УСЛОВНО ДЕФЕКТНАЯ ЧАСТИЦА ВИРУСА ГРИППА И СПОСОБЫ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2011 года по МПК C12N7/04 C12N7/01 C12N5/10 A61K39/145 

Изобретение относится к области вируса гриппа и вакцинации против гриппа.

Вирусы гриппа (Orthomyxoviridae) представляют собой оболочечные РНК-содержащие вирусы с отрицательной цепью с сегментированным геномом (Taubenberger and Layne, Molecular Diagnosis Vol. 6 No. 4 2001). Их разделяют на два рода на основе значительных антигенных различий между их нуклеопротеинами и матриксными белками: один включает в себя грипп A и B, а другой состоит из гриппа C. Три типа вирусов также различаются по патогенности и организации генома. Тип A выявлен у широкого спектра теплокровных животных, а типы B и C преимущественно представляют собой возбудители заболеваний человека. Вирусы гриппа A дополнительно разделяют в зависимости от антигенной характеристики гемагглютинина (HA) и поверхностных гликопротеинов NA, которые экспонированы на поверхности вириона. В настоящее время существует 15 подтипов HA и девять подтипов NA. Вирусы гриппа A инфицируют широкий спектр животных, включая птиц, свиней, лошадей, людей и других млекопитающих. Водоплавающая птица служит природным резервуаром для всех известных подтипов гриппа A и, возможно, служит источником генетического материала для штаммов пандемического гриппа человека.

В отличие от родственных парамиксовирусов вирусы гриппа обладают сегментированным геномом РНК. Вирусы гриппа A и B обладают сходной структурой, тогда как грипп C отличается сильнее. Тогда как каждый из вирусов типа A и B содержит восемь дискретных генных сегментов, кодирующих, по меньшей мере, один белок каждый, тип C содержит семь дискретных сегментов, с объединением сегментов 4 и 6 типов A и B. Вирусы гриппа A и B являются покрытыми с экспозицией трех белков: HA, NA и матриксный белок 2 (M2). Вирус гриппа C несет только один поверхностный гликопротеин. Каждый сегмент РНК вируса гриппа заключен в капсид из нуклеопротеинов (NP) с формированием рибонуклеопротеиновых (RNP) комплексов. С одним из концов RNP-комплекса ассоциированы три белка полимеразы. RNP окружены мембраной с матриксным белком (матриксный белок 1) в качестве неотъемлемой части. Фосфолипидная часть оболочки происходит из клеточной мембраны хозяина. Также в вирусной частице находится неструктурный белок 2 (NS2).

Правила номенклатуры вирусов гриппа Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) предусматривают следующее. Во-первых, указывают тип вируса (A, B или C), затем - хозяина (если хозяином не является человек), место выделения, номер штамма и год выделения (разделенные наклонными чертами). Для гриппа A подтипы HA и NA указывают в круглых скобках. Например, штаммы, включенные в современную трехвалентную вакцину для сезонов с 2000 по 2001 год, представляют собой: A/Panama/2007/99 (H3N2), A/New Caledonia/20/99 (H1N1), и B/Yamanashi/16/98. С 1977 года у людей совместно циркулируют два подтипа гриппа A: H1N1 и H3N2.

Вирусы гриппа при репликации накапливают точковые мутации, так как их РНК-полимеразный комплекс не обладает корректирующей активностью. Мутации, приводящие к изменению аминокислот в антигенных частях поверхностных гликопротеинов, могут давать селективные преимущества для вирусного штамма, позволяя ему ускользать от существующего иммунитета. Молекула HA инициирует инфекцию посредством связывания с рецепторами на определенных клетках-хозяевах. Антитела к белку HA предотвращают связывание рецептора и очень эффективны для предотвращения повторного инфицирования тем же штаммом. HA могут ускользать от ранее приобретенного иммунитета либо посредством антигенного дрейфа, при котором мутации циркулирующего на данный момент гена HA нарушают связывание антитела, либо антигенного сдвига, при котором вирус приобретает HA нового подтипа. Давление антигенного дрейфа неравномерно распределено по молекуле HA, с положительно отбираемыми изменениями, преимущественно происходящими в глобулярной головке белка HA. Эти изменения также накапливаются в большей степени в HA, чем в NA. Изменения в других белках вируса гриппа происходят медленнее. Подобным образом давление антигенного дрейфа является наивысшим у адаптированных к человеку штаммов вируса гриппа, средним у штаммов, адаптированных к свиньям и лошадям, и наименьшим у адаптированных к птицам штаммов.

Так как вирусы гриппа обладают сегментированным геномом, совместная инфекция двумя различными штаммами одного и того же хозяина может приводить к образованию новых перегруппированных штаммов вируса гриппа, содержащих разные сочетания родительских генных сегментов. Известно, что у диких птиц существует пятнадцать подтипов HA, и они обеспечивают источник HA, которые являются новыми для людей. Появление у человека штамма вируса гриппа с новым подтипом вследствие антигенного сдвига явилось причиной последних двух пандемий гриппа в 1957 и 1968 годах и, наиболее вероятно, было причиной пандемии гриппа в 1918 году. Чтобы согласовываться со всем, что известно о появлении пандемических вирусов гриппа, пандемический штамм должен обладать антигенностью HA, отличной от антигенности, преобладающей в настоящее время; этот HA не мог циркулировать среди людей в течение промежутка от 60 до 70 годов; и вирус должен передаваться от человека к человеку. Как в 1957, так и в 1968 году пандемия происходила вследствие сдвига в HA, и в обоих случаях HA пандемических штаммов были близкородственными со штаммами птиц. Хотя одним из безусловных требований для пандемии является то, что HA должен изменяться, степень, до которой остаток вируса может или должен меняться, неизвестна. Для прямого исследования доступны только пандемические вирусы 1957 и 1968 годов, а пандемический вирус гриппа 1918 года характеризуют с применением молекулярной археологии. В 1957 году генами, подобными генам вирусов птиц, были замещены три гена: HA, NA и субъединица полимеразного комплекса (PB1). В 1968 году замещенными были только HA и PB1.

Конкретный диагноз инфекции гриппа можно сделать посредством выделения вируса, теста ингибирования гемагглютинации (HI), детекции антигенов иммуноанализом, серологических тестов, выявления активности NA в выделениях или молекулярных анализах. Образцы можно собирать в виде мокроты, носоглоточных мазков или носоглоточных смывов, полученных посредством полоскания забуференного физиологического раствора. Стандартном для диагностики гриппа является иммунологическая характеристика после культивирования. Серологический анализ предоставляет точный, но ретроспективный способ для инфекции гриппа, так как он требует сбора сыворотки и в острой фазе, и в фазе выздоровления.

Вирусы гриппа можно растить в куриных яйцах с зародышем или ряде систем тканевых культур. Добавление трипсина (для активации расщепления HA) позволяет вирусу гриппа размножаться в клетках почки собаки Madin-Darby (MDCK) и других линиях. Основным способом получения вакцины по прежнему остается культивирование вирусов гриппа в яйцах. Культивирование в клеточных линиях обычно используют для первичного выделения вирусов гриппа человека (A и B типов). Многие вирусы гриппа человека можно культивировать непосредственно в аллантоисной полости яиц с зародышем. Некоторые вирусы гриппа A и B нуждаются в начальном культивировании в амниотической полости и последующей адаптации к аллантоисной полости. После выделения культуры многие изоляты вируса гриппа окончательно идентифицируют с применением иммуноанализа или иммунофлуоресценции. Молекулы HA вирусов гриппа для усиления проникновения вируса связывают остатки сиаловых кислот на поверхности дыхательных клеток.

Штаммы вируса гриппа можно характеризовать антигенно, учитывая способность вирусов гриппа вызывать агглютинацию эритроцитов in vitro. Антитела к HA могут ингибировать агглютинацию. Таким образом, анализ ингибирования гемагглютинации (HI) представляет собой один из стандартных способов для характеристики штаммов вируса гриппа. Анализы HI используют для определения того, являются ли образцовые штаммы иммунологически родственными (т.е. перекрестно-реактивными) с новейшими вакцинными штаммами. Типирующие сыворотки, как правило, полученные у хорьков, добавляют в лунки в серии двукратных разведений, и сотрудники лабораторий оценивают анализируемые лунки посредством определения суспендированных красных кровяных клеток в сравнении со слипшимися. В большинстве случаев панель сывороток используют для подбора образцовых штаммов к вакцинным или эталонным штаммам и, в течение любого данного сезона гриппа, посредством анализов HI успешно подбирают абсолютное большинство образцовых штаммов.

ВОЗ направляет рекомендации, а центры сотрудничества с ВОЗ предоставляют руководство по идентификации антигенных характеристик конкретных вирусных штаммов. Образцовые штаммы классифицированы в зависимости от иммунологической родословной, например, A/Moscow/10/99 (H3N2), подобные A/New Caledonia 20/99 (H1N1) и подобные B/Beijing/184/93 вирусы. Образцовые штаммы, для которых не удалось получить характеристику при анализе HI, сотрудники лабораторий должны инокулировать хорькам для получения специфичной для штамма антисыворотки. Когда новая антисыворотка получена, снова проводят анализ HI, как описано. Если новая сыворотка демонстрирует значительные пропуски в перекрестной специфичности (обычно определяемые как четырехкратная разница между штаммом образца и вакцинным штаммом), ее встраивают в регулярную лабораторную панель и используют для поиска новых эпидемических штаммов. Таким образом, анализ HI является крайне важным в работе по наблюдению за вирусом гриппа для выбора вакцинного штамма и наиболее часто используемым способом для оценки антигенного дрейфа.

Штаммы вируса гриппа можно характеризовать генетически посредством сравнения последовательностей конкретных генных сегментов, и вновь указания ВОЗ и центры сотрудничества с ВОЗ предоставляют руководство по идентификации индивидуальных особенностей сегментов РНК, входящих в геном вируса гриппа; сегменты нуклеиновой кислоты вируса гриппа A и B, кодирующие нуклеопротеин (NP), основную полимеразу 1 (PB1), основную полимеразу 2 (PB2), кислую полимеразу (PA), гемагглютинин (HA), нейраминидазу (NA), матриксные белки (M1 и M2) и неструктурный белок (NS1 и NS2), и сегменты нуклеиновой кислоты вируса гриппа C, кодирующие нуклеопротеин (NP), основную полимеразу 1 (PB1), основную полимеразу 2 (PB2), гемагглютининнейраминидазоподобный гликопротеин (HN), матриксные белки (M1 и M2) и неструктурный белок (NS1 и NS2). Запросы на эталонные штаммы для антигенного анализа для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот и для идентификации вакцинных вирусов можно направить в WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza, 45 Poplar Road, Parkville, Victoria 3052, Australia (fax: +61 3 9389 1881, веб-сайт: http://www.influenzacentre.org); WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza, National Institute of Infectious Diseases, Gakuen 4-7-1, Musashi-Murayama, Tokyo 208-0011, Japan (факс: +81 42 5610812 или +81 42 5652498); WHO Collaborating Center for Surveillance, Epidemiology and Control of Influenza, Centers for Disease Control and Prevention, 1600 Clifton Road, Mail stop G16, Atlanta, GA 30333, United States of America (факс: +1 404 639 23 34) или WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza, National Institute for Medical Research, The Ridgeway, Mill Hill, London NW7 1AA, England (факс: +44 208 906 4477). Обновленная эпидемиологическая информация доступна на веб-сайте ВОЗ http://www.who.int/influenza и географической информационной системы, FluNet, http://www.who.int/fluent.

Осознание последствий гриппа и пользы для здоровья и экономики от его предотвращения увеличивается и в последнее десятилетие наблюдается значительное увеличение применения и эффективности вакцинации и ряда противогриппозных лекарственных средств. Как результат большей длительности жизни во многих странах, значительно больше людей подвергаются риску осложнений, более широко признается нагрузка на системы медицинского обслуживания во время эпидемий гриппа, а более частые международный туризм создает благоприятные возможности для распространения вируса, несмотря на то, что внедрение новых продуктов создают более широкие возможности для профилактики и лечения заболевания. Более чем в 50 странах существуют финансируемые правительствами национальные программы иммунизации против гриппа, а во многих других доступна вакцина. Конкретные рекомендации по применению вакцины различаются, но, как правило, они включают в себя ежегодную иммунизацию индивидуумов пожилого возраста и индивидуумов старше 6 месяцев с повышенным риском тяжелого заболевания, вследствие предсуществующего хронического медицинского показания. В некоторых странах вакцину применяют для уменьшения распространенности гриппа у лиц с увеличенным медицинским риском. Странам-участникам необходимо рассматривать выгоду от действий по профилактике гриппа в контексте их общих приоритетов общественного здравоохранения. Инактивированные вакцины классифицируют по нескольким типам в зависимости от того, содержат ли они целые вирусные частицы, частично разрушенные вирусные частицы (раздробленные вакцины) или очищенные антигены оболочки (субъединичные вакцины). Некоторые субъединичные вакцины комбинируют с адъювантом или системой доставки.

В некоторых странах лицензирована живая аттенуированная вакцина против гриппа для некоторых целевых групп. В Российской Федерации используют два различных состава 1 вакцины для здоровых взрослых и детей, а другие живые вакцины интенсивно тестировали. Однако пока живые аттенуированные вакцины не достаточно широко доступны, как правило, их не рекомендуют для профилактики гриппа.

Для профилактики и лечения гриппа разработаны два класса антивирусных средств. Ингибиторы M2, амантадин и римантадин ограничиваются лечением вирусов гриппа A, а также сообщалось, что они эффективны для профилактики инфекции. Хотя оба продукта вызывают некоторые побочные эффекты, для амантадина более частыми являются значительные неврологические побочные эффекты. В ряде стран для лечения гриппа типов A и B недавно лицензированы ингибиторы нейраминидазы, такие как занамивир и оселтамивир, и сообщалось, что они эффективны для профилактики. У пациентов, принимающих оба класса антивирусных средств, выявлены устойчивые мутанты. Хотя в настоящее время этот факт не считают важной проблемой здравоохранения, ситуация может измениться, если эти лекарственные средства использовать в самом широком масштабе.

ВОЗ поддерживает всемирную международную программу по контролю, действующую при кооперации 110 национальных центров гриппа, расположенных в 82 странах, и 4 центра сотрудничества с ВОЗ по рекомендациям и исследованию гриппа, расположенные в Атланте (Соединенные Штаты Америки), Лондоне (Великобритания), Мельбурне (Австралия) и Токио (Япония). Эти центры обеспечивают систему раннего оповещения для развивающихся штаммов с эпидемическим потенциалом. Эта система важна потому, что эффективность вакцин от гриппа, если они не содержат циркулирующих в настоящее время штаммов, снижается. ВОЗ публикует рекомендации по составу вакцин, как можно найти в Weekly Epidemiological Record (например, смотри выпуск 9, 2004 год, 79, страница 88 или http://www.who.int/wer), публикуемый Всемирной Организацией Здравоохранения в феврале для вакцин, используемых в северном полушарии, и в сентября для вакцин, используемых в южном полушарии. Так как грипп имеет менее определенные сезонные особенности в экваториальных областях, на то какие из этих рекомендаций (февраль или сентябрь) подходят для вакцин для применения в экваториальных странах, будут влиять эпидемиологические факторы.

Центры сотрудничества проводят антигенный и генетический анализ изолятов гриппа, предоставленных национальными центрами. Там, где обнаруживают признаки антигенной вариабельности, их сопоставляют с эпидемиологическими данными для определения эпидемиологической значимости вариантов. Репрезентативные изоляты сравнивают со штаммами применяемых на данный момент вакцин с использованием панелей сывороток человека, собранных до и после вакцинации, для оценки того, можно ли ожидать, что применяемые на данный момент вакцины защищают от этих вирусов. После публикации ежегодных рекомендаций ВОЗ по вакцинам выращивают быстрорастущие штаммы и предоставляют их производителям в качестве эталонных вирусов, содействуя в получении вирусов-потомков для производства вакцины. Тесты по безопасности и эффективности вакцин от гриппа включают в себя инактивацию вируса, микробиологическую стерильность, количественное определение химических веществ, используемых для разрушения вируса, и подтверждение концентрации рекомендуемых антигенов. Рекомендовано, что вакцины должны соответствовать требованиям ВОЗ, однако конкретные вакцинные вирусы, применяемые в каждой стране, должны одобрять национальные контрольные органы. За рекомендации по применению вакцины ответственны национальные органы здравоохранения. Также ВОЗ опубликовала рекомендации по профилактике гриппа (смотри WER № 35, 2002, стр. 281-288).

Уже показано, что применяемые в настоящее время вакцины против гриппа не защищают не подвергнутых воздействию индивидуумов, факт, который приобретает непосредственное значение в случае пандемической вспышки гриппа, когда в таком случае под угрозой находится большинство не сталкивавшихся до этого с инфекцией гриппа индивидуумов. Как правило, вирусы начинают свой жизненный цикл посредством взаимодействия с поверхностными рецепторами клетки-хозяина, вхождения в клетки и высвобождения своей вирусной нуклеиновой кислоты с последующей репликацией вирусного генома. После синтеза новых копий вирусных белков и генов эти компоненты собираются в вирионы-потомки, которые затем выходят из клетки. Во время стадии сборки вирус-потомок должен эффективно выбирать свою геномную нуклеиновую кислоту из большого пула вирусных и клеточных нуклеиновых кислот, находящихся в цитоплазме. Упаковка вирусных геномов в вирионы, как правило, включает в себя узнавание вирусными компонентами цис-действующей последовательности в вирусной нуклеиновой кислоте, так называемого "сигнала упаковки". Определение таких сигналов важно для понимания жизненного цикла вирусов и обеспечивает нас информацией, которую можно использовать для конструирования вирусных векторов для экспрессии чужеродных белков. Действительно, пригодность ретровирусов в качестве носителей для доставляющих гены векторов для экспрессии чужеродных белков можно в большой степени объяснить хорошо обоснованным знанием процесса упаковки их вРНК в вирионы-потомки.

Геномные сигналы упаковки других РНК-содержащих вирусов изучены недостаточно, что препятствует их использованию в качестве векторов для экспрессии и доставки чужеродных генов. Например, вирус гриппа A представляет собой оболочечный РНК-содержащий вирус с отрицательной цепью, сегментированный геном которого обладает потенциалом к кодированию нуклеопротеина (NP), основной полимеразы 1 (PB1), основной полимеразы 2 (PB2), кислой полимеразы (PA), гемагглютинина (HA), нейраминидазы (NA), матриксных белков (M1 и M2) и неструктурного белка (NS1 и NS2).

В этом вирусе на оболочке присутствуют два пересекающих мембрану гликопротеина, гемагглютинин (HA) и нейраминидаза (NA). Белок HA связывается с содержащими сиаловые кислоты рецепторами на поверхности клетки-хозяина и опосредует слияние оболочки вируса с эндосомальной мембраной после опосредованного рецепторами эндоцитоза. В отличие от этого белок NA играет ключевую роль на конечной стадии инфицирования, удаляя сиаловую кислоту из сиалоолигосахаридов, таким образом высвобождая вновь собранные вирионы из клеточной поверхности и предотвращая аутоагрегацию вирусных частиц. В оболочке вирусный геном, содержащий восемь различных сегментов вирусной РНК (вРНК), прочно связывается с нуклеопротеином (NP) и белками полимераз (PA, PB1 и PB2), формируя рибонуклеопротеиновые комплексы. Все восемь (или, в случае вируса типа C, все семь) функциональных генных сегментов необходимы для получения инфекционного вируса. Описаны различные мутации в генах полимераз (WO2004/094466, WO2003/091401, US 5578473, Fodor et al, J. Virol. 77, 5017-5020, 2003), которые изменяют активность полимеразы или иным образом изменяют полимеразу, но не способствуют потере ей функциональности в отношении синтеза вирусной РНК, с получением содержащего такие мутированные полимеразы вируса, неспособного к репликации. В WO2004/094466 получали инфекционные вирусы с мутированным геном PA, таким образом демонстрируя преимущества системы селекции, позволяющие получать и восстанавливать инфекционный вирус с мутированными генами. В WO2003/091401 показано, как получать инфекционный вирус с мутациями в генах полимераз, для обеспечения получения и восстановления вируса гриппа с желательными свойствами, подходящими для получения аттенуированного вакцинного вируса, такими как температурная чувствительность или другие типы аттенуации. В US 55788473 предложены сегменты генов полимераз, возможно изменяющие специфичность и снижающие активность различных полимераз. Однако их не использовали для восстановления вируса, не считая восстановления вируса, у которого полностью потеряна активность его полимераз. Кроме того, ни в одной из указанных выше заявок не получали дефектные частицы, потерявшие способность к репликации. Хорошо известно, что когда вирусы гриппа A пересевают при высокой множественности инфицирования, образуются дефектные вирусные частицы, в которых отсутствуют один или несколько функциональных генных сегментов. В таких вирусных частицах один или несколько функциональных генов замещены дефектными интерферирующими (DI) генными сегментами, вследствие ошибок, совершаемых полимеразой вируса гриппа. Вследствие высокой множественности инфекции и, следовательно, инфекции клеток более чем 1 вирусной частицей дефекты вирусов, содержащих DI РНК, комплементируются вирусами, содержащими неповрежденные копии утраченных функциональных генов. Недавно показано, что определенные мутации в гене кислой полимеразы могут увеличивать эффективность размножения вирусных частиц с дефектными генами (Fodor 2003). Важно отметить, что размножение дефектных вирусных частиц в этих экспериментах и комплементация происходили в таких экспериментах случайным образом. Этот случайный процесс ограничивает применение DI РНК и условно дефектных вирусных частиц для практического применения. Кроме того, когда дефектные вирусные частицы получают с применением этих опубликованных способов, в дополнение к желательным условно дефектным вирусам образуются способные к репликации вирусы дикого типа. Такие способные к репликации вирусы могут быть или полностью вирусами дикого типа (вирус-помощник), или рекомбинантами, полученными в результате генетического смешения вируса-помощника с дефектным вирусом. Как происходит процесс упаковки генных сегментов вируса гриппа, случайным образом или посредством специфического механизма, обсуждается в течение многих лет. Описаны экспериментальные доказательства для обоих вариантов. Доказательством случайной упаковки является то, что агрегированные вирусные частицы обладают большей инфективностью, чем неагрегированные вирусные частицы, и то, что когда клеточную культуру инфицируют при низкой множественности инфицирования (MOI), в некоторых инфицированных клетках отсутствует экспрессия одного из сегментов, что вместе указывает на то, что существуют вирионы, не содержащие целого генома вируса гриппа. Дополнительным доказательством случайной упаковки является то, что экспериментально получены вирусы гриппа, содержащие девять сегментов.

Одним из аргументов за процесс специфической упаковки является то, что хотя все генные сегменты в биомассе вируса находятся в равных количествах, в продуцирующих клетках они находятся в разных количествах. Кроме того, когда образуются дефектные интерферирующие (DI) частицы, DI вРНК замещает тот сегмент, из которого она получена (Дефектная интерферирующая частица представляет собой вирусную частицу, в которой в одном из генных сегментов присутствует большая внутренняя делеция. Эти частицы образуются, когда вирус пересевают при высокой MOI). Наконец эффективность образования вириона увеличивается при увеличении количества генных сегментов.

Сущность изобретения

Дефектные частицы вируса гриппа (например, Mena I. et al., J. Virol. 70:5016-24 (1996); Neumann G. et al., J. Virol. 74:547-51 (2000)) можно применять в качестве кандидатов для создания вакцины, так как они кроме HA и NA индуцируют антитела к другим вирусным белкам и если они способны проникать в клетку хозяина, так как они кроме гуморального ответа способны индуцировать клеточный иммунный ответ против вируса (например, хелперные Т-клетки, цитотоксические Т-клетки). До настоящего времени получения дефектных частиц вируса гриппа добивались посредством трансфекции (Mena I. et al., J. Virol. 70:5016-24 (1996); Neumann G. et al., J. Virol. 74:547-51 (2000)), снижая возможности получения больших количеств таких частиц. Альтернативой этому подходу может быть получение вирусных частиц, которые являются условно дефектными, позволяя им реплицироваться в определенной продуцирующей системе, но не в нормальных клетках или продуцирующих системах. С этой целью клетки продуцирующей системы можно модифицировать для создания возможности образования одного или нескольких генов или продуктов генов вируса гриппа, обеспечивая транскомплементацию дефектных частиц вируса гриппа. В настоящем изобретении первый раз описана определенная транскомплементация дефектных частиц вируса гриппа. В лаборатории транскомплементацию частиц вируса гриппа наблюдают, когда дефектные интерферирующие вирусы гриппа комплементируют в тех же клетках с вирусами, несущими версию дикого типа дефектного интерферирующего генного сегмента. Эта "природная система" транскомплементации непригодна для получения определенных условно дефектных частиц вируса гриппа. Во-первых, в этой системе необходима комплементация одного (частично) дефектного вируса, по меньшей мере, с одним (частично) способным к репликации вирусом, что может привести к нежелательному образованию полностью инфекционного вируса. Во-вторых, так как образование дефектных интерферирующих частиц происходит случайным образом для различных генных сегментов, невозможно получить определенные условно дефектные вирусные частицы.

Условно дефектные частицы вируса гриппа теоретически можно получать на основе удаления целых генных сегментов или их частей. Возможность получения определенных условно дефектных вирусных частиц посредством удаления целых генных сегментов (и получения кодируемого продукта(ов) гена в трансположении) может быть ограничена, если упаковка генома вируса гриппа основана на присутствии всех 8 сегментов, что является предметом большой дискуссии (смотри в другом месте в данном описании). Если процесс упаковки требует присутствия всех 8 генных сегментов, неизвестно все ли генные сегменты должны присутствовать в полноразмерной форме, что даже дополнительно осложняет получение условно дефектных вирусных частиц. Настоящее изобретение решает эти трудности.

Изобретение относится к способу получения условно дефектной частицы вируса гриппа, включающему в себя первую стадию трансфекции подходящей первой клетки или клеток, такой как клетка 293T, генной конструкцией с внутренними делециями, такой как pΔPB2, pΔPB1, pΔPA или pDIPA, как предусмотрено в настоящем документе, полученной посредством внутреннего удаления нуклеиновой кислоты, кодирующей полимеразу гриппа, в результате чего указанная генная конструкция неспособна к образованию функциональной полимеразы, способной к копированию или синтезу вирусной РНК, и комплементирующими сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, кодирующими вирус гриппа, такими как семь комплементирующих конструкций, кодирующих A/WSN/33 (HW181-188, Hoffmann et al., 2000), и экспрессирующей плазмидой, способной к экспрессии указанной полимеразы в указанных клетках, такой как одна из HMG-PB2, HMG-PB1, HMG-PA, как предусмотрено в настоящем документе, и получение, по меньшей мере, одной вирусной частицы из супернатанта указанной первой клетки или клеток, в подходящий момент времени, такой как в пределах от 10 до 50, предпочтительно приблизительно от 20 до 30 часов после трансфекции; и вторую стадию трансфекции подходящей второй клетки или клеток, такой как клетка MDCK, экспрессирующей плазмидой, способной экспрессировать указанную полимеразу в указанной клетке; и третью стадию трансфекции указанной второй клетки или клеток супернатантом, содержащим, по меньшей мере, одну вирусную частицу, полученную из указанной первой клетки; и четвертую стадию, включающую получение, по меньшей мере, одной (теперь условно дефектной вследствие того, что в полученных вирусах отсутствует генный сегмент, экспрессирующий функциональную полимеразу, способную к копированию или синтезу вирусной РНК, так как в них упакован генный сегмент с внутренней делецией) вирусной частицы из супернатанта указанной первой клетки или клеток в подходящий момент времени, такой как от 24 до 96, предпочтительно от 48 до 72 часов после трансфекции.

Предпочтительны внутренние делеции, делающие генный сегмент неспособным к получению функционального белка, но не такие большие, чтобы препятствовать упаковке генных сегментов вируса в вирусные частицы. Предпочтительно эти делеции отсчитывают, соответственно, от 5' и 3' некодирующих областей. Для гриппа A такие предпочтительные делеции, например, начинаются от 5'-нуклеотида, расположенного между нуклеотидами 58 и 75, но не включая их, и оканчиваются на 3'-нуклеотиде, расположенном между нуклеотидами 27 и 50, но не включая их, для белка PA, начинаются от 5'-нуклеотида, расположенного между нуклеотидами 43 и 75, но не включая их, и оканчиваются на 3'-нуклеотиде, расположенном между нуклеотидами 24 и 50, но не включая их, для белка PB1, начинаются от 5'-нуклеотида, расположенного между нуклеотидами 34 и 50, но не включая их, и оканчиваются на 3'-нуклеотиде, расположенном между нуклеотидами 27 и 50, но не включая их, для белка PB2. Более предпочтительно эти делеции: начинаются от 5'-нуклеотида, расположенного между нуклеотидами 58 и 100, но не включая их, и оканчиваются на 3'-нуклеотиде, расположенном между нуклеотидами 27 и 100, но не включая их, для белка PA, начинаются от 5'-нуклеотида, расположенного между нуклеотидами 43 и 100, но не включая их, и оканчиваются на 3'-нуклеотиде, расположенном между нуклеотидами 24 и 100, но не включая их, для белка PB1, начинаются от 5'-нуклеотида, расположенного между нуклеотидами 34 и 100, но не включая их, и оканчиваются на 3'-нуклеотиде, расположенном между нуклеотидами 27 и 100, но не включая их, для белка PB2. Даже более предпочтительно эти делеции: начинаются от 5'-нуклеотида, расположенного между нуклеотидами 58 и 150, но не включая их, и оканчиваются на 3'-нуклеотиде, расположенном между нуклеотидами 27 и 150, но не включая их, для белка PA, начинаются от 5'-нуклеотида, расположенного между нуклеотидами 43 и 150, но не включая их, и оканчиваются на 3'-нуклеотиде, расположенном между нуклеотидами 24 и 150, но не включая их, для белка PB1, начинаются от 5'-нуклеотида, расположенного между нуклеотидами 34 и 150, но не включая их, и оканчиваются на 3'-нуклеотиде, расположенном между нуклеотидами 27 и 150, но не включая их, для белка PB2. Еще более предпочтительно эти делеции: начинаются от 5'-нуклеотида, расположенного между нуклеотидами 58 и 175, но не включая их, и оканчиваются на 3'-нуклеотиде, расположенном между нуклеотидами 27 и 175, но не включая их, для белка PA, начинаются от 5'-нуклеотида, расположенного между нуклеотидами 43 и 175, но не включая их, и оканчиваются на 3'-нуклеотиде, расположенном между нуклеотидами 24 и 175, но не включая их, для белка PB1, начинаются от 5'-нуклеотида, расположенного между нуклеотидами 34 и 175, но не включая их, и оканчиваются на 3'-нуклеотиде, расположенном между нуклеотидами 27 и 175, но не включая их, для белка PB2. Наиболее предпочтительно эти делеции: начинаются от 5'-нуклеотида, расположенного между нуклеотидами 58 и 207, но не включая их, и оканчиваются на 3'-нуклеотиде, расположенном между нуклеотидами 27 и 194, но не включая их, для белка PA, начинаются от 5'-нуклеотида, расположенного между нуклеотидами 43 и 246, но не включая их, и оканчиваются на 3'-нуклеотиде, расположенном между нуклеотидами 24 и 197, но не включая их, для белка PB1, начинаются от 5'-нуклеотида, расположенного между нуклеотидами 34 и 234, но не включая их, и оканчиваются на 3'-нуклеотиде, расположенном между нуклеотидами 27 и 209, но не включая их, для белка PB2.

В настоящем документе комплементирующие сегменты определены как сегменты, приводящие к полному набору из восьми генных сегментов, например, вируса гриппа A. Таким образом, если сегмент 1 уже использовали для получения дефектного сегмента, комплементирующие (недефектные) сегменты представляют собой сегмент 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8. Если дефектным является 2, комплементирующие сегменты представляют собой сегмент 1, 3, 4, 5, 6, 7 и 8. И так далее. Преимущественно в изобретении предоставлен способ, при котором не требуется или не присутствует вирус-помощник.

Изобретение относится к выделенной и условно дефектной частице вируса гриппа с отсутствием функционального сегмента нуклеиновой кислоты вируса гриппа (в настоящем документе также называемой условно дефектная частица вируса гриппа), кодирующего полимеразу, выбранную из группы кислой полимеразы (PA), основной полимеразы 1 (PB1) и основной полимеразы 2 (PB2), где указанная частица

неспособна к синтезу полимеразы или служить в качестве источника для синтеза полимеразы для копирования или синтеза вирусной РНК, таким образом только и условно позволяя образование репликационных вирусных частиц в клетках, транскомплементированных функциональной полимеразой. Кроме того, изобретение относится к способу получения условно дефектной частицы вируса гриппа, включающему в себя получение клетки посредством транскомплементации с функциональной полимеразой вируса гриппа.

В предпочтительном варианте осуществления частица по изобретению реплицируется в клетке, комплементированной аналогичным сегментом нуклеиновой кислоты, который отсутствует в самой частице, например частица с отсутствием сегмента функциональной нуклеиновой кислоты вируса гриппа PA реплицируется в клетке, которая обеспечена, по меньшей мере, сегментом функциональной нуклеиновой кислоты вируса гриппа PA, частица с отсутствием сегмента функциональной нуклеиновой кислоты вируса гриппа PB1 реплицируется в клетке, которая обеспечена, по меньшей мере, сегментом функциональной нуклеиновой кислоты вируса гриппа PB1, частица с отсутствием сегмента функциональной нуклеиновой кислоты вируса гриппа PB2 реплицируется в клетке, которая обеспечена, по меньшей мере, сегментом функциональной нуклеиновой кислоты вируса гриппа PB, соответственно. В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к частице по изобретению с сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, кодирующими вирусные гликопротеины, более предпочтительно с сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, кодирующими нуклеопротеин (NP), гемагглютинин (HA), нейраминидазу (NA), матриксные белки (M1 и M2) и неструктурный белок (NS1 и NS2). В одном из вариантов осуществления предоставлена частица по изобретению с сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, полученными из вируса гриппа A. Также предоставлена частица по изобретению, которая содержит нуклеиновую кислоту, не кодирующую пептид гриппа. Также изобретение относится к выделенной клетке, содержащей частицу по изобретению, где в указанной клетке отсутствует вирус гриппа дикого типа или вирус-помощник, но предпочтительно содержит полимеразу вируса гриппа или кодирующий ее генный сегмент или комплементирована ими. В предпочтительном варианте осуществления такая клетка представляет собой транскомплементированную клетку 293T или MDCK. В одном из вариантов осуществления изобретение относится к выделенной клетке, содержащей частицу с отсутствием сегмента функциональной нуклеиновой кислоты вируса гриппа PA, где в указанной клетке отсутствует вирус гриппа дикого типа или вирус-помощник, но клетка снабжена или комплементирована, по меньшей мере, сегментом функциональной нуклеиновой кислоты вируса гриппа PA или функциональной PA. В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенной клетке, содержащей частицу с отсутствием сегмента функциональной нуклеиновой кислоты вируса гриппа PB1, где в указанной клетке отсутствует вирус гриппа дикого типа или вирус-помощник, но клетка снабжена или комплементирована, по меньшей мере, сегментом функциональной нуклеиновой кислоты вируса гриппа PB1 или функциональной PB1. В еще одном варианте осуществления изобретение относится к выделенной клетке, содержащей частицу с отсутствием сегмента функциональной нуклеиновой кислоты вируса гриппа PB2, где в указанной клетке отсутствует вирус гриппа дикого типа или вирус-помощник, но клетка снабжена или комплементирована, по меньшей мере, сегментом функциональной нуклеиновой кислоты вируса гриппа PB2 или функциональной PB2. Кроме того, изобретение относится к композиции, содержащей частицу по изобретению или клетку или продукт, полученный из клетки по изобретению, и к применению такой композиции для получения фармацевтической композиции, предназначенной для создания иммунологической защиты против инфекции субъекта вирусом гриппа. Таким образом, изобретение относится к способу создания иммунологической защиты против инфекции субъекта вирусом гриппа, включающему в себя предоставление композиции по изобретению нуждающемуся в этом субъекту. Также изобретение относится к применению частицы вируса гриппа по изобретению для получения композиции предназначенной для доставки в клетку нуклеиновой кислоты, не кодирующей пептид гриппа. Также изобретение относится к применению частицы по изобретению для получения фармацевтической композиции, предназначенной для доставки в клетки субъекта нуклеиновой кислоты, не кодирующей пептид гриппа, и способу для доставки в клетки или субъекту нуклеиновой кислоты, не кодирующей пептид гриппа, включающему в себя введение в указанную клетку или субъекту частицы по изобретению.

Изобретение относится к условно дефектной частице вируса гриппа с отсутствием одного функционального сегмента вируса гриппа по сравнению с его природным геномом, т.е.: по сравнению с вирусом дикого типа или вирусом-помощником типа A или B с семью (вместо восьми) различными функциональными сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, или по сравнению с вирусом дикого типа или вирусом-помощником типа C с шестью (вместо семи) различными функциональными сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа. Когда в настоящем документе используют термин "условно дефектный", он включает в себя в качестве неограничивающих примеров вирусные частицы, где один из генных сегментов вируса несет большую внутреннюю делецию, приводящую к экспрессирующемуся с него нефункциональному белку. Все восемь генных сегментов, например, вируса гриппа A и все белки, кодируемые ими, необходимы для получения инфекционного вируса. Таким образом, вирус, содержащий дефектный генный сегмент, сам является дефектным: он может инфицировать клетку и может проходить один цикл репликации, так как в вирионе присутствуют все вирусные белки (например, этот белок был получен посредством экспрессирующей плазмиды, когда получали вирус), но в инфицированных клетках инфекционные вирусные частицы не образуются, так как вирус не может синтезировать один из вирусных белков. Однако когда инфицируются клетки, экспрессирующие белок, который в норме экспрессируется дефектным генным сегментом, дефектный вирус может реплицироваться в этих клетках, так как присутствуют все вирусные белки. Таким образом, эти вирусы являются условно дефектными: они не могут реплицироваться, если не предоставлена клетка с правильным условием (в этом случае клетка, экспрессирующая вирусный белок, который не кодируется вирусом вследствие делеции в генном сегменте).

Кроме того, изобретение относится к условно дефектной частице вируса гриппа с отсутствием функционального сегмента нуклеиновой кислоты вируса гриппа, кодирующего полимеразу. В настоящем документе функциональный сегмент нуклеиновой кислоты вируса гриппа включает в себя нуклеиновую кислоту, кодирующую функциональный белок гриппа, позволяющий получение реплицирующегося вируса и необходимый для него. Например, вирус гриппа A представляет собой РНК-содержащий вирус с отрицательной цепью с 8-сегментным геномом. 8 генных сегментов кодируют 11 белков; генные сегменты 1-8 кодируют основную полимеразу 2 (PB2), основную полимеразу 1 (PB1) и PB1-ORF2 (F2), кислую полимеразу (PA), гемагглютинин (HA), нуклеопротеин (NP), нейраминидазу (NA), матриксные белки 1 и 2 (M1, M2) и неструктурные белки 1 и 2 (NS1, NS2), соответственно. Кодирующие области 8 генных сегментов фланкированы некодирующими областями (NCR), необходимыми для синтеза вирусной РНК. Последние 13 и 12 нуклеотидов на 5'- и 3'-концах вирусной геномной РНК, соответственно, являются консервативными во всех сегментах вируса гриппа A и являются частично комплементарными, формируя вторичную структуру, распознаваемую вирусным полимеразным комплексом. NCR могут содержать до 60 дополнительных нуклеотидов, которые не являются консервативными в 8 генных сегментах, но относительно консервативны среди различных вирусов гриппа. NCR и фланкирующие последовательности в кодирующих областях могут быть необходимыми для эффективной упаковки вирусного генома. Таким образом, функциональный сегмент нуклеиновой кислоты вируса гриппа состоит из последовательности с кодирующим потенциалом для функционального белка гриппа, позволяющей образование репликационного вируса (1 или 2 открытые рамки считывания на сегмент), NCR, необходимых для транскрипции мРНК, вирусной РНК (вРНК) и РНК, комплементарной вирусной РНК (кРНК), и сигнала упаковки, находящегося в NCR и фланкирующего кодирующие последовательности. Предпочтительно, чтобы в указанной условно дефектной частице вируса гриппа с отсутствием одной из нуклеиновых кислот вируса гриппа отсутствовал сегмент, кодирующий функциональную полимеразу, представляющую собой PA, PB1 или PB2. Кроме того, для целей вакцинирования предпочтительно, чтобы указанная частица несла сегмент нуклеиновой кислоты вируса(ов) гриппа, кодирующий вирусный гликопротеин(ы).

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к вирусной частице гриппа A с семью различными сегментами нуклеиновой кислоты гриппа A. Дефектные частицы вируса гриппа по изобретению способны к репликации, хотя только один раз, в подходящих, но не комплементированных животных- или клетках-хозяевах. В подходящих комплементированных клетках частицы по изобретению могут реплицироваться несколько циклов. Для целей вакцинации и доставки генов большим преимуществом является то, что дефектные частицы не могут неограниченно реплицироваться в нормальных не транскомплементированных клетках, тем самым снижая риск распространения вакцинного вируса от хозяина к хозяину и снижая риск реверсии к вирусу дикого типа.

Впервые применяя обратную генетику были получены дефектные вирусы гриппа A, которые содержат только семь функциональных генных сегмента и которые могут проходить один цикл репликации или несколько циклов репликации, когда дефектный генный сегмент транскомплементирован. В одном из вариантов осуществления изобретение относится к условно дефектной частице вируса гриппа с отсутствием сегмента нуклеиновой кислоты вируса гриппа, главным образом кодирующего кислую полимеразу (PA). Подобно транскомплементации PA можно представить транскомплементацию других генов вируса гриппа. Однако так как показано, что уровни экспрессии PA менее критичны по сравнению с уровнями экспрессии других белков вируса гриппа, PA представляет собой предпочтительный генный сегмент из группы полимераз, который удаляют, с таким же успехом можно получать вирусы с делецией PB2 и PB1, а вирусы с делецией NP нельзя транскомплементировать. В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к условно дефектной вирусной частице гриппа A с семью различными сегментами нуклеиновой кислоты гриппа A и с отсутствием сегмента нуклеиновой кислоты гриппа A, в основном кодирующего кислую полимеразу. Для целей вакцинирования предпочтительная условно дефектная вирусная частица гриппа A по изобретению несет сегменты нуклеиновой кислоты гриппа A, преимущественно кодирующие белки гемагглютинин (HA) и нейраминидазу (NA), эти белки являются наиболее иммунологически релевантными для создания защиты. Для отбора соответствующих генных сегментов для включения в вакцину предпочтительно, чтобы генные сегменты были выбраны из вируса, рекомендованного ВОЗ для применения в вакцинах. Разумеется, что подтипы HA и NA могут варьировать в зависимости от подтипов HA и NA варианта гриппа, против которого желательно создать вакцину. Наиболее предпочтительно получать условно дефектную частицу вируса гриппа по изобретению с сегментами нуклеиновой кислоты гриппа A, преимущественно кодирующими нуклеопротеин (NP), основную полимеразу 1 (PB1), основную полимеразу 2 (PB2), гемагглютинин (HA), нейраминидазу (NA), матриксные белки (M1 и M2) и неструктурный белок (NS1 и NS2), где в основном кодирование в настоящем документе в частности указывает на то, что функциональный белок экспрессируется с соответствующего генного сегмента. Такая частица в частности предоставлена в выделенной клетке, содержащей функциональную PA или функциональный генный сегмент, кодирующий PA. В другом варианте осуществления в настоящем документе предоставлена условно дефектная частица вируса гриппа по изобретению с сегментами нуклеиновой кислоты гриппа A, в основном кодирующими нуклеопротеин (NP), кислую полимеразу (PA), основную полимеразу 2 (PB2), гемагглютинин (HA), нейраминидазу (NA), матриксные белки (M1 и M2) и неструктурный белок (NS1 и NS2), где в основном кодирование в настоящем документе в частности указывает на то, что функциональный белок экспрессируется с соответствующего генного сегмента. Такая частица в частности предоставлена в выделенной клетке, содержащей функциональную PB1 или функциональный генный сегмент, кодирующий PB1. В другом варианте осуществления в настоящем документе предоставлена условно дефектная частица вируса гриппа по изобретению с сегментами нуклеиновой кислоты гриппа A, в основном кодирующими нуклеопротеин (NP), кислую полимеразу (PA), основную полимеразу 1 (PB1), гемагглютинин (HA), нейраминидазу (NA), матриксные белки (M1 и M2) и неструктурный белок (NS1 и NS2), где в основном кодирование в настоящем документе в частности указывает на то, что функциональный белок экспрессируется с соответствующего генного сегмента. Такая частица в частности предоставлена в выделенной клетке, содержащей функциональную PB2 или функциональный генный сегмент, кодирующий PB2. В другом варианте осуществления изобретение относится к частицам по изобретению, дополнительно содержащим нуклеиновую кислоту, не кодирующую пептид гриппа, например кодирующую чужеродный белок или пептид, пригодный для вызова иммунного ответа, или содержащим нуклеиновую кислоту, способную препятствовать клеточным функциям или функциям патогенного микроорганизма в клетке.

Кроме того, изобретение относится к клетке, содержащей частицу вируса гриппа по изобретению. Когда частица не содержит генный сегменты, в основном кодирующий необходимую полимеразу, она пригодна для рассмотрения клетки, содержащей подходящую функциональную полимеразу вируса гриппа, обеспечивая многократные циклы репликации дефектных частиц вируса гриппа в комплементированной, таким образом, клетке. Также изобретение относится к композиции, содержащей дефектную частицу вируса гриппа по изобретению или клетку или продукт, полученный из клетки по изобретению; где такую композицию можно использовать, например, для получения фармацевтической композиции, предназначенной для создания иммунологической защиты против инфекции субъекта вирусом гриппа. Также изобретение относится к способу создания иммунологической защиты против инфекции субъекта вирусом гриппа, включающему в себя предоставление нуждающемуся в этом субъекту такой композиции. Кроме применения частиц по изобретению в качестве вакцинной или иммуногенной композиции, такие композиции предпочтительно составляют в качестве вакцины, т.е. посредством смешивания вирусных частиц или вирусных белков, полученных из таких частиц (субъединичные вакцины), с подходящим фармацевтическим носителем, таким как солевой раствор или адъювант (например, соль алюминия или другой распространенный эксципиент) (смотри, например, http://www.cdc.gov/nip/publications/pink/Appendices/A/Excipient.pdf). Условно дефектные частицы вируса гриппа по изобретению также являются векторами-кандидатами для доставки чужеродных генов и для экспрессии чужеродного белка, так как функциональный ген можно вставить, например, между 5' и 3' последовательностями PA. В общем, изобретение относится к способу получения условно дефектной частицы вируса гриппа, возможно содержащей чужеродный сегмент нуклеиновой кислоты или сегмент нуклеиновой кислоты хозяина или его фрагмент, включающему в себя первую стадию трансфекции подходящей первой клетки или клеток одной или несколькими генными конструкциями, полученными посредством внутренней делеции нуклеиновой кислоты, кодирующей белок гриппа, в результате чего указанные генные конструкции неспособны к продукции функционального белка и не мешают упаковке генных сегментов вируса в вирусные частицы, и комплементирующими сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, кодирующими вирус гриппа, и одной или несколькими экспрессирующими плазмидами, способными к экспрессии указанных белков в указанной клетке, и получения, по меньшей мере, одной вирусной частицы из супернатанта указанной первой клетки или клеток в подходящий момент времени после трансфекции; и вторую стадию трансфекции подходящей второй клетки или клеток одной или несколькими экспрессирующими плазмидами, способными к экспрессии указанных белков в указанной клетке; и третью стадию инфекции указанной второй клетки или клеток супернатантом, содержащим, по меньшей мере, одну вирусную частицу, полученную из указанной первой клетки; и четвертую стадию, включающую в себя получение, по меньшей мере, одной вирусной частицы из супернатанта указанной второй клетки или клеток в подходящий момент времени после инфицирования. Таким образом, изобретение относится к способу получения условно дефектной частицы вируса гриппа, включающему в себя стадию трансфекции подходящей клетки или клеток одной или несколькими генными конструкциями, полученными посредством внутренней делеции нуклеиновой кислоты, кодирующей полимеразу гриппа, в результате чего указанные генные конструкции становятся неспособными к продукции функциональной полимеразы, но не мешают упаковке генных сегментов вируса в вирусные частицы, и комлементирующими сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, кодирующими вирус гриппа, и одной или несколькими экспрессирующими плазмидами, способными к экспрессии указанных полимераз в указанной клетке, и получения, по меньшей мере, одной вирусной частицы из супернатанта указанной клетки или клеток в подходящий момент времени после инфекции. Указанный способ получения условно дефектной частицы вируса гриппа включает в себя первую стадию трансфекции подходящей клетки или клеток одной или несколькими экспрессирующими плазмидами, способными к экспрессии полимераз гриппа в указанной клетке; и вторую стадию инфицирования указанной клетки или клеток супернатантом, содержащим условно дефектные частицы вируса гриппа; и третью стадию, включающую в себя получение, по меньшей мере, одной вирусной частицы из супернатанта указанной клетки или клеток в подходящий момент времени после инфекции, или способ получения условно дефектной частицы вируса гриппа, включающий в себя первую стадию трансфекции подходящей первой клетки или клеток одной или несколькими генными конструкциями, полученными посредством внутренней делеции нуклеиновой кислоты, кодирующей полимеразу гриппа, в результате чего указанные генные конструкции становятся неспособными к продукции функциональной полимеразы, но не препятствуют упаковке генных сегментов вируса в вирусные частицы, и комплементирующими сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, кодирующими вирус гриппа, и одной или несколькими экспрессирующими плазмидами, способными к экспрессии указанных полимераз в указанной клетке, и получения, по меньшей мере, одной вирусной частицы из супернатанта указанной первой клетки или клеток в подходящий момент времени после трансфекции; и вторую стадию трансфекции подходящей второй клетки или клеток одной или несколькими экспрессирующими плазмидами, способными к экспрессии указанных полимераз в указанной клетке; и третью стадию инфицирования указанной второй клетки или клеток супернатантом, содержащим, по меньшей мере, одну вирусную частицу, полученную из указанной первой клетки; и четвертой стадии, включающей в себя получение, по меньшей мере, одной вирусной частицы из супернатанта указанной второй клетки или клеток в подходящий момент времени после инфекции. В способах указанные полимеразы могут представлять собой, например, кислую полимеразу (PA), основную полимеразу 1 (PB1) или основную полимеразу 2 (PB2). Предпочтительно изобретение относится к способу, в результате которого внутренняя делеция является следствием внутренней делеции кодирующей полимеразу гриппа нуклеиновой кислоты, которая начинается от 5'-нуклеотида, расположенного между нуклеотидами 58 и 207, считая от некодирующей области, но не включая их, и заканчивается на 3'-нуклеотиде, расположенном между нуклеотидами 27 и 194, считая от некодирующей области, но не включая их, для белка PA, альтернативно начинается от 5'-нуклеотида, расположенного между нуклеотидами 43 и 246, считая от некодирующей области, но не включая их, и заканчивается на 3'-нуклеотиде, расположенном между нуклеотидами 24 и 197, считая от некодирующей области, но не включая их, для белка PB1, альтернативно начинается от 5'-нуклеотида, расположенного между нуклеотидами 34 и 234, считая от некодирующей области, но не включая их, и заканчивается на 3'-нуклеотиде, расположенном между нуклеотидами 27 и 209, считая от некодирующей области, но не включая их, для белка PB2. В другом варианте в эту внутреннюю делецию вставлен чужеродный фрагмент. Кроме того, изобретение относится к способу, в результате которого клетка или клетки для инфекции супернатантом, содержащим условно дефектные частицы вируса гриппа, уже экспрессирует нефункциональные полимеразы, такие как кислая полимераза (PA), основная полимераза 1 (PB1) или основная полимераза 2 (PB2), а частицы гриппа получают предоставленным в настоящем документе способом. Например, в настоящем документе описано, что клетка или клетки для трансфекции генными конструкциями и сегментами нуклеиновой кислоты уже экспрессирует нефункциональные полимеразы. В частности изобретение относится к частице вируса гриппа, содержащей один или несколько сегментов нуклеиновой кислоты с внутренней делецией в сегменте, делающей сегмент неспособным к продукции функциональной полимеразы гриппа, но не мешающей упаковке генных сегментов вируса в вирусные частицы, в соответствии с чем полимераза выбрана из группы кислой полимеразы (PA), основной полимеразы 1 (PB1) или основной полимеразы 2 (PB2). Предпочтительно, чтобы внутренняя делеция: начиналась от 5'-нуклеотида, расположенного между нуклеотидами 58 и 207, считая от некодирующей области, но не включая их, и заканчивалась на 3'-нуклеотиде, расположенном между нуклеотидами 27 и 194, считая от некодирующей области, но не включая их, для белка PA, начиналась от 5'-нуклеотида, расположенного между нуклеотидами 43 и 246, считая от некодирующей области, но не включая их, и заканчивалась на 3'-нуклеотиде, расположенном между нуклеотидами 24 и 197, считая от некодирующей области, но не включая их, для белка PB1, начиналась от 5'-нуклеотида, расположенного между нуклеотидами 34 и 234, считая от некодирующей области, но не включая их, и заканчивалась на 3'-нуклеотиде, расположенном между нуклеотидами 27 и 209, считая от некодирующей области, но не включая их, для белка PB2. В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к частице по изобретению с сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, кодирующими вирусные гликопротеины. Изобретение также относится к частице по изобретению с сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, кодирующими нуклеопротеин (NP), основную полимеразу 1 (PB1), основную полимеразу 2 (PB2), гемагглютинин (HA), нейраминидазу (NA), матриксные белки (M1 и M2) и неструктурный белок (NS1 и NS2), или частице с сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, кодирующими нуклеопротеин (NP), кислую полимеразу (PA), основную полимеразу 2 (PB2), гемагглютинин (HA), нейраминидазу (NA), матриксные белки (M1 и M2) и неструктурный белок (NS1 и NS2), или частице с сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, кодирующими нуклеопротеин (NP), кислую полимеразу (PA), основную полимеразу 1 (PB1), гемагглютинин (HA), нейраминидазу (NA), матриксные белки (M1 и M2) и неструктурный белок (NS1 и NS2). В частности изобретение относится к частице по изобретению с сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, полученными из вируса гриппа A. Изобретение также относится к частице по изобретению, содержащей нуклеиновую кислоту, не кодирующую пептид гриппа. Кроме того, изобретение относится к клетке, содержащей частицу по изобретению, в частности к клетке, содержащей одну или несколько полимераз вируса гриппа, в соответствие с чем полимераза выбрана из группы кислой полимеразы (PA), основной полимеразы 1 (PB1) или основной полимеразы 2 (PB2). Кроме того, изобретение относится к композиции, содержащей comprising частицу по изобретению или клетку или продукт, полученный из клетки по изобретению, применению такой композиции для получения фармацевтической композиции, предназначенной для создания иммунологической защиты против инфекции субъекта вирусом гриппа, и способу создания иммунологической защиты против инфекции субъекта вирусом гриппа, включающему в себя предоставление нуждающемуся в этом субъекту такой композиции. Кроме того, изобретение относится к применению частицы по изобретению для получения композиции, предназначенной для доставки в клетку нуклеиновой кислоты, не кодирующей пептид гриппа, и применению частицы по изобретению для получения фармацевтической композиции, предназначенной для доставки нуклеиновой кислоты, не кодирующей пептид гриппа в клетки субъекта. Такая нуклеиновая кислота (в настоящем документе называемая также чужеродной нуклеиновой кислотой) может кодировать чужеродный ген или фрагмент гена, кодирующий подходящий антигенный эпитоп или белок, или может кодировать участок нуклеотидов, способный препятствовать транскрипции нуклеиновой кислоты в клетке. В одном из вариантов осуществления изобретение относится к применению вирусной частицы гриппа по изобретению для получения композиции, предназначенной для доставки в клетку или клетку субъекта нуклеиновой кислоты, не кодирующей пептид гриппа. Кроме того, изобретение относится к способу доставки нуклеиновой кислоты, не кодирующей пептид гриппа, в клетку или субъекту, где способ включает в себя введение в указанную клетку или указанному субъекту дефектной частицы вируса гриппа, содержащей чужеродную нуклеиновую кислоту по изобретению.

Подписи к чертежам

Подпись к фиг.1

Получение и размножение условно дефектного вируса гриппа A. Сначала клетки 293T трансфицировали 7 двунаправленными плазмидами, кодирующими A/PR/8/34, pHMG-PA и, если подходило, pΔPA или pDIPA. Через 48 часов после трансфекции собирали супернатанты трансфицированных клеток и использовали для инокуляции клеток MDCK, а клетки MDCK 24 часами ранее были трансфицированы HMG-PA. Супернатант клеток MDCK-PA, положительный на репликацию вируса, пересевали на клетках MDCK и MDCK-PA 4 раза.

Подпись к фиг.2

Конструкции, используемые для получения условно дефектных вирусных частиц. Наверху показан генный сегмент PA дикого типа. Указаны некодирующие области (NCR) и инициаторные кодоны. pΔPA конструировали посредством расщепления pHW183, двунаправленной плазмиды, содержащей PA A/WSN/33 (9) StuI, и последующего повторного лигирования. pDIPA конструировали посредством клонирования нуклеотидов между 5' 194 и 3' 207 генного сегмента PA A/PR/8/34 в pSP72. Затем вставку трансфицировали в двунаправленный вектор обратной генетики. pΔPB1 и pΔPB2 конструировали, как описано в тексте.

Подпись к фиг.3

Анализ ОТ-ПЦР на присутствие генного сегмента PA в супернатантах rPR8-7, rPR8-ΔPA и rPR8-DIPA. Супернатанты после 4 пересева на MDCK-PA пропускали через 22 мкм фильтр и концентрировали центрифугированием. Затем выделяли РНК и проводили ОТ-ПЦР с применением праймеров, комплементарных к некодирующим областями сегмента PA. В качестве контроля использовали РНК, выделенную из A/PR/8/34 дикого типа. Дорожка 1: rPR8-7; дорожка 2: rPR8-ΔPA; дорожка 3 rPR8-DIPA; дорожка 4: A/PR/8/34 дикого типа. Размеры маркеров указаны слева.

Подпись к фиг.4

Дополнительные увеличенные части конструкции pΔPA, которые были удалены, приводя к pΔPA-2, pΔPA-3, pΔPA-4, pΔPA-5.

Подробное описание

Пример 1

Получение дефектных вирусных частиц гриппа из рекомбинантной ДНК

Вирус гриппа A представляет собой сегментированный вирус с антисмысловой цепью. Геном состоит из восьми генных сегментов. Все восемь функциональных генных сегмента необходимы для получения инфекционного вируса, т.е. репликационного вируса, который способен к неограниченным или, по меньшей мере, нескольким циклам репликации в клетках, обычно рассматриваемых как подходящие для репликации вируса гриппа. Как происходит процесс упаковки генных сегментов вируса гриппа A, случайным образом или посредством специфического механизма, обсуждается в течение многих лет. Описаны экспериментальные доказательства для обоих вариантов. Доказательством случайной упаковки является то, что агрегированные вирусные частицы обладают большей инфективностью, чем неагрегированные вирусные частицы (6), и то, что когда клеточную культуру инфицируют при низкой MOI, в некоторых инфицированных клетках отсутствует экспрессия одного из сегментов (8), что вместе указывает на то, что существуют вирионы, не содержащие целого генома вируса гриппа. Дополнительным доказательством случайной упаковки является то, что экспериментально получены вирусы гриппа, содержащие девять сегментов (4). Bancroft и Parslow выявили, что конкуренции между вРНК, происходящими из того же генного сегмента, для упаковки в вирион не было (1).

Одним из аргументов за процесс специфической упаковки является то, что хотя все генные сегменты в биомассе вируса находятся в равных количествах, в продуцирующих клетках они находятся в разных количествах (10). Кроме того, когда образуются дефектные интерферирующие (DI) частицы, DI вРНК замещает тот сегмент, из которого она получена (3) (дефектная интерферирующая частица представляет собой вирусную частицу, в которой в одном из генных сегментов присутствует большая внутренняя делеция. Эти частицы образуются, когда вирус пересевают при высокой MOI и предполагают, что они также образуются вследствие мутации R638A кислого белка полимеразы [Fodor et al; J. Virol. 77, 5017-5020, 2003]). Наконец эффективность образования вириона увеличивается при увеличении количества генных сегментов (5). Fujii et al. также показали область сегмента NA, необходимую для эффективного встраивания сегмента в вирион, а позднее та же группа также показала важную или упаковывающую в вирусную частицу область HA и NS [Fujii, 2005 #256; Watanabe, 2003 #184].

В настоящем документе авторы представляют доказательство специфической упаковки. Для получения вирусных частиц, содержащих только семь функциональных генных сегментов, необходимо определить, какой генный сегмент можно пропустить без прекращения образования вируса. В свете применения дефектного по репликации вируса в качестве вакцины, HA и NA пропускать не следует, и ни MA, ни NS, так как в этом случае необходимо 2 отдельных экспрессирующих плазмиды. Авторы получили вирус с отсутствием гена полимеразы. Авторы не смогли получить вирус, когда делетированный генный сегмент не был транскомплементирован экспрессионной плазмидой (таблица 1, 2 и 3, rPR8-7ntc). Вирус можно получать при трансфекции семи генных сегментов и плазмиды, экспрессирующей белок, в норме экспрессируемый делетированным генным сегментом при очень низких титрах (таблица 1, 2 и 3, rPR8-7). Таким образом, были получены делеционные мутанты генных сегментов 1, 2 и 3 вируса гриппа A/WSN/33, несущие внутреннюю делецию из 1032, 528 и 1120 нуклеотидов, соответственно. Эти делеционные мутанты были обозначены pΔPB2, pΔPB1 и pΔPA (смотри фиг.2). Клетки 293T трансфицировали, как описано ранее (de Wit, E., M. I. Spronken, T. M. Bestebroer, G. F. Rimmelzwaan, A. D. Osterhaus and R. A. Fouchier. 2004. Efficient generation and growth of influenza virus A/PR/8/34 from eight cDNA fragments. Virus Res 103:155-61) каждым одним из этих делетированных генных сегментов и семью комплементирующими двунаправленными конструкциями, кодирующими A/PR/8/34 (De Wit et al, 2004) и соответствующей экспрессирующей плазмидой. Через 48 часов после трансфекции собирали супернатанты. Затем, как описано ранее (2), трансфицировали клетки MDCK одной из экспрессирующих плазмид HMG-PB2, HMG-PB1 или HMG-PA. Эти трансфицированные клетки инокулировали с соответствующим супернатантом трансфицированных клеток 293T (смотри фиг.1 для объяснения процедуры эксперимента). Репликацию вируса в этих клетках MDCK определяли посредством анализа HA. Исходно репликации вируса в нетрансфицированных клетках MDCK не было. Репликация вируса показана в клетках MDCK трансфицированных HMG-PB2, HMG-PB1 или HMG-PA, инокулированных вместе с соответствующим супернатантом. Далее авторы клонировали дефектный генный сегмент PA на основе последовательности дефектной интерферирующей вРНК PA вируса гриппа A/PR/8/34, полученной из базы данных последовательностей вируса гриппа (www.flu.lanl.gov, инвентарный номер K00867). Участок между 5'-нуклеотидом 207 и 3'-нуклеотидом 194 PA амплифицировали ПЦР и клонировали в двунаправленный транскрипционный вектор, полученный из pHW2000 (7), который модифицировали, как описано ранее (De Wit et al., 2004). Полученную плазмиду назвали pDIPA (смотри фиг.2). Клетки 293T трансфицировали pDIPA, HMG-PA и 7 двунаправленными конструкциями, кодирующими оставшиеся генные сегменты вируса гриппа A/PR/8/34 (смотри фиг.2). Супернатант собирали через 48 часов после трансфекции, а затем клетки MDCK, 24 часами ранее инфицированные HMG-PA, инокулировали этим супернатантом. Через 72 часа после инокуляции провели анализ HA на супернатантах этих клеток MDCK и обнаружили его положительным, что указывало на репликацию вируса в этих клетках. Инокуляция нетрансфицированных клеток MDCK также не приводила к продукции вируса, как определено анализом HA. Последующее пересевание супернатантов, содержащих дефектные по PA вирусные частицы на клетки MDCK, нетрансфицированные или трансфицированные HMG-PA, приводило к тому же результату (таблица 1). До 4 пассажа вирус продуцировался в клетках MDCK, трансфицированных HMG-PA. Супернатант MDCKp4 последовательно разводили с получением указанного титра вируса, который, как показано, составлял приблизительно 10⁴ TCID₅₀/мл.

Используемыми стадиями способа были: клетки 293T трансфицировали (для протокола трансфекции смотри De Wit et al., 2004) одной из конструкций pΔPB2, pΔPB1, pΔPA, pΔNP, семью комплементирующими конструкциями, кодирующими A/PR/8/34 (De Wit et al., 2004) и одной из HMG-PB2, HMG-PB1, HMG-PA (экспрессирующие плазмиды, например, описаны в Pleschka, S., R. Jaskunas, O. G. Engelhardt, T. Zurcher, P. Palese and A. Garcia-Sastre. 1996. A plasmid-based reverse genetics system for influenza A virus. J Virol 70:4188-92; получены у A. Garcia-Sastre и P. Palese). Через 48 часов после трансфекции супернатант трансфицированных клеток 293T собирают. Когда продуцируются вирусы, они присутствуют в супернатанте. С этого времени клетки MDCK трансфицируют (для протокола трансфекции смотри Basler et al., 2000) одной из экспрессирующих плазмид HMG-PB2, HMG-PB1, HMG-PA (в зависимости от используемого делеционного мутанта, так в случае использования pΔPB2 клетки MDCK трансфицируют HMG-PB2), так как у продуцируемых вирусов отсутствует генный сегмент, экспрессирующий белок, так как в них упаковался генных сегмент с внутренней делецией. Через 24 часа после трансфекции трансфицированные клетки MDCK инокулируют супернатантами, полученными из трансфицированных клеток 293T. Когда вирус присутствует в супернатанте 293T, этот вирус будет реплицироваться в трансфицированных клетках MDCK и образуется большее количество вируса. Этот супернатант можно снова собрать через 72 часа после инокуляции.

Для доказательства того, что не происходило рекомбинации PA или DIPA, приводящей к функциональном генному сегменту PA, из супернатанта MDCKp4 выделяли РНК. Сначала супернатанты пропускали через 22 мкм фильтр и концентрировали центрифугированием. Затем выделяли РНК и проводили ОТ-ПЦР с применением праймеров, комплементарных некодирующим областям сегмента PA. ОТ-ПЦР, проведенная с праймерами, специфичными к вРНК PA, показала, что ΔPA и DIPA остаются стабильными в течение нескольких пересевов. В супернатанте клеток MDCK, инфицированных вирусными частицами DIPA, появлялась отчетливая полоса приблизительно из 400 п.н., в супернатанте клеток MDCK, инфицированных вирусом, содержащим ΔPA, появлялась полоса из 1100 п.н. В супернатанте клеток MDCK, инфицированных A/PR/8/34 дикого типа, видно полосу приблизительно из 2300 п.н. (фиг.3). Эти результаты указывают на то, что генный сегмент ΔPAPR8 стабильно упаковывается в вирионы.

Для получения вирусов с отсутствием PB2 клетки 293T трансфицировали 7 двунаправленными конструкциями (Hoffmann, E., G. Neumann, Y. Kawaoka, G. Hobom and R. G. Webster. 2000. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proc Natl Acad Sci USA 97:6108-13.), кодирующими генные сегменты 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 вируса гриппа A/PR/8/34 (de Wit, E., M. I. Spronken, T. M. Bestebroer, G. F. Rimmelzwaan, A. D. Osterhaus and R. A. Fouchier. 2004. Efficient generation and growth of influenza virus A/PR/8/34 from eight cDNA fragments. Virus Res 103:155-61), что приводило к экспрессии вРНК и мРНК. Котрансфецировали плазмиду, экспрессирующую PB2 A/PR/8/34, pHMG-PB2 (Pleschka, S., R. Jaskunas, O. G. Engelhardt, T. Zurcher, P. Palese and A. Garcia-Sastre. 1996. A plasmid-based reverse genetics system for influenza A virus. J Virol 70:4188-92). В качестве контроля трансфицировали только 7 двунаправленных конструкций, кодирующих A/PR/8/34, исключая pHMG-PB2. Супернатанты собирали через 48 часов после трансфекции и инокулировали в клетки MDCK или клетки MDCK, 24 часами ранее трансфицированные pHMG-PB2 (MDCK-PB2) в 100 мм чашках. Через трое суток после инокуляции супернатант инокулированных клеток MDCK тестировали на активность гемагглютинина с применением эритроцитов индейки в качестве индикатора образования вируса. Вирусов в клетках, инокулированных супернатантом клеток 293T, трансфицированных только 7 генными сегментами, без pHMG-PB2 не выявлено (rPR8-7ntc, таблица 2). Супернатант клеток MDCK-PB2, инокулированных супернатантом клеток 293T, трансфицированных 7 генными сегментами и pHMG-PB2, был положительным. Затем, супернатант rPR8-7 пересевали в клетки MDCK и MDCK-PB2. rPR8-7 реплицировался в клетках MDCK-PB2, но не в клетках MDCK (таблица 2). Затем авторы получили мутант с делецией 1032 нуклеотида в генном сегменте 1 вируса гриппа A/WSN/33, что привело к делеции 344 аминокислот (pΔPB2, фиг.2). Образовывался рекомбинантный вирус, содержащий ΔPB2 (rPR8-ΔPB2), как описано выше (фиг. 1). Вирус в клетках MDCK выявить не могли, тогда как в клетках MDCK-PB2, инокулированных rPR8-ΔPB2, вирус выявляли. После пересева rPR8-ΔPB2 свидетельств продукции вируса в клетках MDCK не было в отличие от клеток MDCK-PB2 (таблица 2).

Также получали вирусы с отсутствием PB1. Клетки 293T трансфицировали 7 двунаправленными конструкциями, кодирующими генные сегменты 1, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 вируса гриппа A/PR/8/34, что приводило к экспрессии вРНК и мРНК. Котрансфецировали плазмиду, экспрессирующую PB1 A/PR/8/34, pHMG-PB1. В качестве контроля трансфицировали только 7 двунаправленных конструкций, кодирующих A/PR/8/34, за исключением pHMG-PB1. Супернатанты собирали через 48 часов после трансфекции и инокулировали в клетки MDCK или клетки MDCK, 24 часами ранее трансфицированные pHMG-PB1 (MDCK-PB1) в 100 мм чашке (2) (фиг. 1). Через трое суток после инокуляции супернатант инокулированных клеток MDCK тестировали на активность гемагглютинина с применением эритроцитов индейки в качестве индикатора образования вируса. Вирусов в клетках, инокулированных супернатантом клеток 293T, трансфицированных только 7 генными сегментами, без pHMG-PB1 не выявлено (rPR8-7ntc, таблица 3). Супернатант клеток MDCK-PB1, инокулированных супернатантом клеток 293T, трансфицированных 7 генными сегментами и pHMG-PB1, был положительным. Затем, супернатант rPR8-7 пересевали в клетки MDCK и MDCK-PB1. rPR8-7 реплицировался в клетках MDCK-PB1, но не в клетках MDCK (таблица 3). Затем авторы получили мутант с делецией 528 нуклеотидов в генном сегменте 2 вируса гриппа A/WSN/33, что привело к делеции 178 аминокислот (pΔPB1, фиг.2). Образовывался рекомбинантный вирус, содержащий ΔPB1 (rPR8-ΔPB1), как описано выше (фиг. 1). Вирус в клетках MDCK выявить не могли, тогда как в клетках MDCK-PB1, инокулированных rPR8-ΔPB1, вирус выявляли. После пересева rPR8-ΔPB1 свидетельств продукции вируса в клетках MDCK не было в отличие от клеток MDCK-PB1 (таблица 3).

Таким образом, авторы смогли получить вирусы с отсутствием сегментов 1, 2 или 3, посредством получения конструкций pΔPB2, pΔPB1 или pΔPA/pDIPA и транскомплементации с применением направляемых РНК-полимеразой II экспрессирующих плазмид PB2, PB1 или PA, как описано выше. Описанные в настоящем документе условно дефектные вирусы могут проходить только один цикл репликации в клетках без транскомплементации, но их можно выращивать в транскомплементированных клеточных линиях. Это представляет собой первый раз, когда с применением обратной генетики получают дефектные вирусы, которые содержат только семь функциональных генных сегментов и которые могут проходить один цикл репликации или несколько циклов репликации, когда дефектный генный сегмент транскомплементирован.

Полученные таким образом дефектные вирусные частицы представляют собой кандидаты для вакцин, так как они могут проходить один цикл репликации без образования инфекционного вируса. Результатом этого одного цикла репликации является то, что вакцина индуцирует гуморальный и клеточный иммунный ответ. Несмотря на тот факт, что эти дефектные частицы не реплицируются в обычных клетках, с целью получения большие количества вируса можно выращивать в клеточной линии, экспрессирующей дефектный белок. Как показали авторы, несколько циклов репликации не влияют на генотип вируса. Кроме использования дефектных вирусных частиц в качестве вакцины, они также являются векторами-кандидатами для доставки генов и для экспрессии чужеродных белков, так как функциональный ген можно вставить между 5'- и 3'-последовательностями PA, PB2 или PB1. Это также показано Watanabe et al. (11), которые заменили чужеродными генами и HA, и NA и еще могли получать вирус.

Дальнейшие укорочения pΔPA

Кроме того, большие удаляемые части конструкции pΔPA приводили к pΔPA-2, pΔPA-3, pΔPA-4, pΔPA-5 (фиг.4). Клетки 293T трансфицировали, как описано ранее (De Wit et al., 2004), каждым одним из этих делетированных генных сегментов и семью комплементирующими двунаправленными конструкциями, кодирующими A/PR/8/34 (De Wit et al, 2004), и экспрессирующей плазмидой, экспрессирующей PA. Супернатанты собирали через 48 часов после трансфекции. Затем трансфицировали клетки MDCK, как описано ранее (Basler, C. F., et al., 2000. Proc Natl Acad Sci USA 97:12289-94), экспрессирующей плазмидой HMG-PA. Эти трансфицированные клетки и нетрансфицированные клетки инокулировали супернатантами трансфицированных клеток 293T. Посредством анализа HA в этих клетках MDCK и MDCK-PA определяли репликацию вируса. В нетрансфицированных клетках MDCK репликации вируса не наблюдали. В клетках MDCK, трансфицированных HMG-PA, инокулированных одним из супернатантов, наблюдали репликацию вируса. Таким образом, все вРНК, полученные из этих конструкций, упаковывались в вирионы (таблица 4).

Таблица 1
Репликация рекомбинантных вирусов гриппа A/PR/8/34 с отсутствием исходного генного сегмента PA в клетках MDCK и MDCK-PA Вирус Гемагглютинирующая активность в супернатантах Титр вируса MDCK MDCK-PA TCID₅₀/мл 5 P1 P2 P3 P4 P1 P2 P3 P4 P1 P4 rPR8-7ntc¹ - - - - - - - - - - rPR8-7 - - - - + + + + 5,6·10¹ < 10¹ rPR8-deltaPA - - - - + + + + 3,1·10⁵ 3,1·10⁴ rPR8-DIPA - - - - + + + + 3,1·10⁴ 3,1·10⁴ rPR180-wt + + + + + + + + 1,0·10⁷ н.о. ntc: не транскомплементированный (в клетки 293T не трансфицировали pHMG-PA)

Таблица 2
Репликация рекомбинантных вирусов гриппа A/PR/8/34 с отсутствием исходного генного сегмента PB2 в клетках MDCK и MDCK-PB2 Вирус Гемагглютинирующая активность в супернатантах MDCK MDCK-PB2 p1 p2 p1 p2 rPR8-7ntc - - - - rPR8-7 - - + + rPR8-pΔPB2 - - + + rPR8 + + + + ntc: не транскомплементированный (в клетки 293T не трансфицировали pHMG-PB2)

Таблица 3
Репликация рекомбинантных вирусов гриппа A/PR/8/34 с отсутствием исходного генного сегмента PB1 в клетках MDCK и MDCK-PB1 Вирус Гемагглютинирующая активность в супернатантах MDCK MDCK-PB1 p1 p2 p1 p2 rPR8-7ntc - - - - rPR8-7 - - + + rPR8-pΔPB1 - - + + rPR8 + + + + ntc: не транскомплементированный (в клетки 293T не трансфицировали pHMG-PB1)

Таблица 4
Репликация рекомбинантных вирусов гриппа A/PR/8/34 с отсутствием исходного генного сегмента PA в клетках MDCK-PA и MDCK Вирус, содержащий Репликация вируса в MDCK-PA MDCK pΔPA + - pΔPA-2 + - pΔPA-3 + - pΔPA-4 + - pΔPA-5 + -

Пример 2

Вакцинация дефектным рекомбинантным вирусом

Условно дефектный рекомбинантный вирус с отсутствием функционального гена PA, PB1 или PB2 получали, как описано в настоящем документе на основе высокопроизводительной вирусной основы (например, полученной из вакцинного штамма A/PR/8/34) с генами HA и NA релевантного эпидемического вируса (например, A/Moscow/10/99). Условно дефектный вирус получали посредством трансфекции, при этом экспрессии белка полимеразы достигали посредством транскомплементации. Затем вирус Амплифицировали в подходящем клеточном субстрате, таком как клетки MDCK или клетки Vero, стабильно экспрессирующие релевантную полимеразу. Супернатант с вирусом очищали центрифугированием в течение 10 мин при 1000g. Вирус концентрировали и очищали ультрацентрифугированием в 20-60% сахарозном градиенте, осаждали и ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS). Чистоту и количество препарата вируса подтверждали с применением полиакриламидных гелей с 12,5% SDS, окрашенных кумасси бриллиантовым синим, а титр вируса условно дефектного вируса определяли посредством инфекции клеток MDCK и клеток MDCK, экспрессирующих соответствующую полимеразу, и окрашивания моноклональным антителом к нуклеопротеину. Мышам интратрахеально или интраназально с применением распылителя инокулировали 1×10⁵ 50%-ной инфицирующей тканевую культуру дозы (TCID-50). Титры антител к HA, NA и внутренним белкам вируса гриппа в образцах сыворотки, собранных до и после вакцинации, определяют с применением анализа ингибирования гемагглютинации, анализов ингибирования нейраминидазы, ELISA или анализа нейтрализации вируса. Антигенспецифический клеточный иммунный ответ у вакцинированных животных количественно определяют, измеряя внутриклеточную экспрессию цитокинов посредством проточной цитометрии, тетрамерного окрашивания CD4- и CD8-положительных клеток, цитолитической активности, T-клеточной пролиферации и т.д. Вакцинированных и контрольных животных стимулировали через 6 недель после вакцинации с применением 1×10⁶ TCID-50 вируса гриппа A/Moscow/10/99 или гетерологичного вирусного изолята. После стимуляции у животных собирали образцы назальных и фарингеальных мазков ежесуточно в течение 10 суток и посредством анализа количественной ПЦР или титрования вируса определяли количество вируса, выделяемое инфицированными животными. Индуцированный вакциной приобретенный гуморальный иммунитет определяли посредством количественного подсчета увеличения титров антител, индуцированный вакциной приобретенный клеточный иммунитет - посредством увеличения ответов хелперных и цитотоксических T-клеток, а общий уровень иммунитета посредством подтверждения защиты от инфекции при стимуляции вирусом.

ССЫЛКИ

1. Bancroft, С. Т., and Т. G. Parslow. 2002. Evidence for segment-nonspecific packaging of the influenza a virus genome. J Virol 76:7133-9.

2. Basler, C. F., X. Wang, E. Muhlberger, V. Volchkov, J. Paragas, H. D. Klenk, A. Garcia-Sastre, and P. Palese. 2000. The Ebola virus VP35 protein functions as a type IIFN antagonist. Proc Natl Acad Sci U S A 97:12289-94.

3. Duhaut, S. D., and J. W. McCauley. 1996. Defective RNAs inhibit the assembly of influenza virus genome segments in a segment-specific manner. Virology 216:326-37.

4. Enami, M., G. Sharma, C. Benham, and P. Palese. 1991. An influenza virus containing nine different RNA segments. Virology 185:291-8.

5. Fujii, Y., H. Goto, T. Watanabe, T. Yoshida, and Y. Kawaoka. 2003. Selective incorporation of influenza virus RNA segments into virions. Proc Natl Acad Sci U S A 100:2002-2007.

6. Hirst, G. K., and M. W. Pons. 1973. Mechanism of influenza recombination. II. Virus aggregation and its effect on plaque formation by so-called noninfective virus. Virology 56:620-31.

7. Hoffmann, E., G. Neumann, Y. Kawaoka, G. Hobom, and R. G. Webster. 2000. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proc Natl Acad Sci U S A 97:6108-13.

8. Martin, K., and A. Helenius. 1991. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: the viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import. Cell 67:117-30.

9. Neumann, G., T. Watanabe, and Y. Kawaoka. 2000. Plasmid-driven formation of influenza virus-like particles. J Virol 74:547-51.

10. Smith, G. L., and A. J. Hay. 1982. Replication of the influenza virus genome. Virology 118:96-108.

11. Watanabe, Т., S. Watanabe, T. Noda, Y. Fujii, and Y. Kawaoka. 2003. Exploitation of Nucleic Acid Packaging Signals To Generate a Novel Influenza Virus-Based Vector Stably Expressing Two Foreign Genes. J Virol 77:10575- 10583.

Изобретение относится к области вирусологии и биотехнологии. Раскрыта условно дефектная частица вируса гриппа с отсутствием сегмента нуклеиновой кислоты вируса гриппа, выбранного из группы сегментов, в основном кодирующих кислую полимеразу (РА), основную полимеразу 1 (РВ1) и основную полимеразу 2 (РВ2). Условно дефектная частица вируса гриппа используется для индукции иммунной защиты против вируса гриппа. Также описан способ получения таких частиц, фармацевтическая композиция, содержащая такие частицы, ее применение и способ индукции иммунной защиты против вируса гриппа. Изобретение может быть использовано в медицине. 16 н. и 33 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 табл.

1. Способ получения условно дефектной частицы вируса гриппа, включающий стадию трансфекции подходящей клетки или клеток одной или несколькими генными конструкциями, полученными путем внутренней делеции нуклеиновой кислоты, кодирующей полимеразу гриппа, причем генные конструкции неспособны продуцировать функциональную полимеразу, но не препятствуют упаковке генных сегментов вируса в вирусные частицы,
и комплементирующими сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, кодирующими вирус гриппа,
и одной или несколькими экспрессионными плазмидами, способными экспрессировать указанные полимеразы в указанной клетке,
и сбор по меньшей мере одной условно дефектной частицы вируса гриппа из супернатанта указанной клетки или клеток в подходящий момент времени после инфекции.

2. Способ по п.1, где внутренняя делеция является результатом внутренней делеции нуклеиновой кислоты, кодирующей полимеразу гриппа:
начинающейся с 5'-нуклеотида, расположенного между, но не включая их, нуклеотидами 58 и 207, считая от некодирующей области, и заканчивающейся на 3'-нуклеотиде, расположенном между, но не включая их, нуклеотидами 27 и 194, считая от некодирующей области белка РА, начинающейся с 5'-нуклеотида, расположенного между, но не включая их, нуклеотидами 43 и 246, считая от некодирующей области, и заканчивающейся на 3'-нуклеотиде, расположенном между, но не включая их, нуклеотидами 24 и 197, считая от некодирующей области белка РВ 1, начинающейся с 5'-нуклеотида, расположенного между, но не включая их, нуклеотидами 34 и 234, считая от некодирующей области, и заканчивающейся на 3'-нуклеотиде, расположенном между, но не включая их, нуклеотидами 27 и 209, считая от некодирующей области белка РВ2.

3. Способ по п.1 или 2, где указанная полимераза представляет собой кислую полимеразу (РА).

4. Способ по п.1 или 2, где указанная полимераза представляет собой основную полимеразу 1 (РВ1).

5. Способ по п.1 или 2, где указанная полимераза представляет собой основную полимеразу 2 (РВ2).

6. Способ получения условно дефектной частицы вируса гриппа, включающий
первую стадию трансфекции подходящей клетки или клеток одной или несколькими экспрессионными плазмидами, способными к экспрессии полимераз гриппа в указанной клетке;
и вторую стадию инфицирования указанной клетки или клеток супернатантом, содержащим условно дефектные частицы вируса гриппа, как определено в п.1, неспособные продуцировать функциональную полимеразу гриппа;
и третью стадию, включающую сбор по меньшей мере одной условно дефектной частицы вируса гриппа из супернатанта указанной клетки или клеток в подходящий момент времени после инфекции.

7. Способ по п.6, где клетка или клетки, которые инфицируют супернатантом, содержащим условно дефектные частицы вируса гриппа, уже экспрессируют нефункциональные полимеразы.

8. Способ по любому из пп.6 или 7, где указанная полимераза представляет собой кислую полимеразу (РА).

9. Способ по любому из пп.6 или 7, где указанная полимераза представляет собой основную полимеразу 1 (РВ1).

10. Способ по любому из пп.6 или 7, где указанная полимераза представляет собой основную полимеразу 2 (РВ2).

11. Способ получения условно дефектной частицы вируса гриппа, включающий
первую стадию трансфекции подходящей первой клетки или клеток одной или несколькими генными конструкциями, полученными путем внутренней делеции нуклеиновой кислоты, кодирующей полимеразу гриппа, при этом указанные генные конструкции неспособны продуцировать функциональную полимеразу, но не препятствуют упаковке генных сегментов вируса в вирусные частицы,
и комплементирующими сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, кодирующими вирус гриппа,
и одной или несколькими экспрессионными плазмидами, способными экспрессировать указанные полимеразы в указанной клетке,
и сбор по меньшей мере одной условно дефектной частицы вируса гриппа из супернатанта указанной первой клетки или клеток в подходящий момент времени после трансфекции;
и вторую стадию трансфекции подходящей второй клетки или клеток одной или несколькими экспрессионными плазмидами, способными экспрессировать указанные полимеразы в указанной клетке;
и третью стадию инфицирования указанной второй клетки или клеток супернатантом, содержащим по меньшей мере одну условно дефектную частицу вируса гриппа, полученную из указанной первой клетки;
и четвертую стадию, включающую сбор по меньшей мере одной условно дефектной частицы вируса гриппа из супернатанта указанной второй клетки или клеток в подходящий момент времени после инфекции.

12. Способ по п.11, где указанная полимераза представляет собой кислую полимеразу (РА).

13. Способ по п.11, где указанная полимераза представляет собой основную полимеразу 1 (РВ1).

14. Способ по п.11, где указанная полимераза представляет собой основную полимеразу 2 (РВ2).

15. Способ по п.11, где внутренняя делеция является результатом внутренней делеции нуклеиновой кислоты, кодирующей полимеразу гриппа:
начинающейся с 5'-нуклеотида, расположенного между, но не включая их, нуклеотидами 58 и 207, считая от некодирующей области, и заканчивающейся на 3'-нуклеотиде, расположенном между, но не включая их, нуклеотидами 27 и 194, считая от некодирующей области белка РА, начинающейся с 5'-нуклеотида, расположенного между, но не включая их, нуклеотидами 43 и 246, считая от некодирующей области, и заканчивающейся на 3'-нуклеотиде, расположенном между, но не включая их, нуклеотидами 24 и 197, считая от некодирующей области белка РВ1, начинающейся с 5'-нуклеотида, расположенного между, но не включая их, нуклеотидами 34 и 234, считая от некодирующей области, и заканчивающейся на 3'-нуклеотиде, расположенном между, но не включая их, нуклеотидами 27 и 209, считая от некодирующей области белка РВ2.

16. Способ по п.15, где клетка или клетки, которые инфицируют супернатантом, содержащим условно дефектные частицы вируса гриппа, уже экспрессируют нефункциональные полимеразы.

17. Способ по п.15 или 16, где указанная полимераза представляет собой кислую полимеразу (РА).

18. Способ по п.15 или 16, где указанная полимераза представляет собой основную полимеразу 1 (РВ1).

19. Способ по п.15 или 16, где указанная полимераза представляет собой основную полимеразу 2 (РВ2).

20. Условно дефектная частица вируса гриппа, полученная способом по любому из пп.1-19, для индукции иммунной защиты против вируса гриппа.

21. Частица по п.20 с сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, кодирующими вирусные гликопротеины.

22. Частица по п.20 с сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, кодирующими нуклеопротеин (NP), основную полимеразу 1 (РВ1), основную полимеразу 2 (РВ2), гемагглютинин (НА), нейраминидазу (NA), матриксные белки (M1 и М2) и неструктурный белок (NS1 и NS2).

23. Частица по п.20 с сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, кодирующими нуклеопротеин (NP), кислую полимеразу (РА), основную полимеразу 2 (РВ2), гемагглютинин (НА), нейраминидазу (NA), матриксные белки (M1 и М2) и неструктурный белок (NS1 и NS2).

24. Частица по п.20 с сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, кодирующими нуклеопротеин (NP), кислую полимеразу (РА), основную полимеразу 1 (РВ1), гемагглютинин (НА), нейраминидазу (NA), матриксные белки (M1 и М2) и неструктурный белок (NS1 и NS2).

25. Частица по п.20 с сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, полученными из вируса гриппа А.

26. Условно дефектная частица вируса гриппа, содержащая один или несколько сегментов нуклеиновой кислоты с внутренней делецией в сегменте, делающей сегмент неспособным продуцировать функциональную полимеразу гриппа, но не препятствующая упаковке генных сегментов вируса в вирусные частицы, при этом полимераза выбрана из группы кислой полимеразы (РА), основной полимеразы 1 (РВ1) или основной полимеразы 2 (РВ2), для индукции иммунной защиты против вируса гриппа.

27. Частица по п.26 с сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, кодирующими вирусные гликопротеины.

28. Частица по п.26 с сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, кодирующими нуклеопротеин (NP), основную полимеразу 1 (РВ1), основную полимеразу 2 (РВ2), гемагглютинин (НА), нейраминидазу (NA), матриксные белки (M1 и М2) и неструктурный белок (NS1 и NS2).

29. Частица по п.26 с сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, кодирующими нуклеопротеин (NP), кислую полимеразу (РА), основную полимеразу 2 (РВ2), гемагглютинин (НА), нейраминидазу (NA), матриксные белки (M1 и М2) и неструктурный белок (NS1 и NS2).

30. Частица по п.26 с сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, кодирующими нуклеопротеин (NP), кислую полимеразу (РА), основную полимеразу 1 (РВ1), гемагглютинин (НА), нейраминидазу (NA), матриксные белки (M1 и М2) и неструктурный белок (NS1 и NS2).

31. Частица по п.26 с сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, полученными из вируса гриппа А.

32. Условно дефектная частица вируса гриппа, содержащая один или несколько сегментов нуклеиновой кислоты с внутренней делецией в сегменте, делающей сегмент неспособным продуцировать функциональную полимеразу гриппа, но не препятствующая упаковке генных сегментов вируса в вирусные частицы, при этом полимераза выбрана из группы кислой полимеразы (РА), основной полимеразы 1 (РВ1) или основной полимеразы 2 (РВ2), а внутренняя делеция:
начинается с 5'-нуклеотида, расположенного между, но не включая их, нуклеотидами 58 и 207, считая от некодирующей области, и заканчивается на 3'-нуклеотиде, расположенном между, но не включая их, нуклеотидами 27 и 194, считая от некодирующей области белка РА,
начинается с 5'-нуклеотида, расположенного между, но не включая их, нуклеотидами 43 и 246, считая от некодирующей области, и заканчивается на 3'-нуклеотиде, расположенном между, но не включая их, нуклеотидами 24 и 197, считая от некодирующей области белка РВ1,
начинается с 5'-нуклеотида, расположенного между, но не включая их, нуклеотидами 34 и 234, считая от некодирующей области, и заканчивается на 3'-нуклеотиде, расположенном между, но не включая их, нуклеотидами 27 и 209, считая от некодирующей области белка РВ2, для индукции иммунной защиты против вируса гриппа.

33. Частица по п.32 с сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, кодирующими вирусные гликопротеины.

34. Частица по п.32 с сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, кодирующими нуклеопротеин (NP), основную полимеразу 1 (РВ1), основную полимеразу 2 (РВ2), гемагглютинин (НА), нейраминидазу (NA), матриксные белки (M1 и М2) и неструктурный белок (NS1 и NS2).

35. Частица по п.32 с сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, кодирующими нуклеопротеин (NP), кислую полимеразу (РА), основную полимеразу 2 (РВ2), гемагглютинин (НА), нейраминидазу (NA), матриксные белки (M1 и М2) и неструктурный белок (NS1 и NS2).

36. Частица по п.32 с сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, кодирующими нуклеопротеин (NP), кислую полимеразу (РА), основную полимеразу 1 (РВ1), гемагглютинин (НА), нейраминидазу (NA), матриксные белки (M1 и М2) и неструктурный белок (NS1 и NS2).

37. Частица по п.32 с сегментами нуклеиновой кислоты вируса гриппа, полученными из вируса гриппа А.

38. Условно дефектная частица вируса гриппа, содержащая нуклеиновую кислоту, не кодирующую пептид гриппа, для доставки нуклеиновой кислоты, не кодирующей пептид гриппа, в клетку, выбранная из группы, состоящей из:
частицы, полученной способом по любому из пп.1-19;
частицы, содержащие один или несколько сегментов нуклеиновой кислоты с внутренней делецией в сегменте, делающей сегмент неспособным продуцировать функциональную полимеразу гриппа, но не препятствующая упаковке генных сегментов вируса в вирусные частицы, при этом полимераза выбрана из группы кислой полимеразы (РА), основной полимеразы 1 (РВ1) или основной полимеразы 2 (РВ2);
частицы, содержащей один или несколько сегментов нуклеиновой кислоты с внутренней делецией в сегменте, делающей сегмент неспособным продуцировать функциональную полимеразу гриппа, но не препятствующая упаковке генных сегментов вируса в вирусные частицы, при этом полимераза выбрана из группы кислой полимеразы (РА), основной полимеразы 1 (РВ1) или основной полимеразы 2 (РВ2), а внутренняя делеция:
начинается с 5'-нуклеотида, расположенного между, но не включая их, нуклеотидами 58 и 207, считая от некодирующей области, и заканчивается на 3'-нуклеотиде, расположенном между, но не включая их, нуклеотидами 27 и 194, считая от некодирующей области белка РА, начинается с 5'-нуклеотида, расположенного между, но не включая их, нуклеотидами 43 и 246, считая от некодирующей области, и заканчивается на 3'-нуклеотиде, расположенном между, но не включая их, нуклеотидами 24 и 197, считая от некодирующей области белка РВ1, начинается с 5'-нуклеотида, расположенного между, но не включая их, нуклеотидами 34 и 234, считая от некодирующей области, и заканчивается на 3'-нуклеотиде, расположенном между, но не включая их, нуклеотидами 27 и 209, считая от некодирующей области белка РВ2.

39. Клетка, содержащая частицу по любому из пп.20-37, продуцирующая указанные частицы.

40. Клетка по п.39, содержащая одну или несколько полимераз вируса гриппа, при этом полимераза выбрана из группы кислой полимеразы (РА), основной полимеразы 1 (РВ1) или основной полимеразы 2 (РВ2).

41. Клетка, содержащая частицу по п.38, продуцирующая указанные частицы.

42. Клетка по п.41, содержащая одну или несколько полимераз вируса гриппа, при этом полимераза выбрана из группы кислой полимеразы (РА), основной полимеразы 1 (РВ1) или основной полимеразы 2 (РВ2).

43. Фармацевтическая композиция, предназначенная для индукции иммунной защиты против инфекции, вызванной вирусом гриппа, у индивида, содержащая частицу по любому из пп.20-37, или клетку, или продукт, полученный из клетки по любому из пп.39 или 40.

44. Применение композиции по п.43 для получения фармацевтической композиции, предназначенной для индукции иммунной защиты против инфекции, вызванной вирусом гриппа, у индивида.

45. Способ индукции иммунной защиты против инфекции, вызванной вирусом гриппа, у индивида, включающий введение индивиду эффективного количества композиции по п.43.

46. Применение частицы по п.38 для получения композиции, предназначенной для доставки нуклеиновой кислоты, не кодирующей пептид гриппа, в клетку.

47. Применение частицы по п.38 для получения фармацевтической композиции, предназначенной для доставки нуклеиновой кислоты, не кодирующей пептид гриппа, в клетки индивида.

48. Способ доставки нуклеиновой кислоты, не кодирующей пептид гриппа, в клетку, включающий введение в указанную клетку дефектной частицы вируса гриппа по п.38.

49. Способ доставки нуклеиновой кислоты, не кодирующей пептид гриппа, индивиду, включающий введение указанному индивиду дефектной частицы вируса гриппа по п.38.