СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИПРОФЛОКСАЦИНА В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/15 

Изобретение относится к высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флуориметрическим детектором с использованием организованных сред, позволяющих более чем в 8 раз понизить предел обнаружения ципрофлоксацина в лекарственных препаратах и может быть использовано в анализе многокомпонентных лекарственных препаратов в практике контрольно-аналитических лабораторий фармацевтических предприятий и аптечной сети.

Ципрофлоксацин относится к группе фторхинолонов производных 4-хинолон-3-карбоновой кислоты и широко используется в клинической практике. Известны различные методы определения ципрофлоксацина и других антибиотиков группы фторхинолонов: микробиологические, например, диффузии в агар, спектрофотометрические, хроматографические, например высокоэффективная жидкостная хроматография.

Фармакопейный метод [Фирсов А.А., Алексеева M.Е., Кулешов С.У. // Хим.-фарм. журн. 1995. №3. С.24] определения основан на микробиологическом тесте, включающем диффузию антибиотика в агар (питательную среду) и сравнение угнетения роста тест-микроорганизма определенными концентрациями испытуемого препарата со стандартами антибиотика. Минимальная определяемая концентрация составляет 0.05 мкг/мл. Микробиологические способы широко распространены, просты и не требуют дорогостоящего оборудования. Кроме того, они обеспечивают удовлетворительную чувствительность и точность при терапевтических концентрациях фторхинолонов в исследуемых средах.

Однако они характеризуются длительностью анализа, зависимостью аналитического сигнала от свойств антибиотика (его растворимости, молярной массы и т.п.), не связанных с его активностью, чувствительностью тест-культур к качеству агара, используемого в способе.

Спектрофотометрический метод определения основан на образовании комплексов с ионами Сu²⁺ или Fe³⁺ [Kapetanovic V., Milovanovic I., Erceg M. / / Talanta. 1996. V.43. Р.2123.; Mathur S.C., Kumar Y., Murugesan N. // Indian Drugs. 1992. V.29. P.376], а также ионных ассоциатов с органическими реагентами ряда сульфофталеина [Tosunoglu S., Savci N. // Acta Pharm. Turc. 1993. V.35. P.1; Anal. Abstr. 1994. V.56. 3 G 49]. Этот метод определяет от 3 до 25 мг/мл ципрофлоксацина, невысокая чувствительность и низкая избирательность являются недостатком указанного метода, а в экстракционном варианте - необходимо использование токсичных органических растворителей.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению относится метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для определения ципрофлоксацина в коровьем молоке [Tyczkowska K.L., Voyksner R.D., Anderson K.L. //J.Chromatogr. B. 1994. V.658. P.341] с помощью фотодиодного детектора.

К недостаткам метода можно отнести продолжительность определения (время разделения 15-20 мин), а также использование в качестве подвижной фазы высокотоксичного метанола.

Задачей изобретения является понижение предела обнаружения и расширение спектра исследуемых объектов - смеси антибиотиков группы фторхинолонов, хинолонов и тетрациклинов, например, в лекарственных формах, а также функциональных возможностей способа за счет использования организованных сред циклодекстринов, позволяющих модифицировать подвижную фазу и повысить интенсивность аналитического сигнала антибиотика при образовании комплекса включения состава антибиотик:γ-циклодекстрин 1:1.

Технический результат заключается в повышении чувствительности обнаружения при уменьшении времени, необходимого для анализа, и снижении токсичности.

Поставленная задача решается тем, что в способе количественного определения ципрофлоксацина в лекарственных препаратах, заключающемся в приготовлении двух одинакового объема проб разбавленного испытуемого раствора, добавляют реагент - γ-циклодекстрин и в одну из проб вводят стандартную добавку ципрофлоксацина, последовательно анализируют на жидкостном хроматографе с флуоресцентным детектором и обращено-фазовой хроматографической колонкой в изократическом режиме, используя в качестве подвижной фазы смесь ацетонитрил: ацетатно-аммиачный буфер (43:57 об./об., рН 4.3). Время удерживания ципрофлоксацина 2 мин. Расчет концентрации производят но формуле

C_x=C_ст·S₁/S₂-S₁,

где С_ст - стандартная добавка ципрофлоксацина мг/мл;

S₁ - площадь пика ципрофлоксацина в исследуемом растворе;

S₂ - площадь пика ципрофлоксацина в исследуемом растворе со стандартной добавкой;

С_x - искомая концентрация ципрофлоксацина в лекарственном препарате мг/мл.

Добавление указанного peaгента вызывает образование комплекса включения состава антибиотик:γ-циклодексирин 1:1. Это понижает предел обнаружения искомого вещества.

Исходный раствор ципрофлоксацина 0,25 мг/мл готовили растворением 0,0125 г его порошка, с содержанием основного вещества не менее 98% в 50 мл дистиллированной воды. Раствор γ-циклодексирина концентрации 1·10^-2 М приготовлен растворением в 25 мл дистиллированной воды 0.0324 г сухого вещества, содержащего не менее 98% основное компонента. Реакцию проводят в среде ацетатно-аммиачного буферного раствора в слабокислой среде с рH 4-5. Для построения градировочною графика в каждую из восьми пробирок вносили 1 мл ацетатно-аммиачного буферного раствора. 0.25 мл 5·10^-5 М γ-циклодексирина, затем различные объемы исходного раствора ципрофлоксацина в диапазоне концентраций от 0.10-100 мкг/мл, разбавляли буферным раствором до общего объема 5 мл и из каждой пробирки отбирали аликвоту 50 мкл, которую вводили в хроматограф. В качестве подвижной фазы используют смесь ацетонитрил:ацетатно-аммиачный буфер (43:57 об./об., рН 4,3), время удерживания ципрофлоксацина 2 мин. Градуировочный график строили в координатах площадь пика - концентрация ципрофлоксацина. В таблице 1 представлены некоторые метрологические характеристики определения ципрофлоксацина.

Таблица 1
Метрологические характеристики определения ципрофлоксацина в отсутствии и присутствии γ-циклодекстрина Определяемый компонент Реагент Диапазон определяемых концентраций, мкг/мл ПрО, мкг/мл Уравнение градуировочного графика r² Ципрофлоксацин - 2,5-100 1,7 y=17,6x+80,6 0,998   γ-циклодекстрин 0,25-75 0,2 y=28,5x+64,5 0,997 Ципрофлоксацин на фоне антибиотиков - 2,5-100 1,4 y=15,4x+220 0,996   γ-циклодекстрин 0,25-75 0,2 y=26,6x+64.5 0,997

Как видно из таблицы, предел обнаружения ципрофлоксацина в присутствии γ-циклодекстрина понижается более чем в 8 раз.

Время удерживания составляет 2 мин, что сокращает время анализа. Кроме этого вместо токсичного растворителя метанола используется менее токсичный ацетонитрил.

Определение ЦФ в лекарственных препаратах. Разработанная методика апробирована на дозированных лекарственных препаратах, содержащих ципрофлоксацин - глазных каплях различного производства: «Ципролет» фирмы Dr.Reddy's laboratories (Индия), «Ципрофлоксацин» АКОС Синтез (г.Курган), «Ципромед» Promed Exports (Индия). Кроме определяемого ципрофлоксацина, лекарственный препарат содержит вспомогательные вещества: этилендиаминтетрауксусную кислоту, маннитол, ацетат натрия, уксусную кислоту.

Методика определения.

Исследуемый раствор глазных капель разбавляют в 25 раз. Из полученного раствора отбирают в пробирку аликвоту 0.2 мл, добавляют 0.25 мл 5·10^-3 М γ-циклодекстрин и разбавляют до общего объема 5 мл ацетатно-аммиачным буферным раствором рН 4.3. Аликвоту полученного раствора 50 мкл вводят в хроматограф, измеряют площадь хроматографического пика ципрофлоксацина и по градуировочному графику определяют содержание ципрофлоксацина в лекарственных препаратах.

Возможен второй вариант реализации. Исследуемый раствор глазных капель разбавляют в 25 раз. Из полученного раствора отбирают в две пробирки одинаковые аликвоты 0.2 мл, добавляют в каждую 0.25 мл 5·10^-3 М γ-циклодекстрина и в одну из них стандартную добавку ципрофлоксацина (20-30 мкг/мл), растворы разбавляют до общего объема 5 мл ацетатно-аммиачным буферным раствором рН 4. Аликвоты полученных растворов 50 мкл последовательно вводят в хроматограф, измеряют площади хроматографических пиков ципрофлоксацина для обеих проб и по расчетной формуле определяют содержание ципрофлоксацина в лекарственных препаратах

C_x=25·C_ст·S₁/S₂-S₁,

где С_ст - стандартная добавка ципрофлоксацина мг/мл;

S₁ - площадь пика ципрофлоксацина в исследуемом растворе;

S₂ - площадь пика ципрофлоксацина в исследуемом растворе со стандартной добавкой;

C_x - искомая концентрация ципрофлоксацина в лекарственном препарате мг/мл.

Результаты определения представлены в таблице 2.

Таблица 2 Результаты определения ципрофлоксацина в лекарственных препаратах глазных капель* (n=5, Р 0,95) Препарат Найдено, мг/мл S_r «Ципролет», Индия 2.62±0.07 0.03 «Ципрофлоксацин», Курган 2.49±0.15 0.06 «Ципpoмeд», Индия 2.29±0.05 0.02

где S_r - относительное стандартное отклонение, S_r S/χ, где S - стандартное отклонение, равное S=∑(χ_i-χ)²/n-1)^Ѕ, χ_i - единичный результат определения, χ - средний результат, ^* - указанное производителем содержание ЦФ - 3 мг/мл.

Контроль правильности определения осуществляли методом стандартных добавок.

Погрешность определения не превышает 0.06.

Предлагаемый способ может быть использован для определения ципрофлоксацина в присутствии других антибиотиков - окситетрациклина, тетрациклина, налидиксовой кислоты и флюмеквина. Рeзультaты определения, время удерживания оказанных антибиотиков и характеристики их хроматографического разделения представлены в таблице 3.

Taблицa 3
Количественные хроматографические характеристики антибиотиков в присутствии γ-ЦД Антибиотик Время удерживания, мин Площадь пика R_S α К' N ФТОРХИНОЛОНЫ ЦФ 2,0 810,0 2,4 1,7 1,0 6,30·10³ ФЛ 12,8 47,25 11,9 11,6 5,3 1,22·10³ ТЕТРАЦИКЛИНЫ ТТ 2,7 6,90 2,4 1,7 1,7 1,13·10³ ОТТ 6,2 642,7 5,2 5,3 2,8 2,96·10³ ХИНОЛОНЫ НК 3,8 534,3 4,8 2,8 12 1,54·10³

R_S - разрешение пиков, R_S=(t_R2-t_R1)/{(w₁+w₂)/2}, где t_R2, t_R1 - время удерживания двух соседних пиков, w₁, w₂ - ширина пиков, измеренная при основаниях;

α - коэффициент селективности, α=(t_R-t_m)₁/(t_R-t_m)₂, где t_R - время удерживания антибиотика, t_m - время пребывания антибиотика в подвижной фазе;

К' - фактор удерживания, (t_R-t_m)/t_m), где t_R - время удерживания антибиотка, t_m - время пребывания антибиотика в подвижной фазе;

N - число теоретических тарелок, N=16(t_R/W)², t_R - удерживания, W - ширина пика у основания.

В качестве подвижной фазы используют подвижную фазу - смесь ацетонитрил: ацетатно-аммиачный буфер в соотношениях 43:57 об./об., рН=4.3.

Правильность методики оценивали по результатам анализа модельных растворов, содержащих смесь антибиотиков, по методу «введено-найдено». Для приготовления модельных растворов в каждую из десяти пробирок вносили 1 мл ацетатно-аммиачного буферного раствора с рН 4.3, затем последовательно добавляли 0.25 мл 10^-3 М γ-ЦД, 0.6-2.1 мл ЦФ с концентрацией от 0,10-100 мкг/мл, затем добавляли антибиотики в концентрации 50 мкг/мл и разбавляли буферным раствором до общего объема 5 мл. Из каждого раствора отбирали аликвоту 50 мкл и вводили ее в хроматограф. Характеристики хроматографического разделения антибиотиков представлены в таблице 3. Как видно из таблицы, предел обнаружения ципрофлоксацина на фоне других антибиотиков в присутствии γ-циклодекстрина понижается в 6.8 раз. Погрешность определения составляет не более 0.06.

Изобретение относится к области медицинских определений с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Способ количественного определения ципрофлоксацина в лекарственных препаратах методом обращенно-фазочной ВЭЖХ в изократическом режиме с флуориметрическим детектором заключается в приготовлении двух проб одинакового объема разбавленного испытуемого раствора, в одну из которых вводят стандартную добавку ципрофлоксацина, к каждому раствору добавляют реагент - γ-циклодекстрин, анализируют на хроматографе, используя в качестве подвижной фазы смесь ацетонитрил: ацетатно-аммиачный буфер (43:57 об./об., рН 4.3), измеряют площадь хроматографических пиков и на основе сравнения измеренных параметров по расчетной формуле определяют концентрации антибиотика. Изобретение позволяет более чем в 8 раз понизить предел обнаружения ципрофлоксацина в лекарственных препаратах. 3 табл.

Способ определения ципрофлоксацина в лекарственных препаратах методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в изократическом режиме с флуориметрическим детектором, заключающийся в приготовлении двух проб одинакового объема разбавленного испытуемого раствора, в одну из которых вводят стандартную добавку ципрофлоксацина, отличающийся тем, что к каждому раствору добавляют реагент - γ-циклодекстрин, анализируют на хроматографе, используя в качестве подвижной фазы смесь анетонитрил: ацетатно-аммиачный буфер (43:57 об./об., рН 4.3), измеряют площадь хроматографических пиков и на основе сравнения измеренных параметров по расчетной формуле определяют концентрации антибиотика.