СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИПРОФЛОКСАЦИНА МЕТОДОМ ОБРАЩЕННО-ФАЗНОЙ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ Российский патент 2021 года по МПК G01N30/62 G01N33/15 C07D401/04 

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано в контрольно-аналитических, клинических лабораториях для определения концентрации ципрофлоксацина для стандартизации и контроля качества лекарственных средств, для определения антибиотиков в образцах биологического происхождения с целью изучения фармакодинамики, лекарственного мониторинга для регулирования введения оптимальных доз антибиотиков при лечении различных инфекционных заболеваний.

Известно, что основными методами качественного и количественного анализа препаратов группы фторхинолонов являются ИК-спектроскопия [1], ЯМР 1Н-спектроскопии [2], электрохимические и химические методы [3], хроматография в тонком слое сорбента (ТСХ и ВЭТСХ) [4], капиллярный электрофорез [5].

Предложен способ определения фторхинолонов флуориметрическим методом в лекарственных препаратах и плазме крови с предварительным концентрированием на магнитных наночастицах, модифицированных катионами цетилтриметиламмоний бромида [6].

Одним из широко используемых методов качественного и количественного определения антибиотиков в фармацевтических препаратах и биологических жидкостях является высокоэффективная жидкостная хроматография в обращенно-фазном режиме. Метод отличается селективностью, точностью и воспроизводимостью, а также высоким уровнем автоматизации.

Количественное определение фторхинолонов в виде субстанций, лекарственных форм, а также в биологических объектах проводят методами высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с различными способами детектирования - спектрофотометрическим [7, 8], флюориметрическим [9], масс-спектрометрическим [10].

Известен способ определения ципрофлоксацина в фармацевтических препаратах и сыворотке крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием хроматографической колонки размером 250×4 мм, заполненной сорбентом С8 с размером частиц 5 мкм, в качестве подвижной фазы использовали смесь раствора ацетанитрила, метилового спирта и 0,4М лимонной кислоты в соотношении 7:15:78 (об/об). Детекцию сигнала проводили при 275 нм. Предел обнаружения ципрофлоксацина составлял 0,01 нг/мл, предел определения 5 нг/мл, время удерживания 8,566 мин. К недостаткам этого метода можно отнести использование токсичного вещества - метилового спирта в составе подвижной фазы [11].

Описан способ определения ципрофлоксацина гидрохлорида в фармацевтических лекарственных формах в присутствии его примесей методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием УФ-детектора с диодной матрицей. Анализ проводили в изократическом режиме на колонке размером 250 × 4,6 мм, заполненной сорбентом С8 с размером частиц 5 мкм, для подвижной фазы брали смесь из ацетонитрила и фосфорной кислоты с соотношении 87:13 (об/об). Предел обнаружения ципрофлоксацина гидрохлорида составлял 5,159 мкг/мл, предел определения 15,632 мкг/мл. Недостатком метода являются относительно низкая чувствительность в данных хроматографических условиях [12].

Известен способ количественного определения ципрофлоксацина в биоматериале методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуоресцентным детектированием. В работе использовали аналитическую колонку размером 150 мм × 2,1 мм, которая была заполнена сорбентом С18 с размером гранул 3,5 мкм, предколонка (7,5 мм × 2,1 мм) содержала сорбент С18 с размером частиц 5 мкм. Анализ проводили в режиме градиентного элюирования с использованием двух подвижных фаз. Элюент А (рН 3,5) состоял из смеси растворов ацетонитрила, метилового спирта, 0,025 М раствора тетрабутиламмоний хлорида и трифторуксусной кислоты в соотношении 75:25:899:1 (об/об), для элюента В (рН 3,5) соотношение компонентов соответствовало 150:50:799:1 (об/об). Данный способ позволяет проводить количественное определение ципрофлоксацина только в диапазоне от 0,02 до 7,50 мкг/мл [13].

Целью предлагаемого изобретения является разработка способа определения ципрофлоксацина методом обращенно-фазной высокоэффективной хроматографии.

Технический результат предлагаемого изобретения достигается путем использования в хроматографической системе колонки размером 250×3 мм, заполненной сорбентом С18 с размером частиц 5 мкм, в качестве подвижной фазы используют смесь раствора дигидрофосфата натрия (рН=2,15) с ацетонитрилом в соотношении 85:15 (об/об), а детекция сигнала осуществляется в одноканальном или многоканальном режимах диодно-матричного детектора.

Использование в качестве неподвижной фазы хроматографической колонки размером 250×3 мм, заполненной сорбентом С18 с размером частиц 5 мкм, позволяет получить эффективное разделение ципрофлоксацина с примесными соединениями в пробе. Меньший внутренний диаметр колонки позволяет уменьшить расход подвижной фазы с сохранением эффективности, а большая гидрофобность сорбента С18 по сравнению с С8 обеспечивает большее удерживание ципрофлоксацина, что повышает разрешающую способность метода.

Применения в качестве подвижной фазы смеси 0,025 М раствора дигидрофосфата натрия (рН=2,15) с ацетонитрилом в соотношении 85:15 (об/об) позволяет достигнуть высокой симметрии и остроты пиков за счет высокой буферной емкости фосфатного буфера при рН=2,15.

На фиг. 1, дан способ определения ципрофлоксацина методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии, калибровочная кривая ципрофлоксацина.

Способ осуществляется следующим образом.

Исследуемый образец растворяется в смеси 0,025 М раствора дигидрофосфата натрия (рН=2,15) с ацетонитрилом в соотношении 85:15 (об/об), фильтруется через 0,2 мкм фильтр и анализируется на приборе «Ultimate 3000» Dionex с диодно-матричным детектором, хроматографической колонкой размером 250×3 мм, заполненной сорбентом С18 с размером частиц 5 мкм. Режим элюирования изократический, с использованием в качестве подвижной фазы смеси 0,025 М раствора дигидрофосфата натрия (рН=2,15) с ацетонитрилом в соотношении 85:15 (об/об), температура термостата колонки 25°С, объем вводимой пробы 10 мкл. Проводится не менее пяти измерений для каждого раствора.

Концентрацию ципрофлоксацина определяли с использованием предварительно построенной калибровочной кривой зависимости площади пика аналита от концентрации (фиг. 1).

Возможность практического применения заявленного способа подтверждается примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.

Пример 1.

200 мкл раствора ципрофлоксацина смешивается с 800 мкл смеси 0,025 М раствора дигидрофосфата натрия (рН=2,15) с ацетонитрилом в соотношении 85:15 (об/об), фильтруется через 0,2 мкм фильтр и анализируется на приборе «Ultimate 3000» Dionex с диодно-матричным детектором при длине волны 280 нм, хроматографической колонкой размером 250×3 мм, заполненной сорбентом С18 с размером частиц 5 мкм. Режим элюирования изократический, с использованием в качестве подвижной фазы смеси 0,025 М раствора дигидрофосфата натрия (рН=2,15) с ацетонитрилом в соотношении 85:15 (об/об), температура термостата колонки 25°С, объем вводимой пробы 10 мкл. Проводится не менее пяти измерений для каждого раствора.

Предел обнаружения ципрофлоксацина составляет 7,21 нг/мл, предел определения 24,033 нг/мл, время удерживания 9,12±0,14 мин.

Пример 2.

Отличается от примера 1 тем, что детекция сигнала осуществляется в многоканальном режиме, с дальнейшей обработкой данных, полученных диодно-матричным детектором в диапазоне 200-600 нм методом MCR ALS (Multivariate Curve Resolution Alternating Least Squares - разрешение многомерных кривых методом чередующихся наименьших квадратов). Обработку трехмерных данных (time×mAU×λ) проводили с использованием пакета «ALSace» v. 1.22.0 [14] в среде языка R v. 3.6.3 [15].

Предел обнаружения ципрофлоксацина составляет 5,183 нг/мл, предел определения 17,277 нг/мл, время удерживания 9,12±0,14 мин.

Используемая литература

1. Sivasubramanian L., Shankar V. K., Sivaraman V. et al. Visible spectrophotometric determination of levofloxacin in tablet dosage forms//Indian Journal of Pharmaceutical Sciences. - 2004. - V. 66, №6. - P. 799-802.

2. Michaleas S., Antoniadou-Vyza E. A new approach to quantitative NMR: Fluoroquinolones analysis by evaluating the chemical shift displacements // J. Pharm. Biomed. Anal. - 2006. - V. 42, №4. - P. 405-410

3. Al-Ghannam, S.M. Atomic absorption spectroscopic, conductometric and colorimetric methods for determination of some fluoroquinolone antibacterials using ammonium reineckate // Spectrochim. Acta, Part A. Mol. Biomol. Spectrosc. - 2008. - V. 69, №4. - P. 1188-1194.

4. Salama F., El-Abasawi N., El-Olemy A., Hasan M., Kamel M. Application of High-Performance Thin-layer Chromatographic Method for Simultaneous Determination of Co-formulated Ofloxacin and Racecadotril in their Oral Dosage Form // Journal of Advanced Pharmacy Research. - 2020. - V. 4(1). - P. 25-32.

5. Herrera-Herrera A.V., Hernandez-Borges J., Borges-Miquel T.M., Rodriguez-Delgado M.A. Dispersive liquid-liquid microextraction combined with nonaqueous capillary electrophoresis for the determination of fluoroquinolone antibiotics in waters // Electrophoresis. - 2010. - V. 31, №20. - P. 3457-3465.

6. Egunova, O.R., Reshetnikova, I.S., Kazimirova, K.O. et al. Magnetic Solid-Phase Extraction and Fluorimetric Determination of Some Fluoroquinolones. J Anal Chem.-2020.-V. 75.-P. 24-33. doi.org/10.1134/S1061934820010062

7. Samanidou V. F., Demetriou С.E., Papadoyannis I. N. Direct determination of four fluoroquinolones, enoxacin, norfloxacin, ofloxacin and ciprofloxacin, in pharmaceuticals and blood serum by HPLC // Anal. Bioanal. Chem. - 2003. - V. 375, №5.-P. 623-629.

8. Tozo G.L., Salgado H.R. Determination of lomefloxacin in tablet preparations by liquid chromatography // Journal of AOAC International. - 2006. -V. 89, №5.-P. 1305-130.

9. Laban-Djurdjevic A., Jelikic-Stankov M., Djurdjevic P. Optimization and validation of the direct HPLC method for the determination of moxifloxacin in plasma // J. Chromatogr. B. - 2006. - V. 844, №1. - P. 104-111.

10. Maia A.S., Paiga P., Delerue-Matos C., Castro P.M., Tiritan M.E. Quantification of fluoroquinolones in wastewaters by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Environmental Pollution. - 2020. - P. 113-27.

11. Samanidou V.F., Demetriou C.E., Papadoyannis I.N. Direct determination of four fluoroquinolones, enoxacin, norfloxacin, ofloxacin, and ciprofloxacin, in pharmaceuticals and blood serum by HPLC. Analytical and bioanalytical chemistry. - 2003. - V. 375, №5. - P. 623-629.

12. Aksoy В., LL.K.A.Y., Rollas S. 2007. Development and validation of a stability-indicating HPLC method for determination of ciprofloxacin hydrochloride and its related compounds in film-coated tablets. Chromatographia. - 2007. - V. 66, №1. - P. 57-63.

13. De Smet, J., Boussery, K., Colpaert, K., De Sutter, P., De Paepe, P., Decruyenaere, J., & Van Bocxlaer, J. (2009). Pharmacokinetics of fluoroquinolones in critical care patients: a bio-analytical HPLC method for the simultaneous quantification of ofloxacin, ciprofloxacin and moxifloxacin in human plasma. Journal of Chromatography B. - 2007. - V. 877, №10. - P. 961-967.

14. Wehrens R alsace: ALS for the Automatic Chemical Exploration of mixtures. R package version 1.22.0. - 2019. URL https://github.com/rwehrens/alsace. [дата обращения 18.03.2020].

15. R Core Team (2013). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URL http://www.R-project.org/. [дата обращения 10.03.2020].

Изобретение относится к способу определения содержания ципрофлоксацина с использованием обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии, при котором хроматографическое разделение производится на колонке размером 250×3 мм, заполненной сорбентом С18 с размером частиц 5 мкм, с использованием в качестве подвижной фазы смеси 0,025 М раствора дигидрофосфата натрия рН=2,15 с ацетонитрилом в соотношении 85:15 в изократическом режиме элюирования с применением диодно-матричного детектора и объеме вводимой пробы 10 мкл. Технический результат: предложен способ определения ципрофлоксацина методом обращенно-фазной высокоэффективной хроматографии, позволяющий эффективно провести разделение ципрофлоксацина с примесными соединениями в пробе, при этом меньший внутренний диаметр колонки позволяет уменьшить расход подвижной фазы с сохранением эффективности, а большая гидрофобность сорбента С18 обеспечивает большее удерживание ципрофлоксацина, что повышает разрешающую способность метода. 1 ил., 2 пр.

Способ определения содержания ципрофлоксацина с использованием обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии, отличающийся тем, что хроматографическое разделение производится на колонке размером 250×3 мм, заполненной сорбентом С18 с размером частиц 5 мкм, с использованием в качестве подвижной фазы смеси 0,025 М раствора дигидрофосфата натрия рН=2,15 с ацетонитрилом в соотношении 85:15 в изократическом режиме элюирования с применением диодно-матричного детектора и объеме вводимой пробы 10 мкл.