давлении, получая при этом 7,93 г смеси, состоящей из 5-фенил-3-(4-метоксифенил)-2-метоксикарбонил-4-нитро-1Н-пиррола и 5-фенил-3-(4-метоксифенил)-2-метоксикарбонил-1Н-пиррола. Продукты разделяют с применением колоночной флеш-хроматографии, и каждый из них по отдельности гидролизуют, как указано ниже. 10% NaOH (40 мл, водный раствор) добавляют по каплям к раствору соответствующего сложного эфира (4,0 ммоль) в этаноле (100 мл), и смесь перемешивают при кипячении с обратным холодильником. Развитие реакции контролируют тонкослойной хроматографией. После завершения реакции смесь охлаждают до 0°С, нейтрализуют 1 н. HCl и экстрагируют метиленхлоридом (3 × 50 мл). Объединенные органические фракции сушат над MgSO₄ и упаривают при пониженном давлении, получая при этом соответствующую карбоновую кислоту.

5-Фенил-3-(4-метоксифенил)-2-метоксикарбонил-1Н-пиррол-2-карбоновая кислота: выход, 41% ; т.пл. 198°C (разл.); ИК 3467, 1643 см^-1; ¹H-ЯМР (δ м.д., ДМСО-d₆) 11,72 (с, 1H), 7,88 (д, 2H, J = 7,7 Гц), 7,51 (д, 2H, J = 8,4 Гц), 7,38 (т, 2H, J = 7,6 Гц), 7,26 (т, 1H, J = 7,2 Гц), 6,91 (д, 2H, J = 8,4 Гц), 6,69 (с, 1H), 3,78 (с, 3H), 3,34 (ушир. с, 1H); ¹³C-ЯМР (δ м.д., ДМСО-d₆) 162,5, 157,9, 134,4, 131,3, 131,2, 130,3, 128,6, 127,9, 127,0, 125,1, 119,8, 113,0, 112,9, 109,3, 55,0, 54,9. Анал. вычисл. для С₁₈H₁₅NO₃: C, 73,71; H, 5,15; N, 4,78. Найдено: C, 73,56; H, 5,08; N, 4,81%.

5-Фенил-3-(4-метоксифенил)-4-нитро-1Н-пиррол-2-карбоновая кислота: выход, 28%; т.пл. 190°C; ИК 3437, 1663, 1493 см^-1; ¹H-ЯМР (δ м.д., ДМСО-d₆) 7,57-7,52 (м, 2H), 7,48-7,43 (м, 3H), 7,24 (д, 2H, J = 8,4 Гц), 6,90 (д, 2H, J = 8,4 Гц), 3,79 (с, 3H); ¹³C-ЯМР (δ м.д., ДМСО-d₆) 161,6, 158,3, 133,5, 132,5, 131,1, 129,3, 129,0, 128,0, 124,5, 124,2, 121,1, 112,7, 54,9. Анал. вычисл для C₁₈H₁₄N₂O₅: C, 63,90; H, 4,17; N, 8,28. Найдено: C, 63,85; H, 4,20; N, 8,27%.

Пример 2

Получение 3-фенил-5-(4-метоксифенил)-1Н-пиррол-2-карбоновой кислоты следующей структурной формулы:

и 3-фенил-5-(4-метоксифенил)-4-нитро-1Н-пиррол-2-карбоновой кислоты следующей структурной формулы:

Указанные соединения получают с применением способа, по существу аналогичного способу примера 1, причем соединения заголовка получают в виде желтых твердых веществ.

3-Фенил-5-(4-метоксифенил)-1Н-пиррол-2-карбоновая кислота: выход, 52%; т.пл. 251°C; ИК 3457, 3316, 1618 см^-1; ¹H-ЯМР (δ м.д., ДМСО-d₆) 10,67 (ушир. с, 1H), 7,88 (д, 2H, J = 7,5 Гц), 7,70 (д, 2H, J = 8,5 Гц), 7,23 (т, 2H, J = 7,5 Гц), 7,11 (т, 1H, J = 7,3 Гц), 6,87 (д, 2H, J = 8,5 Гц), 6,52 (с, 1H), 3,74 (с, 3H), 3,38 (ушир. с, 1H); ¹³C-ЯМР (δ м.д., ДМСО-d₆) 166,1, 157,5, 137,1, 129,7, 128,9, 127,9, 126,9, 125,3, 125,2, 124,7, 113,9, 106,4, 54,9; Анал. вычисл. для C₁₈H₁₅NO₃: C, 73,71; H, 5,15; N, 4,78. Найдено: C, 73,48; H, 5,11; N, 4,79%.

3-Фенил-5-(4-метоксифенил)-4-нитро-1Н-пиррол-2-карбоновая кислота: выход 35%; т.пл. 106-107°C; ИК 3407, 1668, 1507, 1351 см^-1; ¹H-ЯМР (δ м.д., CDCl₃) 9,32 (с, 1H), 7,54 (д, 2H, J = 8,6 Гц), 7,42-7,38 (м, 5H), 7,01 (д, 2H, J = 8,6 Гц), 3,88 (с, 3H); ¹³C-ЯМР (δ м.д., CDCl₃) 163,4, 161,1, 135,2, 133,2, 130,8, 130,3, 129,7, 128,7, 128,2, 127,8, 127,6, 120,6, 114,3, 114,2, 55,4; Анал. вычисл. для C₁₈H₁₄N₂O₅: C, 63,90; H, 4,17; N, 8,28. Найдено: C, 63,77; H, 4,19; N, 8,30%.

Пример 3

Получение 5-(4-метоксифенил)-3-(тиофен-2-ил)-1Н-пиррол-2-карбоновой кислоты следующей структурной формулы:

и 5-(4-метоксифенил)-4-нитро-3-(тиофен-2-ил)-1Н-пиррол-2-карбоновой кислоты следующей структурной формулы:

Указанные соединения получают с применением способа, по существу аналогичного способу примера 1, причем соединения заголовка получают в виде желтых твердых веществ.

5-(4-Метоксифенил)-3-(тиофен-2-ил)-1Н-пиррол-2-карбоновая кислота: выход 54%; т.пл. 153-154°C; ИК 3424, 3112, 2964, 1610 см^-1; ¹H-ЯМР (δ м.д., CDCl₃) 8,29, (ушир. с, 1H), 7,41 (д, 2H, J = 8,6 Гц), 7,10 (д, 1H, J = 5,0 Гц), 7,07 (д, 1H, J= 3,1 Гц), 7,02-6,98 (м, 2H), 6,92 (д, 2H, J= 8,6 Гц), 6,58 (с, 1H), 3,82 (с, 3H); ¹³C-ЯМР (δ м.д., CDCl₃) 158,6, 139,2, 133,0, 127,4, 125,3, 121,8, 121,2, 120,4, 114,9, 114,4, 103,5, 71,9, 70,5, 59,0, 55,3; Анал. вычисл. для C₁₆H₁₃NO₃S: C, 64,20; H, 4,38; N, 4,68, найдено: C, 64,11; H, 4,35; N, 4,70%.

5-(4-Метоксифенил)-4-нитро-3-(тиофен-2-ил)-1Н-пиррол-2-карбоновая кислота: ВЫХОД, 28%; т.пл. 180-181°C; ИК 3408, 3120, 1610, 1511 см^-1; ¹H-ЯМР (5 м.д., ДМСО-d₆) 7,54 (d_a, 1H, J = 3,4 Гц), 7,49 (д, 2H, J = 8,3 Гц), 7,03 (ушир. с, 2H), 7,00 (д, 2H, J = 8,2 Гц), 3,81 (с, 3H); ¹³C-ЯМР (8 м.д., ДМСО-d₆) 161,1, 135,1, 133,7, 130,1, 129,3, 127,3, 126,8, 120,1, 114,3, 65,9, 55,4, 15,2; Анал. вычисл. для C₁₆H₁₂N₂O₅S: C, 55,81; H, 3,51; N, 8,14. Найдено: C, 56,09; H, 3,49; N, 8,14%.

Пример 4

Получение 6-(3,5-дифенил-1Н-пиррол-2-карбоксамид)гексановой кислоты следующей структурной формулы:

Раствор 3,5-дифенил-1Н-пиррол-2-карбоновой кислоты (0,39 г, 1,5 ммоль) и хлоргидрата метилового эфира 6-аминогексановой кислоты (0,25 г, 1,5 ммоль) в ДМФА (7,5 мл) охлаждают до 0°С. Последовательно добавляют триэтиламин (1,15 мл, 8,25 моль), 1-гидроксибензотриазол (0,22 г, 1,65 ммоль), хлоргидрат N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида (0,32 г, 1,65 ммоль) и N-метилморфолин (0,165 мл, 1,5 ммоль) и смесь перемешивают при 0°С в течение 2 ч и в течение еще 96 ч при температуре окружающей среды. После этого времени добавляют этилацетат (300 мл) и полученный раствор промывают водой (90 мл), 1 н. Na₂S₂O₃ (90 мл, водный раствор), водой (90 мл), NaHCO₃ (90 мл, насыщенный водный раствор) и NaCl (90 мл, насыщенный водный раствор) и NaCl (90 мл, насыщенный водный раствор), сушат над MgSO₄ и упаривают при пониженном давлении, получая при этом 0,47 г (1,2 ммоль) сложного эфира.

Полученный метиловый сложный эфир растворяют в диметиловом эфире этиленгликоля (6 мл) и раствор охлаждают до 0°С. Затем по каплям добавляют 1 н. раствор LiOH (3,6 мл) и образовавшуюся смесь перемешивают при 0°С. Мониторинг развития реакции проводят тонкослойной хроматографией. После завершения реакции добавляют 3,6 мл 10%-ного водного раствора лимонной кислоты (рН ≈ 6). Раствор экстрагируют метиленхлоридом (3 × 5 мл) и объединенные органические фракции сушат над MgSO₄ и упаривают при пониженном давлении. Неочищенный продукт реакции растирают в диэтиловом эфире, получая при этом 0,42 г белого твердого вещества.

Выход, 74%; т.пл. 228-229°C; ИК 3427, 3246, 1608 см^-1; ¹H-ЯМР (δ м.д., ДМСО-d₆) 13,05 (с, 1H), 8,73 (с, 1H), 7,99 (д, 2H, J = 7,7 Гц), 7,52 (д, 2H, J = 7,5 Гц), 7,36-7,29 (м, 4H), 7,21 (дд, 2H, J = 12,5 Гц, J' = 7,0 Гц), 6,65 (с, 1H), 3,21 (дд, 2H, J = 11,3 Гц, J' = 5,6 Гц), 2,05 (т, 2H, J = 6,6 Гц), 1,54-1,44 (м, 4H), 1,36-1,30 (м, 2H); ¹³C-ЯМР (δ м.д., ДМСО-d₆) 177,5, 160,8, 136,1, 132,7, 131,8, 129,0, 128,5, 128,3, 127,6, 126,5, 125,9, 124,6, 123,3, 108,3, 37,3, 28,8, 26,6, 25,5. Анал. вычисл. для C₂₃H₂₄N₂O₃: C, 73,38; H, 6,43; N, 7,44. Найдено: C, 73,45; H, 6,41; N, 7,44 %.

Пример 5

Получение 6-(4-нитро-3,5-дифенил-1Н-пиррол-2-карбоксамид)гексановой кислоты следующей структурной формулы:

Данное соединение получают с применением способа, по существу аналогичного способу примера 4, причем соединение заголовка получают в виде желтого твердого вещества.

Выход, 71%; т.пл. 153-154°C; ИК 3417, 3155, 1638, 1492 см^-1; ¹H-ЯМР (δ м.д., ДМСО-d₆) 7,58 (д, 2H, J = 7,2 Гц), 7,36 (т, 2H, J = 7,2 Гц), 7,32-7,23 (м, 7H), 4,87 (ушир. с, 2H), 3,07 (дд, 2H, J = 12,9 Гц, J' = 6,6 Гц), 2,09 (т, 2H, J = 7,3 Гц), 1,46-1,40 (м, 2H), 1,35-1,29 (м, 2H), 1,18-1,12 (м, 2H); ¹³C-ЯМР (δ м.д., ДМСО-d₆) 176,0, 161,9, 136,8, 134,4, 133,4, 131,8, 130,1, 129,0, 127,5, 127,4, 127,3, 126,3, 122,8, 71,0, 64,8, 57,9, 38,2, 35,0, 28,8, 26,0, 24,7, 15,1. Анал. вычисл. для C₂₃H₂₃N₃O₅: С, 65,55; Н, 5,50; N, 9,97, найдено: С, 65,37; Н, 5,44; N, 10,01%.

Пример 6

Получение N-(5-(гидроксикарбамоил)пентил-3-фенил-5-(4-метоксифенил)-1Н-пиррол-2-карбоксамида следующей структурной формулы:

К раствору хлоргидрата гидроксиламина (0,26 г, 3,75 ммоль) и фенолфталеина (1 мг) в метаноле (1,25 мл) в атмосфере инертного газа по каплям добавляют аликвоту метоксида натрия в метаноле (получена из раствора 0,65 г, 12,0 ммоль метоксида натрия в 3,3 мл метанола в атмосфере инертного газа) до тех пор, пока не наблюдают постоянный розовый цвет раствора. Последовательно добавляют метил-6-(3-фенил-5-(4-метоксифенил)-1Н-пиррол-2-карбоксамид)гексаноат (0,53 г, 1,25 ммоль), полученный из 3-фенил-5-(4-метоксифенил)-1Н-пиррол-2-карбоновой кислоты и хлоргидрата метилового эфира 6-аминогексановой кислоты согласно способу в примере 4, и метоксид натрия в метаноле (5,0 ммоль, 1,4 мл полученного ранее раствора). Смесь перемешивают в течение 26 ч, наблюдая образование плотного осадка. После этого времени к реакционной смеси добавляют воду (3 мл). Данный раствор подкисляют ледяной уксусной кислотой и экстрагируют метиленхлоридом (3 × 10 мл). Объединенные органические фракции сушат над MgSO₄ и упаривают при пониженном давлении, получая при этом 0,46 г продукта заголовка в виде белого твердого вещества.

Выход, 87%; т.пл. 157-158°C; ИК 3407, 3226, 1663, 1608 см^-1; ¹H-ЯМР (δ м.д., ДМСО-d₆) 11,44 (с, 1H), 10,34 (с, 1H), 8,66 (с, 1H), 7,73 (д, 2H, J = 7,8 Гц), 7,49 (д, 2H, J = 7,7 Гц), 7,36 (т, 2H, J = 7,3 Гц), 7,30 (t_a, 1H, J = 5,1 Гц), 7,26 (т, 2H, J = 7,3 Гц), 6,97 (д, 2H, J = 7,9 Гц), 6,56 (с, 1H), 3,78 (с, 3H), 3,16 (дд, 2H, J =12,0 Гц, J' = 5,9 Гц), 1,93 (т, 2H, J = 7,2 Гц), 1,51-1,45 (м, 2H), 1,43-1,38 (м, 2H), 1,24-1,17 (м, 2H); ¹³C-ЯМР (δ м.д., ДМСО-d₆) 168,9, 160,9, 158,2, 135,7, 132,8, 128,7, 127,9, 127,3, 126,2, 125,9, 124,3, 122,7, 114,0, 107,1, 55,1, 32,1, 28,7, 26,0, 24,8. Анал. вычисл. для C₂₄H₂₇N₃O₄: C, 68,39; H, 6,46; N, 9,97, найдено: C, 68,25; H, 6,42; N, 9,98%.

Пример 7

Получение N-(5-(гидроксикарбамоил)пентил-3-фенил-5-(4-метоксикарбонил)-4-нитро-1Н-пиррол-2-карбоксамида следующей структурной формулы:

Данное соединение получают с применением способа, по существу аналогичного способу примера 6, причем соединение заголовка получают в виде окрашенного в желтый цвет твердого вещества.

Выход, 84%; т.пл. 126-127°C; ИК 3397, 3185, 1668, 1628, 1507, 1356 см^-1; ¹H-ЯМР (δ м.д., ДМСО-d₆) 12,59 (ушир. с, 1H), 10,33 (с, 1H), 8,66 (с, 1H), 7,53 (д, 2H, J = 8,5 Гц), 7,44-7,39 (м, 3H), 7,35 (д, 2H, J = 7,0 Гц), 7,03 (д, 2H, J = 8,5 Гц), 6,71 (t_a, 1H, J = 4,4 Гц), 3,82 (с, 3H), 3,03 (дд, 2H, J = 11,9 Гц, J' = 6,0 Гц), 1,88 (т, 2H, J = 7,3 Гц), 1,40-1,34 (м, 2H), 1,24-1,18 (м, 2H), 1,03-0,96 (м, 2H); ¹³C-ЯМР (δ м.д., ДМСО-d₆) 168,9, 159,9, 159,4, 133,3, 132,0, 131,1, 130,9, 129,9, 128,0, 127,6, 123,3, 121,4, 121,1, 113,5, 55,2, 32,0, 28,4, 25,7, 24,7. Анал. вычисл. для C₂₄H₂₆N₄O₆: C, 61,79; H, 5,62; N, 12,01, найдено: C, 61,71; H, 5,59; N, 12,04%.

С целью более легкого понимания представлений, указанных в этих последних примерах, на схеме 1, которая приведена ниже, показаны различные стадии синтеза, приводящего к получению соединений предыдущих примеров.

Пример 8

Получение N-(5-(гидроксикарбамоил)пентил-3-(4-метоксифенил)-5-фенил-1Н-пиррол-2-карбоксамида следующей структурной формулы:

Данное соединение получают с применением способа, по существу аналогичного способу примера 6, причем соединение заголовка получают в виде окрашенного в бледно-желтый цвет твердого вещества.

Выход, 80%; т.пл. 142°С; ИК 3417, 3256, 1663, 1613, 1547, 1306 см^-1; ¹H-ЯМР (δ м.д., ДМСО-d₆) 12,59 (ушир. с, 1Н), 10,33 (с, 1Н), 8,66 (с, 1Н), 7,53 (д, 2Н, J=8,5 Гц), 7,44-7,39 (м, 3Н), 7,35 (д, 2Н, J=7,0 Гц), 7,03 (д, 2Н, J=8,5 Гц), 6,71 (t_a, 1H, J=4,4 Гц), 3,82 (с, 3Н), 3,03 (дд, 2Н, J=12,43 Гц, J'=6,35 Гц), 1,94 (т, 2Н, J=7,3 Гц), 1,54-1,45 (м, 2Н), 1,45-1,37 (м, 2Н), 1,28-1,16 (м, 2Н); ¹³С-ЯМР (δ м.д., ДМСО-d₆) 169,0, 161,0, 158,0, 132,6, 131,6, 129,9, 128,6, 127,8, 127,2, 126,6, 124,5, 123,1, 113,4, 108,1, 55,0, 32,2, 28,8, 26,1, 24,9. Анал. вычисл. для C₂₄H₂₇N₃O₄: С, 68,39; Н, 6,46; N, 9,97. Найдено: С, 68,27; Н, 6,43; N, 9,99%.

Пример 9

Получение N-(5-(гидроксикарбамоил)пентил-3-(4-метоксифенил)-5-(4-метоксифенил)-4-нитро-1Н-пиррол-2-карбоксамида следующей структурной формулы:

Данное соединение получают с применением способа, по существу аналогичного способу примера 6, причем соединение заголовка получают в виде окрашенного в бледно-желтый цвет твердого вещества.

Выход, 94%; т.пл. 155°C; ИК 3397, 3155, 1638, 1497, 1356 см^-1; ¹H-ЯМР (δ м.д., ДМСО-d₆) 11,59 (с, 1H), 10,34 (с, 1H), 8,68 (с, 1H), 7,63-7,53 (м, 2H,), 7,52-7,41 (м, 3H), 7,29 (д, 2H, J = 8,5 Гц), 6,99 (д, 2H, J = 8,5 Гц), 6,72 (t_a, 1H, J = 4,4 Гц), 3,80 (с, 3H), 3,05 (дд, 2H, J = 12,02 Гц, J'= 6,24 Гц), 1,89 (т, 2H, J = 7,3 Гц), 1,50-1,33 (м, 2H), 1,33-1,16 (м, 2H), 1,14-0,98 (м, 2H); ¹³C-ЯМР (δ м.д., ДМСО-d₆) 168,9, 159,4, 158,8, 133,0, 131,6, 131,2, 129,3, 129,1, 129,0, 128,0, 123,5, 121,0, 113,5, 55,0, 32,0, 28,3, 25,7, 24,6. Анал. вычисл. для C₂₄H₂₆N₄O₆: C, 61,79; H, 5,62; N, 12,01, найдено: C, 61,40; H, 5,77; N, 11,80%.

Пример 10

Получение 4-(4-аминобутил)-1-метилсемикарбазида следующей структурной формулы:

Смесь ди-трет-бутилдикарбоната (10,9 г, 51 ммоль) в метаноле (30 мл) добавляют по каплям к раствору 1,4-диаминобутана (11,12 г, 150 ммоль) в триэтиламине (30 мл, 215 ммоль) и метаноле (300 мл). Образовавшуюся смесь перемешивают при температуре окружающей среды в течение 16 ч. После этого времени триэтиламин и метанол выпаривают при пониженном давлении. Образовавшееся масло растворяют в метиленхлориде (100 мл) и промывают 10% карбонатом натрия (2 × 50 мл, водный раствор). Органическую фазу сушат над MgSO₄ и упаривают при пониженном давлении. Таким образом, получают монозащищенный амин (7,8 г, 41,42 ммоль).

К раствору монозащищенного амина (6 г, 31,86 ммоль) и трифосгена (3,48 г, 11,72 ммоль) в метиленхлориде (438 мл) по каплям при температуре окружающей среды добавляют раствор бикарбоната натрия (18,23 г, 63,72 ммоль) в воде (438 мл). Образовавшуюся двухфазную систему энергично перемешивают в течение 1,5 ч. После этого времени органическую фазу декантируют, сушат над MgSO₄ и упаривают при пониженном давлении. Образовавшееся масло (4,3 г, 20 ммоль) растворяют в метаноле (6,8 мл) и медленно добавляют по каплям при 0°С на другой предварительно полученный раствор метилгидразина (1,1 мл, 20,8 ммоль) и воды (4,05 мл). Смесь перемешивают в течение 45 мин при 0°С. После этого времени осадок отделяют фильтрованием и получают 3,492 г белого твердого вещества, спектроскопические свойства которого были оценены как совместимые со свойствами с 4-(4-трет-бутоксикарбониламинобутил)-1-метилсемикарбазида.

Другой раствор, трифторуксусной кислоты (4,96 мл, 44 ммоль) в метиленхлориде (22 мл), медленно на протяжении 30 мин добавляют к раствору ранее полученного осадка (0,500 г, 1,92 ммоль) в метиленхлориде (27,5 мл) при 0°С. Смесь перемешивают в течение 2 часов. После этого времени добавляют толуол (50 мл) и его выпаривают при пониженном давлении до половины объема, повторяя такой процесс несколько раз. Таким путем получают трифторацетат аммониевой соли (0,720 г, 2,63 ммоль) соединения заголовка.

Выход, 68 %; ИК 3387, 3115, 1673 см^-1; ¹H-ЯМР (δ м.д., ДМСО-d₆) 7,88 (с, 3H), 7,42-7,15 (м, 2H), 3,78-3,64 (м, 1H), 3,58 (с, 3H), 3,16-2,97 (м, 2H), 2,95-2,73 (м, 2H), 1,80-1,38 (м, 4H); ¹³C-ЯМР (δ м.д., ДМСО-d₆) 159,0, 158,6, 158,1, 157,7, 156,7, 51,1, 26,3, 24,3.

Пример 11

Получение 1-(4-(5-(4-метоксифенил)-4-нитро-3-(тиофен-2-ил)-1Н-пиррол-2-карбоксамид)бутил)-3-(2-метиламин)мочевины следующей структурной формулы:

Раствор 5-(4-метоксифенил)-4-нитро-3-(тиофен-2-ил)-1Н-пиррол-2-карбоновой кислоты (0,434 г, 1,25 ммоль) и трифторацетата аммониевой соли 4-(4-аминобутил)-1-метилсемикарбазида (0,345 г, 1,25 ммоль) в ДМФ (6,26 мл) охлаждают до 0°С. Затем последовательно добавляют триэтиламин (0,98 мл, 7,04 ммоль), 1-гидроксибензотриазол (0,210 г, 1,37 ммоль), хлоргидрат N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида (0,263 г, 1,37 ммоль) и N-метилморфолин (0,14 мл, 1,25 ммоль). Образовавшуюся смесь перемешивают в течение 2 ч при 0°С и в течение еще 96 ч при температуре окружающей среды. После этого времени добавляют этилацетат (250 мл) и полученный раствор промывают водой (80 мл), 1 н. Na₂S₂O₃ (80 мл, водный раствор), водой (80 мл), NaHCO₃ (80 мл, насыщенный водный раствор) и NaCl (80 мл, насыщенный водный раствор), сушат над MgSO₄ и упаривают при пониженном давлении, получая при этом 0,400 г (0,82 ммоль) соединения заголовка.

Выход, 65,6% ; т.пл. 185-187°C; ИК 3408, 3161, 1639, 1511 см^-1; ¹H-ЯМР (δ м.д., CDCl₃): 10,4 (с, 1H), 7,56 (дд, 1H, J = 5,5 Гц, J' = 0,8), 7,54 (д, 2H, J = 8,7 Гц), 7,20-7,15 (м, 3H), 6,98 (д, 2H, J = 8,7 Гц), 5,74 (т, 1H, J = 5,2 Гц), 4,66 (с, 1H), 3,86 (с, 4H), 3,67 (с, 3H), 3,13-3,04 (м, 4H), 1,31-1,24 (м, 4H); ¹³C-ЯМР (δ м.д., CDCl₃): 160,7, 159,6, 157,0, 134,6, 132,9, 131,5, 130,9, 129,5, 128,7, 127,6, 123,2, 121,1, 113,9, 113,7, 55,4, 52,1, 40,5, 38,7, 27,0, 26,2. Вычисленный молекулярный ион для C₂₂H₂₆N₆O₅S: m/z 486,14. Найдено: 471,1 (M⁺-Me).

Пример 12

Получение 1-(4-аминометил)-3-(бензилокси)мочевины следующей структурной формулы:

Указанное соединение получают с применением способа, по существу аналогичного способу примера 10, с применением бензилоксиамина вместо метилгидразина. После ранее описанной последовательности добавления для снятия защиты соединение заголовка получают в виде трифторацетата соответствующей аммониевой соли.

Выход, 68%; ИК 3759, 3356, 1648 см^-1; ¹H-ЯМР (δ м.д., ДМСО-d₆) 7,82 (с, 3Н), 7,52-7,28 (м, 7Н), 5,00 (с, 2Н), 3,09-2,92 (м, 2Н), 2,90-2,68 (м, 2Н), 1,68-1,32 (м, 4Н); ¹³С-ЯМР (δ м.д., ДМСО-d₆) 159,6, 158,2, 157,7, 136,4, 128,5, 128,1, 127,8, 77,2, 38,0, 26,6, 24,3, 24,0. Вычисленный молекулярный ион для C₁₃H₂₀N₃O₂: m/z 237,32, найденный 238,0.

Пример 13

Получение 1-(4-(3,5-бис-(3,5-диметоксифенил)-1Н-пиррол-2-карбоксамид)бутил)-3-(бензилокси)мочевины следующей структурной формулы:

Данное соединение получают применением способа, по существу аналогичного способу примера 11, из 3,5-бис-(3,5-диметоксифенил)-1H-пирролкарбоновой кислоты и трифторацетата аммониевой соли 1-(4-аминобутил)-3-(бензилокси)мочевины.

Выход, 81%; ИК 3407, 3216, 1688, 1597 см^-1; ¹H-ЯМР (δ м.д., CDCl₃) 9,87 (с, 1Н), 7,44-7,32 (м, 5Н), 7,13 (с, 1Н), 6,77 (д, 2Н, J=2,0 Гц), 6,62 (д, 2Н, J=2,2 Гц), 6,50 (д, 2Н, J=2,6 Гц), 6,43 (т, 1Н, J=2,0 Гц), 6,03 (т, 1Н, J=5,5 Гц), 5,62 (т, 1Н, J=5,3 Гц), 4,80 (с, 2Н), 3,85 (с, 6Н), 3,82 (с, 6Н), 3,28 (дд, 2Н, J=11,9 Гц, J'= 5,9 Гц), 3,15 (дд, 2H, J = 12,7 Гц, J'= 6,5 Гц), 1,41-1,29 (м, 4H); ¹³C-ЯМР (δ м.д., CDCl₃) 161,2, 160,0, 137,6, 135,4, 134,1, 133,2, 130,8, 129,2, 128,8, 128,7, 127,7, 122,2, 110,0, 107,4, 103,0, 100,0, 99,8, 78,6, 72,3, 10,1, 68,1, 55,4, 39,1, 38,8, 27,1, 26,6. Молекулярный ион, вычисленный для C₃₃H₃₈N₄O₇; m/z 602,68, найденный: 603,2.

Пример 14

Получение 1-(4-(3,5-бис-(3,5-диметоксифенил)-1Н-пиррол-2-карбоксамид)бутил)-3-гидроксимочевины следующей структурной формулы

Получают раствор 1-(4-(3,5-бис-(3,5-диметоксифенил)-1Н-пиррол-2-карбоксамид)бутил)-3-(бензилокси)мочевины (0,200 г, 0,33 ммоль) в этилацетате (66 мл) и этаноле (16,5 мл), к которому добавляют катализатор, 10% Pd-C (0,116 г, 0,11 ммоль). Смесь перемешивают при температуре окружающей среды в потоке водорода в течение 5 часов. После указанного времени образовавшуюся суспензию фильтруют через целит и фильтрат концентрируют при пониженном давлении. Этим путем получают продукт заголовка в виде бесцветного масла.

Выход, 71% ; ИК 3416, 3244, 2948, 1598 см^-1; ¹H-ЯМР (δ м.д., CDCl₃) 10,3 (с, 1H), 6,78 (с, 2Н), 6,60 (д, 2H, J = 1,7 Гц), 6,53-6,44 (м, 2Н), 6,39 (с, 1H), 6,17-6,02 (м, 1H), 4,81 (с, 1H), 3,86-3,78 (м, 13H), 3,34-3,16 (м, 4H), 1,48-1,33 (м, 4Н); ¹³C-ЯМР (δ м.д., CDCl₃) 161,2, 137,6, 134,6, 134,5, 133,3, 128,3, 122,1, 122,0, 109,7, 107,5, 103,3, 99,9, 55,6, 55,5, 39,0, 38,9, 38,7, 27,2, 27,0, 26,8. Вычисленный молекулярный ион для C₂₆H₃₂N₄O₇: m/z 512,55. Найденный: 513,2 (М⁺), 497,1 (М⁺-ОН).

С целью более легкого понимания представлений, указанных в этих последних примерах, на схеме 2, которая приведена ниже, показаны различные стадии синтеза, приводящего к получению соединений, указанных в примерах 10, 11, 12, 13 и 14.

Пример 15

Измерение in vitro ингибирующей способности в отношении активности гистондеацетилазы

С целью лучшей иллюстрации способов, применяемых в настоящем примере и в следующем примере, результаты, полученные с соединениями, указанными на схеме 3, в которую включено производное хирального пирролидина, даны с целью сравнения активности данной циклической системы с рассматриваемыми пирролами настоящего изобретения.

Для определения ингибирующей способности синтезированных соединений в отношении гистондеацетилаз исследование in vitro проводили инкубацией ядерного экстракта клеточных линий НСТ116 и MOLT4 и меченых тритием ацетилированных гистонов при разных концентрациях синтезированных соединений, после чего концентрацию выделенных ацетильных групп измеряли с применением сцинтилляционного счетчика.

Получение ядерного экстракта

Клетки (8 × 10⁶) в суспензии центрифугировали при скорости 800 об./мин в течение 5 мин, промывают PBS и ресуспендируют в 2 мл буфера А (10 мМ Трис, рН 7,5, 15 мМ KCl, 2 мМ MgCl₂, 0,1 мМ EDTA, 2 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 таблетка ингибитора протеазы без EDTA на каждые 50 мл буфера). Добавляли 135 мкл буфера В (50 мМ Трис, 1 М KCl, 30 мМ MgCl₂, 0,1 мМ EDTA, 2 мМ 2-меркатоэтанол), смесь затем центрифугировали при 2,7 × 10³ об./мин при 4°С в течение 5 мин и супернатант удаляли. Осадок после центрифугирования ресуспендировали в 2 мл буфера А и перемешивали 5 раз в гомогенизаторе на 2 мл. Суспензию снова центрифугировали при 7,8 × 10³ об./мин при 4°С в течение 8 мин, осадок после центрифугирования ресуспендировали в 2 мл буфера А и перемешивали 5 раз в гомогенизаторе. В гомогенизатор добавляли 200 мкл сульфата аммония и смесь затем перемешивали в течение 30 мин на роторной мешалке при 4°С. Смесь центрифугировали при 12 × 10³ об./мин при 4°С в течение 10 мин и супернатант диализовали в мембране MWCO 3500 в течение 2 ч при 4°С в 200 мл буфера С (20 мМ Трис, рН 7,5, 10% глицерина, 1 мМ EDTA, 1 мМ 2-меркаптоэтанол, 1,5 мМ MgCl₂, 1 таблетка ингибитора протеазы без EDTA на каждые 50 мл буфера). После указанного времени содержимое мембраны выделяли и применяли для изучения, которое описано ниже.

Измерение in vitro ингибирующей активности соединений

К 30 мкл ядерного экстракта, полученного с применением указанного метода, добавляли 55 мкл буфера С (см. выше), 5 мкл раствора соответствующего ингибитора и 10 мкл меченых тритием гиперацетилированных гистонов и образовавшуюся смесь инкубировали при 37°С в течение 1 ч.

Инкубацию останавливали добавлением 37,5 мкл раствора хлористо-водородной кислоты (конечная концентрация, 1 М) и уксусной кислоты (конечная концентрация 0,4 М). К образовавшейся смеси добавляли 700 мкл этилацетата, смесь центрифугировали при 10000 об./мин в течение 5 мин и, наконец, верхнюю фазу (которая содержала выделенную тритированную уксусную кислоту) применяли для сцинтилляционного счета. Образцы для сцинтилляционного счета получали смешиванием 500 мкл верхней фазы и 5 мл сцинтилляционной жидкости.

Наиболее репрезентативные данные, полученные вышеуказанным методом, показаны на фигурах 1 и 2. Результаты на фигуре 1 соответствуют клеточной линии НСТ116, и результаты фигуры 2 соответствуют клеточной линии MOLT4.

Пример 16

Измерение общей сцинтилляции гистонов

Количественное измерение степени ацетилирования гистонов Н3 и Н4 проводили с применением метода, который описан ниже.

Клеточную линию человека Jurkat (промиелоцитного лейкоза) обрабатывали в течение 24 ч разными концентрациями рассматриваемых соединений, ингибирующих HDAC. После этого времени ядра выделяли добавлением к клеткам RSB-буфера (10 мМ Трис, рН 7,5, 10 мМ хлорид натрия и 3 мМ хлорид магния) с 1% Nonidet-P40 и ингибитором протеазы. Для экстракции гистонов к ядрам добавляли 0,25 М хлористо-водородную кислоту и смесь перемешивали в течение 16 ч при 4°С. Затем гистоны осаждали добавлением 8 объемов ацетона. Полученную смесь гистонов разделяли с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с обращенной фазой на колонке С18 с градиентом ацетонитрила (20-60%) в 0,3% трифторуксусной кислоты.

Разделение неацилированных, моно-, ди-, три- и тетраацетилированных производных каждой фракции гистонов Н3 и Н4 проводили с применением высокоэффективного капиллярного электрофореза (НРСЕ) с капилляром диоксида кремния (60,2 см × 75 мкм, эффективная длина 50 см). Применяемыми условиями элюирования были: 25°С, напряжение 12 кВ, детектор абсорбции при 214 нм и буфер элюирования 110 мМ фосфат (рН 2,0) и НРМ-целлюлоза (0,03% мас./об.).

Перед каждым вводом систему промывали в течение 3 мин 0,1 М NaOH с последующим другим промыванием 0,5 М H₂SO₄ в течение 2 мин и уравновешивали буфером для элюирования в течение 3 мин. Промывающие буферы и растворы получали с применением воды Milli-Q, фильтрованной через поры с размером 0,45 мкм. Образцы вводили под давлением 0,3 фунт/кв. дюйм в течение 3 сек. Все образцы анализировали в двух повторностях.

Некоторые репрезентативные данные, полученные с различными рассматриваемыми соединениями настоящего изобретения, показаны на фигуре 3.

Пример 17

Измерение индуцирования апоптоза

Определение количества апоптотических клеток проводили изучением изменения в проницаемости цитоплазматической мембраны с применением проточного цитометрического анализа и с применением коммерческого набора YoPro© в качестве окрашивающего агента. Применяемый метод описывается ниже. Клетки линий НСТ116 и HL60 человека (10⁶ клеток на обработку) обрабатывали различными концентрациями рассматриваемых соединений-ингибиторов HDAC настоящего изобретения в течение 24 ч. После этого периода клетки промывали дважды холодным PBS 1X, ресуспендировали в 1 мл PBS 1X и 1 мкл YoPro© и добавляли 1 мкл иодида пропидия. Смесь инкубировали на льду при защите от света в течение 30 мин. Количество апоптотических клеток измеряли с применением проточной цитометрии.

Наиболее репрезентативные данные показаны на фигурах 4 и 5. Данные, соответствующие модели карциномы толстой кишки НСТ116 человека, представлены на фигуре 4. Данные, соответствующие модели острого миелоидного лейкоза НL60 человека, представлены на фигуре 5.

Пример 18

Измерение биологической активности in vivo

С целью определения действия некоторых описанных соединений на рост опухоли in vivo проводили исследования с применением самок «голых мышей» возраста 6 недель без вилочковой железы (Harlam Sprague Dawley, Indianapolis, IN, USA). Для исследования 2×10⁶ клеток линии НСТ116 (карциномы толстой кишки человека) и 10⁷ клеток MOLT4 (Т-клеток острого лимфобластного лейкоза человека), ресуспендированных в PBS, инокулировали подкожно при конечном объема инокуляции 200 мкл/животное. Когда опухоли достигали среднего объема 100 мм³, каждой мыши вводили суточную дозу 200 мкл 20 мкМ раствора соответствующего соединения внутрибрюшинной инъекцией (10 мг/кг массы). Контрольной группе мышей вводили 200 мкл PBS для имитации стресса инокуляции. Мышей взвешивали каждые 24 ч и объем опухоли измеряли с применением калибрированного миллиметрового устройства для измерения, предполагая сферическую геометрию для опухолей (объем = d³× π/6). Когда объем опухоли достигал 1-1,5 см³ (Ethical-Humanitarian Human End Point), мышей умерщвляли и опухоли извлекали и взвешивали.

Наиболее репрезентативные данные показаны на фигурах 7 и 8. Данные, относящиеся к модели карциномы НСТ116 толстой кишки человека, представлены на фигуре 7. На фигуре 8 представлены данные, относящиеся к модели фибробластного лейкоза MOLT4 человека.

Изобретение относится к новым производным пиррола, формулы I:

где: R¹ и R³ независимо означают Ph; моно- или дизамещенный в разных положениях кольца Ph, где заместитель означает -ОСН₃; С5-гетероарил с одним гетероатомом, выбранным из О или S;

R² означает Н, NO₂, NH₂, С(O)NH₂; R⁴ означает Н, линейный или разветвленный C1-С6-алкил; n равно числу метиленовых групп между 1 и 8 включительно; Х означает О, S, NH; Y NH, -СН₂-; Z означает О, S; W означает

-ОН, гидроксиамина, гидразина, алкилгидразина. Соединения обладают действием ингибировать гистондеацетилазу, что позволяет использовать их при лечении рака. Описаны способы получения соединений. 7 н. и 3 з.п. ф-лы, 7 ил.

1. Производное пиррола общей формулы I

где R¹ и R³ независимо представляют собой фенильный радикал; моно- или дизамещенный в разных положениях кольца фенил, где заместитель представляет собой метоксигруппу; или С₅-гетероарильную группу, которая содержит один гетероатом из О или S;
R² представляет собой атом водорода или электронпритягивающую группу, такую как нитрогруппа или амино- или амидогруппу;
R⁴ представляет собой атом водорода или неразветвленную или разветвленную C₁-С₆-алкильную группу;
n равно числу метиленовых групп между 1 и 8 включительно;
Х представляет собой либо вторичную аминогруппу, либо атом кислорода или атом серы;
Y представляет собой группу, выбранную из метилена, и вторичного амина;
Z представляет собой либо атом кислорода, либо атом серы и
W представляет собой группу, выбранную из гидроксила, гидроксиамина, гидразина и алкилгидразина.

2. Производное пиррола общей формулы I по п.1, выбранное из
[1] 6-(3,5-дифенил-1Н-пиррол-2-карбоксамид)гексановой кислоты следующей структурной формулы:

[2] 6-(4-нитро-3,5-дифенил-1Н-пиррол-2-карбоксамид)гексановой кислоты следующей структурной формулы:

[3] N-(5-(гидроксикарбамоил)пентил)-5-фенил-3-(4-метоксифенил)-1Н-пиррол-2-карбоксамида следующей структурной формулы:

[4] N-(5-(гидроксикарбамоил)пентил)-3-фенил-5-(4-метоксифенил)-1Н-пиррол-2-карбоксамида следующей структурной формулы:

[5] N-(5-(гидроксикарбамоил)пентил)-3-фенил-5-(4-метоксифенил)-4-нитро-1Н-пиррол-2-карбоксамида следующей структурной формулы:

[6] 1-(4-(3,5-бис-(3,5-диметоксифенил)-1Н-пиррол-2-карбоксамид)бутил)-3-гидроксимочевины следующей структурной формулы:

[7] 1-(4-(5-(4-метоксифенил)-4-нитро-3-(тиофен-2-ил)-1Н-пиррол-2-карбоксамид)бутил)-3-(2-метиламино)мочевины следующей структурной формулы:

[8] N-(5-гидроксикарбамоил)пентил-3,5-дифенил-4-нитро-1Н-пиррол-2-карбоксамид следующей формулы:

3. Способ получения соединений общей формулы (Ia):

где R₁, R₂, R₃, R₄, Х и n имеют значения, указанные выше, который включает в себя реакцию смеси, состоящей из
а) 1Н-пиррол-2-карбоновой кислоты формулы II

b) соединения формулы III

где R⁵ представляет собой алкоксикарбонил,
c) реагента для активации карбоксильной группы и
d) третичного амина, выбранного из циклических или ациклических алифатических аминов с 3-10 атомами углерода и алканароматических аминов с 9-15 атомами углерода,
и реакцию полученного продукта со смесью гидроксида лития или натрия, диметоксиэтана и воды.

4. Способ получения соединений общей формулы (Ib):

где R₁, R₂, R₃, R₄, X и n имеют значения, указанные выше, включающий в себя реакцию смеси, состоящей из
а) 1Н-пиррол-2-карбоновой кислоты формулы II

b) соединения формулы III

где R⁵ представляет собой алкоксикарбонил,
c) реагента для активации карбоксильной группы и
d) третичного амина, выбранного из циклических или ациклических алифатических аминов с 3-10 атомами углерода и алканароматических аминов с 9-15 атомами углерода,
и добавление образовавшегося продукта на смесь хлоргидрата гидроксиламина и фенолфталеина в присутствии избытка метоксида натрия в метаноле.

5. Способ получения соединений общей формулы (Ic):

где R₁, R₂, R₃, R₄, X, Z и n имеют значения, указанные выше, включающий реакцию смеси, состоящей из
а) 1Н-пиррол-2-карбоновой кислоты формулы II

b) соединения формулы

c) реагента для активации карбоксильной группы и
d) третичного амина, выбранного из циклических или ациклических алифатических аминов с 3-10 атомами углерода и алканароматических аминов с 9-15 атомами углерода, и гидрогенолиз полученного на предыдущей стадии.

6. Способ получения соединений общей формулы (Id):

где R₁, R₂, R₃, R₄, X, Z и n имеют значения, указанные выше, и R₆ представляет собой C₁-С₆-алкил, включающий реакцию смеси, состоящей из
а) 1H-пиррол-2-карбоновой кислоты формулы II

b) соединения формулы III

где R⁵ представляет собой 1-C₁-С₆-алкилсемикарбазид,
c) реагента для активации карбоксильной группы и
d) третичного амина, выбранного из циклических или ациклических алифатических аминов с 3-10 атомами углерода и алканароматических аминов с 9-15 атомами углерода.

7. Производное пиррола по п.1 для применения его при лечении рака.

8. Производное пиррола по п.2 для его применения при лечении рака.

9. Применение производных пиррола по п.1 или 2 для изготовления лекарственного средства для лечения рака.

10. Фармацевтическая композиция, обладающая действием ингибировать гистондеацетилазу, включающая в себя соединение по п.1 или 2 и, по меньшей мере, фармацевтически приемлемый эксципиент.