РЕКОМБИНАНТНЫЙ ВИРУС ГРИППА, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ COVID-19 И ГРИППА, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2023 года по МПК C12N15/86 C12N7/00 A61K39/215 

Изобретение относится к области медицины, биотехнологии и вирусологии, а именно к способам получения рекомбинантных вирусов гриппа, кодирующих фрагмент белка N вируса SARS-CoV-2, предназначенных для специфичной профилактики COVID-19 и гриппа с помощью мукозальной вакцины на их основе [A61P31/12, A61P31/16, A61P31/00, A61K 39/00, A61K 39/12].

Разработка специфической профилактики COVID-19, обеспечивающей защиту различных групп населения, в том числе от вновь появляющихся мутантных вариантов вируса SARS-CoV-2, является одной из приоритетных задач здравоохранения.

Большинство применяемых на сегодняшний день вакцин предназначены для парентерального введения и направлены на формирование системных нейтрализующих антител к полноразмерному белку Spike коронавируса или его субъединице S1, содержащей рецептор-связывающий домен – RBD [J. S. Tregoning, K. E. Flight, S. L. Higham, Z. Wang, and B. F. Pierce, “Progressofthe COVID-19 vaccineeffort: viruses, vaccines and variants versus efficacy, effectiveness and escape.,” Nat. Rev. Immunol., vol. 21, no. 10, pp. 626–636, Oct. 2021, doi: 10.1038/s41577-021-00592-1.]. В то же время белок S/RBD, играющий важную роль в прикреплении, слиянии и проникновении вируса в клетку, подвержен наиболее выраженным антигенным изменениям в результате нарастающего давления со стороны популяционного иммунитета [K. Guruprasad, “Mutations in human SARS-CoV-2 spike proteins, potential drug binding and epitope sites for COVID-19 therapeutics development,” Curr. Res. Struct. Biol., vol. 4, pp. 41–50, 2022, doi: https://doi.org/10.1016/j.crstbi.2022.01.002.]. В этой связи актуальным представляется направление исследований по изучению вакцинного потенциала консервативных белков вируса SARS-CoV-2, среди которых наиболее перспективной мишенью является обильносинтезирующийся в ходе инфекциинуклеокапсидный белок N, который регулирует несколько важных стадий жизненного цикла коронавируса [W. E. Matchett et al., “Cutting Edge: Nucleocapsid Vaccine Elicits Spike-Independent SARS-CoV-2 Protective Immunity.,” J. Immunol., vol. 207, no. 2, pp. 376–379, Jul. 2021, doi: 10.4049/jimmunol.2100421.; S. C. Oliveira, M. T. Q. de Magalhães, and E. J. Homan, “Immunoinformatic Analysis of SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein and Identification of COVID-19 Vaccine Targets,” Front. Immunol., vol. 11, 2020, doi: 10.3389/fimmu.2020.587615.].

Несмотря на данные фундаментальных исследований о превалирующей роли мукозального иммунитета в обеспечении защиты от антигенных вариантов респираторных вирусов, подавляющее большинство вакцин против COVID-19 предназначены для парентерального применения, а их действие направлено на формирование системного иммунного ответа (преимущественно нейтрализующие антитела в сыворотке крови). В то же время, важную роль в защите от инфекции играют ассоциированные со слизистыми оболочками высокомолекулярные иммуноглобулины класса А (IgA), обладающие кросс-протективной активностью, факторы врожденного иммунитета, популяции долгоживущих респираторных CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов памяти, а также клетки первой линии иммунной защиты - резидентные Trm клетки респираторного тракта [V. Gauttieretal., “Tissue-residentmemory CD8 T-cell responses elicited by a single injection of a multi-target COVID-19 vaccine,” bioRxiv, p. 2020.08.14.240093, Jan. 2020, doi: 10.1101/2020.08.14.240093.]. С респираторными Т-клетками памяти связывают эффект долговременной перекрестной защиты в отношении различных коронавирусов, включая SARS-CoV-2 [J. Zhao et al., “Airway Memory CD4 + T Cells Mediate Protective Immunity against Emerging Respiratory Coronaviruses,” Immunity, vol. 44, no. 6, Jun. 2016, doi: 10.1016/j.immuni.2016.05.006.].

Вакцинация против сезонного гриппа считается одним из наиболее эффективных средств снижения бремени болезни, которая в эпоху до COVID-19 вызывала в среднем 250 000–500 000 смертей во всем мире ежегодно [Paget J., Spreeuwenberg P., Charu V., Taylor R.J., Iuliano A.D., Bresee J., Simonsen L., Viboud C. Global Seasonal Influenza-associated Mortality Collaborator Networkand GLaMOR Collaborating Teams. Global mortality associated with seasonal influenza epidemics: New burden estimates and predictors from the GLaMOR Project. J. Glob. Health. 2019;9:020421. doi: 10.7189/jogh.09.020421]. Хотя циркуляция вируса гриппа резко сократилась с 2020 г., зимний сезон 2021/22 г. в северном полушарии характеризовался параллельной циркуляцией как SARS-CoV-2, так и гриппа[World Health Organization (WHO) FluNet. Available online: https://www.who.int/tools/flunet]. Применение комбинированных вакцин против гриппа и COVID-19, наряду с одновременным введением двух вакцин, будет способствовать увеличению охвата вакцинацией [World Health Organization (WHO) Coadministration of Seasonal Inactivated Influenza and COVID-19 Vaccines. Interim Guidance. [(accessed on 7 February 2022)]. Available online: https://www.who.int/publications/i/item/WHO-2019-nCoV-vaccines-SAGE_recommendation-coadministration-influenza-vaccines].

Из уровня техники известна КАНДИДАТНАЯ ВАКЦИНА DELTA-19, разрабатываемая компанией Vivaldi Biosciences (США, Австрия) [WO2022109068 - Influenza virus encoding a truncated NS1 protein and a SARS-CoV receptor binding domain, опубликовано: 27.05.2022]. Вакцина Delta-19 сделана на основе аттенуированного гриппозного вектора с укороченной рамкой считывания белка NS1, в которой закодирован фрагмент RBD белка Sвируса SARS-CoV-2. Препарат предназначен для профилактики COVID-19 и гриппа. Вакцина производится с использованием культуры клеток Vero. В настоящее время вакцина проходит доклинические исследования[https://vivaldibiosciences.com/delta19].Ограничением настоящего изобретения является узкий спектр защиты, связанный с выбором RBDдомена вируса SARS-CoV-2 в качестве мишени, который подвержен активным мутационным изменениям [K. Guruprasad, “Mutations in human SARS-CoV-2 spike proteins, potential drug binding and epitope sites for COVID-19 therapeutics development,” Curr. Res. Struct. Biol., vol. 4, pp. 41–50, 2022, doi: https://doi.org/10.1016/j.crstbi.2022.01.002]. Вторым ограничением является единственно возможный субстрат производства вакцины – интерферон-дефектные клетки Vero, поскольку deltaNS1 вакцинные штаммы не способны реплицироваться в интерферон-компетентных системах, таких как развивающиеся куриные эмбрионы (РКЭ). При этом в РФ именно РКЭ используются в качестве основного субстрата при производстве противогриппозных вакцин из вакцинных штаммов вируса гриппа, а существующие мощности могут быть использованы в том числе для производства векторных вакцин на основе вируса гриппа.

Вторым близким техническим решением к настоящему изобретению является ВАКЦИННЫЙ КАНДИДАТ DELNS1-2019-NCOV-RBD-OPT1, разработанный в Университете Гонконга [WO2021160036- Compositions immunogenic against SARS coronavirus 2, methodsofmaking, andusingthereof; J. Chenetal., “A liveattenuatedvirus-based intranasal COVID-19 vaccine provides rapid, prolonged, and broad protection against SARS-CoV-2,” Sci. Bull., vol. 67, no. 13, pp. 1372–1387, Jul. 2022, doi: 10.1016/j.scib.2022.05.018, опубликовано: 19.08.2021]. Вакцинный кандидат представляет собой температурочувствительный (ts) вакцинный штамм на основе вируса гриппа А с удаленным белком NS1, экспрессирующий RBD домен, и предназначен для интраназального применения с целью профилактики COVID-19. В ходе доклинических исследований препарат продемонстрировал высокую иммуногенность и хороший защитный потенциал. В настоящее время завершены I и II фазы клинических исследований препарата (ChiCTR2000037782; ChiCTR2000039715), анонсировано начало III фазы (ChiCTR2100051391), а также исследования II фазы в схеме «прайм-буст» применения (NCT05200741). Недостатком данного вакцинного кандидата также является выбор домена RBD в качестве мишени. Спектр возможных субстратов производства данного вакцинного кандидата расширен за счёт мутации в некодирующем фрагменте гена М вакцинного штамма [WO2016074644 – Live attenuated vaccines for influenza viruses, опубликовано: 19.05.2016], позволяющей ему размножаться не только в клетках Vero, но и в клетках MDCK(основной субстрат для данного препарата). Вектор, на основе которого создан вакцинный кандидат DelNS1-2019-nCoV-RBD-OPT1, был способен репродуцироваться в РКЭ, хотя и хуже, чем вирус дикого типа; данных о репродукции вакцинного кандидата в РКЭ не представлено.

Также известны рекомбинантные вирусы гриппа на основе отечественного донора аттенуации для живой гриппозной вакцины A/Leningrad/17/134/57 [Патент RU2782531; Isakova-Sivak I, Stepanova E, Matyushenko V, etal. Development of a T Cell-Based COVID-19 Vaccine Using a Live Attenuated Influenza Vaccine Viral Vector. Vaccines (Basel). 2022;10(7):1142. Published 2022 Jul 18. doi:10.3390/vaccines10071142, опубликовано: 28.10.2022].Данные рекомбинантные вирусы обладают аттенуированным фенотипом, при этом способны репродуцроваться в системе куриных эмбрионов. Ограничением вакцинного штамма, описанного в патенте, является узкий спектр защиты, связанный с выбором RBD домена вируса SARS-CoV-2 в качестве мишени, который подвержен активным мутационным изменениям, что вызывает необходимость частого обновления вакцинного штамма. Ограничением вакцинных кандидатов, описанных в публикации в открытом доступе, является использование в составе гетерогенной вставки узкого набора эпитопов, который рассчитан для определенного набора аллелей главного комплекса гистосовместимости. Преимуществом настоящего изобретения является использование в качестве гетерологичной вставки протяженного участка консервативного белка N вируса SARS-CoV-2, содержащего множественные экспериментально подтвержденные и теоретически предсказанные эпитопы для репрезентативного набора аллелей.

Из уровня техники известен вакцинный кандидат «Coraflu», разработанный в рамках международной коллаборации Университета Висконсин-Мэдисон и компаний по производству вакцин FluGen и Bharat Biotech. Вакцинный кандидат основан на репликативно-дефектном гриппозном векторе с удаленным M2 белком (M2SR), в рамку которого встроена последовательность, кодирующая фрагмент SARS-CoV-2 [UW–Madison, FluGen, Bharat Biotech to develop CoroFlu, a coronavirus vaccine. Press Release. https://news.wisc.edu/uw-madison-flugen-bharat-biotech-to-develop-coroflu-a-coronavirus-vaccine/; Nasal drop vaccine candidate for coronavirus from India, https://www.nature.com/articles/nindia.2020.59]. Ограничением данного вакцинного кандидата является единственный субстрат производства – генетически-модифицированная клеточная линия M2CK (линия MDCK, экспрессирующая вирусный белок М2) [US10119124B2, опубликовано: 06.04.2017].

Из уровня техники известен аттенуированный вирус гриппа А, содержащий химерный фрагмент NS, включающий укороченную рамку считывания белка NS1 и гетерологичную последовательность гена белка NEP, происходящую от подтипа вируса гриппа А, отличающегося от подтипа указанного аттенуированного вируса гриппа А, где указанная укороченная рамка считывания кодирует белок NS1 размером 80-130 аминокислотных остатков [RU 2628690, опубликовано: 21.08.2017, заявка EP3382010A4, заявка PCT/RU2016/050066]. Описанный штамм способен репродуцироваться в системе куриных эмбрионов. В описании изобретения указано, что данный вирус может быть использован в качестве вектора для создания рекомбинантного штамма, в котором укороченная рамка считывания белка NS1 продолжена вставкой последовательности по меньшей мере одного трансгена, кодирующего белки или фрагменты белков респираторных вирусов. Также указано, что введение подобных штаммов в эффективном количестве может быть использовано для профилактики инфекции, вызванной соответствующим респираторным вирусами. Тем не менее, поскольку заявка на патент была подана до начала пандемии COVID-19, описание изобретения не могло содержать и не содержит информации омишенях в геноме вируса SARS-CoV-2 (появившегося только в 2019 году), которые могут обладать преимуществом для использования в качестве трансгена-вставки в гриппозный вектор, что является сутью настоящего изобретения.

Из уровня техники известны аттенуированные рекомбинантные вирусы гриппа DNA(RBD)-Flu, в которых делетирована последовательность белка NA и которые кодируют фрагмент RBD вируса SARS-CoV-2 в модифицированном генном сегменте NA [Loes A et al., Viruses. 2020 12:987]. Субстратом производства рекомбинантных вирусов является культура клеток MDCK-SIAT1-TMPRSS2. Показано, что введение рекомбинантных вирусов мышам приводит к формированию у животных RBD-специфичных антител, обладающих нейтрализующей активностью в тесте с кодирующим S-белок псевдо-лентивирусами. О защитной эффективности указанных рекомбинантных вирусов информации нет. К недостаткам указанных рекомбинантных штаммов относится выбор узкоспецифичной мишени – домена RBDвируса SARS-CoV-2, а также необходимость адаптационных мутаций в гене НА рекомбинантного вируса для поддержания высокого уровня репродукции в клетках. В литературе показано, что подобные мутации могут снижать приживляемость и иммуногенность конструкций [Nakowitsch S. et al., Vaccine. 2011. 29:3517-3524].

Задачей изобретения является создание нового рекомбинантного штамма на основе гриппозного вектора, предназначенного для получения векторной вакцины против COVID-19 и гриппа, обладающего более широким защитным потенциалом и лишенного недостатков прототипов. Поставленная задача решена с помощью генно-инженерного конструирования рекомбинантных вакцинных штаммов, экспрессирующих фрагмент белка N вируса SARS-CoV-2. Особенностью генетической конструкции вакцинных штаммов является укорочение транслируемой области белка NS1 до 124 аминокислотных остатков и замещение его карбоксильной части последовательностью, кодирующей фрагмент белка N вируса SARS-CoV-2, включающий доминантные Т-клеточные иммуногенные эпитопы и потенциальные сигнальные последовательности NES и NLS. Указанные особенности обеспечивают рекомбинантным вакцинным штаммам более высокий уровень репродукции в основных субстратах производства, включая РКЭ, более активную экспрессию трансгена и более высокую иммуногенность по сравнению с аналогичными конструкциями, не содержащими указанных особенностей. Использование в качестве мишени белка N вируса SARS-CoV-2 обеспечивает рекомбинантным вакцинным штаммам потенциально более широкую кросс-специфичную защиту в отношении инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2, по сравнению с аналогами, кодирующими фрагмент RBD. Использование в качестве источника поверхностных антигенов вирусов гриппа человека актуальных подтипов определяет возможность использования рекомбинантных вакцинных штаммов для профилактики сезонного гриппа.

Аттенуация рекомбинантных вакцинных штаммов обеспечивается модификацией геномного фрагмента NS, которая состоит в укорочении белка NS1 до 124 аминокислотных остатков. Укорочение белка NS1 нарушает способность вируса ингибировать систему врожденного иммунитета, в частности, выработку интерферонов первого типа. Это приводит к подавлению способности вируса к репродукции invivo и предотвращению трансмиссии вакцинного штамма. В то же время, интраназальная иммунизация вакцинным штаммом обеспечивает экспрессию антигена-мишени (белок N вируса SARS-CoV-2) наряду с антигенами гриппозного вектора в эпителиальных и антиген-презентирующих клетках респираторного тракта. При этом в носовой полости и связанных слизистых оболочках респираторного тракта происходит усиленная выработка интерферонов и других цитокинов, обладающих иммуноадъювантными свойствами, что вызывает выраженный иммунный ответ к антигену-мишени и гриппозному вектору с поляризацией в сторону Th1 звена и формирование защиты против COVID-19 и гриппа.

Несмотря на модификацию геномного фрагмента NS, вакцина на основе сконструированных рекомбинантных вакцинных штаммов, может нарабатываться в РКЭ с использованием стандартных технологических схем, применяемых для производства классических противогриппозных вакцин.

Техническим результатом, достигаемым при осуществлении настоящего изобретения, является получение высокопродуктивных генетически стабильных рекомбинантных вирусных гриппов на основе гриппозного вектора, экспрессирующих фрагмент белка Nвируса SARS-CoV-2, которые в режиме интраназального введения индуцируют выраженный поствакцинальный N-специфический гуморальный и Т-клеточный иммунный ответ и обеспечивают кросс-специфичную защиту от инфекции вирусом SARS-CoV-2 и гриппа.

Рекомбинантные вирусы гриппа A/Guangdong/NS124_N (H1N1pdm09) и A/Cambodia/NS124_N (H3N2) депонированы в Государственной коллекции вирусов Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения Российской Федерации под № 2981 и № 2982.

Способ получения рекомбинантного вируса гриппа, предполагающий использование вируса гриппа, кодирующего в составе рамки считывания укороченного до 124 аминокислотных остатков белка NS1 гетерологичный фрагмент, содержащий, но не ограничивающийся, иммунодоминантными и сигнальными последовательностями SEQIDNO 1и SEQIDNO 2, заимствованными избелка N вируса SARS-CoV-2, которые обеспечиваютболее высокий уровень репродукции рекомбинантного вируса в основных субстратах производства (MDCK, Vero, РКЭ), более активную экспрессию гетерологичного трансгена и более высокую иммуногенность по сравнению с аналогичными рекомбинантными вирусами, не содержащими указанных последовательностей.

При этом вирус гриппа, кодирующий в составе рамки считывания укороченного белка NS1гетерологичный фрагмент, содержащий, но не ограничивающийся, иммунодоминантными и сигнальными последовательностями SEQIDNO: 1 и SEQIDNO: 2, заимствованными из белка N вируса SARS-CoV-2, может быть вирусом гриппа А любого подтипа, в том числе типа A/H1N1, например, A/PR/8/34, типа A/H1N1pdm09, например, A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019, типа A/H3N2, например, A/Cambodia/e0826360/2020.

Возможным примером реализации является использование последовательностей SEQIDNO: 1 и SEQIDNO: 2для усиления репродуктивных, иммуногенных и защитных свойств рекомбинантного вируса гриппа, когда они закодированы в рамке считывания укороченного белка NS1 последовательно с антигенами других вирусов/микобактерий/бактерий с целью создания вакцинных штаммов против инфекций, вызываемых соответствующими микроорганизмами. Примерами соответствующих микроорганизмов могут быть вирусы гриппа, коронавирусы, респираторно-синцитиальный вирус, микобактерии туберкулеза.

Возможным примером реализации также является использование последовательностей SEQIDNO 1 и SEQIDNO 2 в составе рекомбинантного вируса гриппа, когда они закодированы в рамке считывания укороченного белка NS1 последовательно с репортерными флуоресцентными или люминисцентными белками с целью повышения экспрессии репортерного белка или ростовых свойств репортерного вируса.

Полученный рекомбинантный вирус гриппа, на основе гриппозного вектора, экспрессирующего фрагмент белка N вируса SARS-CoV-2, обеспечивает возможность профилактики COVID-19 и гриппозной инфекции посредством интраназального введения фармацевтической композиции с его содержанием.

Профилактическое применение фармацевтической композиции, содержащей полученные рекомбинантные вирусы гриппа, характеризуется введением композиции однократно или двукратно с интервалом от 14 до 28 дней.

Профилактическое применение фармацевтической композиции, содержащей полученные рекомбинантные вирусы гриппа, характеризуется введением композиция в схеме прайм-буст иммунизации с интервалом от 14 до 28 дней последовательно с вакцинными препаратами против COVID-19 другого типа (инактивированными или на основе рекомбинантных белков) и способа введения (внутримышечный).

Сущность изобретения поясняется с помощью графических изображений, которые приведены только в целях иллюстрации и не предназначены для ограничения объема изобретения.

На Фиг. 1 приведены результаты картирования сигнальных последовательностей и Т-клеточных эпитопов в составе белка N вируса SARS-CoV-2 (GenBankid YP009724397). Фрагмент, используемый в составе гетерологичной вставки в рекомбинантных вирусах гриппа A/PR8/NS124_N211 (H1N1), A/Guangdong/NS124_N (H1N1pdm09) и A/Cambodia/NS124_N (H3N2) выделен рамкой. Отмеченный фрагмент включает сигнал локализации в ядре/ядрышках (входящий в состав SEQ ID NO: 1, начало отмечено пунктирной стрелкой), а также иммунодоминантный эпитоп (IEDB id 34851) и сигнал ядерного экспорта NES (входящие в состав SEQ ID NO: 2, начало отмечено пунктирной стрелкой).

На Фиг. 2представлена структура гена NS рекомбинантных вирусов гриппа, кодирующих фрагмент белка N вируса SARS-CoV-2 в составе рамки считывания укороченного белка NS1, с использованием в составе гетерологичной вставки фрагмента, содержащего иммунодоминантные и сигнальные последовательности SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.

На Фиг.2 (A) показана схема генного сегмента NS вируса гриппа дикого типа A/PR8, кодирующего полноразмерный белок NS1.

На Фиг.2 (Б) показана схема генного сегмента NS рекомбинантного вируса гриппа A/PR8/NS124, кодирующего укороченный белок NS1 без вставки гетерологичного антигена.

На Фиг.2 (В) показана схема генного сегмента NS рекомбинантного вируса гриппа A/PR8/NS124_N231, кодирующего укороченный белок NS1 со вставкой фрагмента белка N вируса SARS-CoV-2, включающего последовательность SEQ ID NO: 1.

На Фиг.2 (Г) показана схема генного сегмента NS рекомбинантного вируса гриппа A/PR8/NS124_N211, кодирующего укороченный белок NS1 со вставкой фрагмента белка N вируса SARS-CoV-2, включающего последовательности SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.

На Фиг. 3приведены результаты электрофоретического анализа результатов ОТ-ПЦР с определением длины гетерологичной вставки в химерном гене NS у рекомбинантных вирусов гриппа различных подтипов, кодирующих фрагмент белка N вируса SARS-CoV-2 в составе рамки считывания укороченного белка NS1, полученных по итогам пассажей в развивающихся куриных эмбрионах. Стрелкой отмечен целевой ОТ-ПЦР-фрагмент, длины фрагментов маркера (ММ) представлены в числе пар нуклеотидов.

На Фиг. 4показана экспрессия белка NS1 в клетках MDCK, инфицированных рекомбинантными вирусами гриппа A/PR8/NS124_N231 и A/PR8/NS124_N211, кодирующими фрагмент белка N вируса SARS-CoV-2 в составе рамки считывания укороченного белка NS1, контрольным вирусом без вставки A/PR8/NS124, а также вирусом гриппа дикого типа A/PR8, содержащего полноразмерный белок NS1.

На Фиг. 5 показана экспрессия белка N в клетках Vero, инфицированных рекомбинантными вирусами гриппа A/PR8/NS124_N231 и A/PR8/NS124_N211, кодирующими фрагмент белка N вируса SARS-CoV-2 в составе рамки считывания укороченного белка NS1 и контрольным вирусом без вставки A/PR8/NS124.

На Фиг. 6 показана динамика изменения массы тела мышей после иммунизации аттенуированным рекомбинантным вирусом гриппа A/PR8/NS124_N211 (кодирующим фрагмент белка N вируса SARS-CoV-2 в составе рамки считывания укороченного белка NS1), по сравнению с «пустым» вектором A/PR8/NS124 и патогенным для мышей вирусом гриппа «дикого типа» A/PR8.

На Фиг. 7 показана стимуляция выработки антиген специфичных CD8+ эффекторных Т-лимфоцитов памяти в легких мышей через 10 дней после интраназальной иммунизации рекомбинантными вирусами гриппа A/PR8/NS124_N231 [N231] и A/PR8/NS124_N211 [N211], кодирующими фрагмент белка N вируса SARS-CoV-2 в составе рамки считывания укороченного белка NS1 в сравнении с интактными животными [Интактные]. Показано относительное содержание (%) эффекторных T-клеток памяти памяти, продуцирующих IFNγ/TNFα/IL-2, после стимуляции коктейлем пептидов белка N вируса SARS-CoV-2.

На Фиг. 8 показано подавление активности вируса SARS-CoV-2 в легких и носовых ходах зараженных хомяков при однократной интраназальной иммунизации рекомбинантным вирусом A/PR8/NS124_N211.

На Фиг. 9 показана защитная эффективность рекомбинантных вирусов против инфекции вызванной коронавирусом SARS-CoV-2 вариант бета. Для оценки защитной эффективности мышей иммунизировали интраназально рекомбинантными вирусами A/Guangdong/NS124_N (H1N1pdm09) и A/Cambodia/NS124_N (H3N2) в схеме двукратного введения [NS124_N двукратно] или в схеме прайм-буст с формалин-инактивированным вирусом SARS-CoV-2 [Прайм-буст]. В группах сравнения мышей иммунизировали двукратно векторами без вставки соответствующих подтипов [NS124], либо вводили однократно формалин-инактивированный вирус SARS-CoV-2 с гидроксидом алюминия [ФИ коронавирус]. Мышам из группы контроля заражения вводили плацебо. Через 3 недели после второй вакцинации мышей заражали живым вирусом SARS-CoV-2 линии бета. На рисунках показана динамика массы тела иммунизированных и контрольных мышей после заражения SARS-CoV-2 (А) и вирусная нагрузка в легких зараженных животных на 5-ый день инфекции (Б).

На Фиг. 10 показана защитная эффективность рекомбинантных вирусов против инфекции, вызванной вирусами гриппа различных подтипов. Для оценки эффективности мышей интраназально иммунизировали рекомбинантными вирусами A/Guangdong/NS124_N (H1N1pdm09) и A/Cambodia/NS124_N (H3N2) в схеме двукратного введения [NS124_N двукратно]. Мышам из группы контроля заражения вводили плацебо. Через 3 недели после второй вакцинации мышей заражали вирусами гриппа в летальной дозе. На графиках показана динамика массы тела и выживаемость животных после заражения штаммами A/Aichi/2/68 (H3N2) (А, Б) и A/California/07/2009 (H1N1pdm09) (В, Г). На графиках представлены р-значения для сравнения групп в тесте ANOVA (критерий Сидака) для % веса животных и тесте Мантела-Кокса для выживаемости.

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами, которые приведены только в целях иллюстрации и не предназначены для ограничения объема изобретения.

Пример 1. Конструкция плазмид, обеспечивающих экспрессию фрагментов белка N вируса SARS-CoV-2 в составе рамки считывания укороченного белка NS1 вируса гриппа.

Для получения методом обратной генетики рекомбинантных вирусов гриппа, кодирующих фрагмент белка N вируса SARS-CoV-2 в составе рамки считывания укороченного белка NS1, были сконструированы плазмиды, кодирующие генные сегменты рекомбинантных вирусов. Плазмиды, кодирующие генные сегменты HA, NA, PB2, PB1, PA, NP и M вируса A/PR/8/34 (H1N1) [A/PR8] были получены, как описано ранее [RU 2759054, опубликовано: 09.11.2021, RU 2726106, опубликовано: 09.07.2020]. Плазмиды, кодирующие гены HA, NA эпидемических вирусов гриппа, A/Guangdong/NS124_N (H1N1pdm09) и A/Cambodia/NS124_N (H3N2) были получены методом клонирования амплифицированных с помощью ОТ-ПЦР полноразмерных генных фрагментов в синтетический вектор на основе pHW2000 как описано ранее [EA200201164 (A1), опубликовано: 30.10.2003].

В качестве основы для создания плазмид, кодирующих химерные гены NS была использована плазмида pHW-PR8-NS124_NanoLuc кодирующая химерный ген NS рекомбинантного вируса гриппа A/PR/8/34, обеспечивающий экспрессию NanoLuc в составе рамки считывания укороченно белка NS1 [RU 2726106]. Методом ПЦР (Таблица 1) и сайт-направленного мутагенеза из плазмиды pHW-PR8-NS124_NanoLuc была удалена последовательность, кодирующая белок NanoLuc, и добавлен сайт рестрикции XhoI. Таким образом был получен рабочий вектор pHW-PR8-NS124_XhoI_428.

Таблица 1 – Праймеры для амплификации вектора с внесением сайта рестрикции

название последовательность 5’ ->3’ n Tm XhoI to pNS F2 TTCTCGAGaacttcgatcttctgaaactg 29 67 XhoI to pNSR2 TTCTCGAGtcctcccatgatcgcct 25 69

Далее методом ОТ-ПЦР со специфическими праймерами (Таблица 2) были амплифицированы фрагменты гена N вируса SARS-CoV-2 (штамм hCoV-19/Russia/SPE-RII-3524V/2020, номер в базе данных GISAID EPI_ISL_415710). При этом первый амплифицированный фрагмент [N231] содержалпротяженный фрагмент белка N вируса SARS-CoV-2, содержащий множественные В- и Т-клеточные эпитопы (представлены на фиг. 1), включая потенциальную сигнальную последовательность KKPRQKRTA (SEQIDNO: 1), а второйамплифицированный фрагмент [N211] помимо вышеперечисленного включал также иммунодоминантную последовательность LALLLLDRLNQL (SEQIDNO: 1). Амплифицированные фрагменты на концах содержали последовательности сайтов рестрикции XhoI и NotI для клонирования в рабочий вектор pHW-PR8-NS124_XhoI428.

Таблица 2 – Праймеры для клонирования фрагментов белка N вируса SARS-CoV-2

название фрагмента название праймера последовательность 5’ ->3’ n Tm N211 N cloning XhoI F tttctcgagGCTGGCAATGGCGGTG 25 71 N cloning NotI R ttgcggccgcttaTTTAGGCTCTGTTGGT 29 72 N231 deltaNS-Nepitopes 2 F tttctcgagGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGG N cloning NotI R ttgcggccgcttaTTTAGGCTCTGTTGGT

Далее амплифицированные фрагменты и рабочий вектор были обработаны рестриктазами XhoI и NotI (Thermo), очищены методом препаративного электрофореза в агарозном геле и лигированы в течение 10 минут при комнатной температуре при помощи T4 лигазы (Thermo).Лигазной смесью были электропорированы клетки E.coli DH5α. Колонии, несущие плазмидные ДНК с необходимой вставкой были выявлены методом ПЦР с использованием праймеров для клонирования (Таблица 2), последовательности плазмид в отобранных клонах были верифицированы секвенированием по Сэнджеру.

В результате были получены плазмиды pHW-PR8-NS124_N211 и pHW-PR8-NS124_N231, кодирующие химерные генные сегменты NS. Химерный генный сегментPR8-NS124_N211включал кодирующую, а также 5’-UTR и 3’-UTR некодирующие области нуклеотидной последовательности генного сегмента NS вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1); при этом открытая рамка считывания белка NS1 была укорочена до 124 аминокислот, после которых следовал линкер GGLE, затем гетерологичная последовательность, кодирующая фрагмент 211-369 белка N вируса SARS-CoV-2, терминированная стоп-кодоном; при этом 30 нуклеотидов следующие после окончания рамки считывания химерного белка NS124_N были удалены и заменены уникальным сайтом рестрикции NotI, оставшиеся 100 нуклеотидов перед началом рамки NS2(NEP) были сохранены для процесса сплайсинга. Общая длина химерного генного сегмента PR8-NS124_N211 составляла 1360 нуклеотидов. Общая длина плазмиды составляла 4327 нуклеотидов. Карта химерного генного сегмента PR8-NS124_N211 представлена на фиг. 2, аминокислотная последовательность химерного белка NS124_N211 приведена в Перечне последовательностей SEQ ID NO: 3.

Химерный генный сегмент PR8-NS124_N211 отличался от сегмента, описанного выше, вставкой более короткого фрагмента белка N вируса SARS-CoV-2, включавшего аминоксилоты 231-369. Общая длина химерного генного сегмента PR8-NS124_N231 составляла 1300 нуклеотидов. Карта химерного генного сегмента PR8-NS124_N231 представлена на фиг. 2, аминокислотная последовательность химерного белка NS124_N231 приведена в Перечне последовательностей SEQ ID NO: 4.

Полученные плазмиды накапливали в клетках E.coli DH5alpha и очищали с использованием набора реагентов EndofreeMaxiKit (Qiagen) для выделения плазмид, свободных от эндотоксина. Нуклеотидные последовательности плазмид были верифицированы секвенированием по Сенджеру.

Пример 2. Способ получения генетически стабильных рекомбинантных вирусов гриппа различных подтипов, кодирующих фрагмент белка N вируса SARS-CoV-2 в составе рамки считывания укороченного белка NS1.

Набором из 8 плазмид (табл. 3), полученных как описано в примере 1, трансфецировали клетки Vero (ATCC CCL-81), адаптированные к росту в бессывороточной среде OptiPro SFM (Gibco). Для одной трансфекции использовали 3*10⁶ клеток, ресуспендированных в 100 мкл смеси буферов из набора Nucleofector Kit V (Lonza). Электропорацию проводили с использованием Amaxa Nucleofector II (Lonza) по программе U-020.Трансфецированные клетки инкубировали при 37°С, 5% CO2 в 6-луночных планшетах. Через 2 суток в сформировавшемся монослое клеток наблюдали начало развития цитопатического действия (ЦПД) вируса. Через 3 суток разрушение монослоя составило 100%. Культуральная жидкость содержала рекомбинантные вирусы гриппа (пассаж V0). Для получения основного и рабочего банка вирусов, а также оценки генетической стабильности полученные рекомбинантные вирусы пассировали в системе РКЭ методом предельных разведений. Куриные эмбрионы заражали в аллантоисную полость по 0.2 мл вирус-содержащего материала и инкубировали при 34°С 48 ч, затем охлаждали. Собранную аллантоисную жидкость осветляли, аликвотировали и хранили при -70°С.

Таблица 3 – Наборы плазмид (по 1 мкг каждой), использованные для получения рекомбинантных вирусов гриппа различных подтипов, кодирующих фрагмент белка N вируса SARS-CoV-2 в составе рамки считывания укороченного белка NS1

Вирус/
генный сегмент Прототипные штаммы Вакцинные штаммы A/PR8/NS124_N231 (H1N1) A/PR8/NS124_N211 (H1N1) A/Guangdong/NS124_N (H1N1pdm09) A/Cambodia/NS124_N (H3N2) HA pHW-PR8-HA pHW-PR8-HA pHW- Guangdong-HA pHW- Cambodia-HA NA pHW-PR8-NA pHW-PR8-NA pHW-Guangdong-NA pHW- Cambodia-NA PB2 pHW-PR8-PB2 pHW-PR8-PB2 pHW-PR8-PB2 pHW-PR8-PB2 PB1 pHW-PR8-PB1 pHW-PR8-PB1 pHW-PR8-PB1 pHW-PR8-PB1 PA pHW-PR8-PA pHW-PR8-PA pHW-PR8-PA pHW-PR8-PA NP pHW-PR8-NP pHW-PR8-NP pHW-PR8-NP pHW-PR8-NP M pHW-PR8-M pHW-PR8-M pHW-PR8-M pHW-PR8-M NS pHW-PR8-NS124_N231 pHW-PR8-NS124_N211 pHW-PR8-NS124_N211 pHW-PR8-NS124_N211

Специалистам в данной области технологии понятно, что для конструирования подобных рекомбинантных штаммов могут быть использованы гены HA и NA вирусов гриппа и других подтипов (H2N2, H5N1, H7N9 и прочие), а также последовательности указанных фрагментов белка N эволюционно измененных коронавирусов человека, включая варианты SARS-CoV-2 бета, омикрон, цербер и пр, а также рекомбинантные варианты SARS-CoV-2.

Контроль генетической стабильности проводили методом ОТ-ПЦР, определяя размер гетерологичной вставки в генном сегменте NS после нескольких последовательных пассажей в системе РКЭ.

Вирусную РНК выделяли из 150 мкл вируссодержащей жидкости с использованием набора QIAmpViral RNA kit (Qiagen). ОТ-ПЦР проводили «одношаговым» методом с использованием набора реагентов AgPath-ID One-Step RT-PCR Reagents (Ambion, США). Предварительно проводили отжиг праймера для обратной транскрипции: смешивали 2 мкл РНК и 2 мклпраймера Uni12 (100 пмоль/мкл, Beagle, Россия) [Zhou B, Donnelly ME, Scholes DT et al. J Virol. (2009) 83: 10309], затем инкубировали при 70°С в течение 4 мин, после чего охлаждали во льду.

Состав реакционной смеси для ОТ-ПЦР включал следующие компоненты:

2х буфер 12,5 мкл Прямой праймер 0,25 мкл Обратный праймер 0,25 мкл Смесь ферментов Emix 1 мкл MgCl2 1 мкл Вода NWF 6 мкл РНК+Uni12 4 мкл Общий объем реакции 25 мкл

Последовательности использованных праймеров представлены ниже:

Название Последовательность Uni12 AGCRAAAGCAGG PR8-NS1-332F TGGCAGGCCCTCTTTGTA PR8-NS1-523R TGACATCCTCAGCAGTATGTCC

Термальный профиль реакции включал следующие стадии:

1: 42°С – пауза

2: 42 °С – 60 мин

3: 95°С – 15 мин

4: 95°С – 15 с

5: 58°С – 30 с

6: 72°С – 1 мин

7: Переход к 4, повтор 39 раз

8: 72°С – 5 мин

9: 8°С – хранение

Для анализа результатов ОТ-ПЦР проводили горизонтальный электрофорез образцов в 2% агарозном геле (Thermo Scientific, США) в 1Х TBE буфере (Thermo Scientific, ЕС), содержащем 5 мкг/мл бромистого этидия (Ethidium Bromide, Amresco, США). В качестве маркера молекулярного веса использовали М28 (СибЭнзим, Россия). Электрофорез проводили в камере SE-2 (Helicon, Россия) при 150В в течение 1.5 часов. Для детекции результатов ЭФ использовали систему гель-документирования ChemiDoc (Bio-Rad, США).

Результаты электрофореза представлены на фиг. 3. Полученные результаты демонстрируют соответствие длины гена NS у всех клонов рекомбинантных вирусов длине соответствующего сегмента в контрольной плазмиде и, таким образом, подтверждают генетическую стабильность вирусов. Генетическая стабильность для вакцинных штаммов A/Cambodia/NS124_N (H3N2) и A/Guangdong/NS124_N (H1N1pdm09) продемонстрирована на протяжении 6 пассажей в РКЭ, что соответствует требованиям нормативной документации (не менее 5 пассажей).

Определение репродуктивных свойств полученных рекомбинантных вирусов проводили в системе РКЭ, основном субстрате производства вакцины. Эмбрионы заражали рядом падающих разведений вирусного материала на фосфатно-солевом буфере DPBS с добавлением 100 ед/мл пенициллина/100 мкг/мл стрептомицина и 5 мкг/мл амфотерицина Б (Биолот, Россия). РКЭ заражали в аллантоисную полость по 0,2 мл материала и инкубировали при температуре 34°С в течение 48 ч. Затем РКЭ охлаждали и вскрывали. Наличие вируса в аллантоисной жидкости определяли по положительной реакции гемагглютинации в объеме 50 мкл с эквивалентным количеством 0,5% суспензии куриных эритроцитов. Инфекционную активность вируса подсчитывали по методу Рида-Менча (Reed, Muench, 1938) и выражали в десятичных логарифмах 50% эмбриональной инфекционной дозы (lgЭИД50). Все полученные в рамках настоящего изобретения штаммы обладали высокой репродуктивной активностью в системе РКЭ (таблица 4), соответствующей требованиям нормативной документации к производственным вакцинным штаммам.

Таблица 4 – Инфекционная активность в РКЭ рекомбинантных вирусов гриппа различных подтипов, кодирующих фрагмент белка N вируса SARS-CoV-2 в составе рамки считывания укороченного белка NS1

Штамм Инфекционная активность, lgЭИД50/мл
среднее ± СО A/PR8/NS124_N231 (H1N1) 8,7 ± 0.4 A/PR8/NS124_N211 (H1N1) 8,2 ± 0.5 A/Guangdong/NS124_N (H1N1pdm09) 8.3±0.4 A/Cambodia/NS124_N (H3N2) 7.8± 0.3

Пример 3. Влияние конструкции фрагмента-вставки на экспрессию вирусных белков при заражении клеток рекомбинантными вирусами гриппа, кодирующими фрагмент белка N вируса SARS-CoV-2 в составе рамки считывания укороченного белка NS1

Определение экспрессии белков при заражении чувствительных клеток рекомбинантными и контрольными вирусами проводили методом иммунофлуоресцентного анализа по окрашиванию антиген-специфическими антителами.

Клетки Vero в 96-луночных планшетах заражали рекомбинантными вирусами в дозе 1-10 ЭИД50/клетку, разведенными в среде OptiPro (Gibco) с добавлением 2% GlutaMax (Gibco) и 1% антибиотик/антимикотик (Gibco). Планшет с зараженными клетками инкубировлаи 24 ч при +37°С и 5% CO2. На следующий день из планшета дозатором убирали среду и вносили по 100 мкл в лунку 80% ацетона для фиксации и пермеабилизации клеток. Планшет инкубировали 15-20 минут при +2-8°С. Затем планшет отмывали при помощи автоматического промывателя ELX50 (BioTek Instruments) два раза раствором PBS-T (PBS(Биолот) с добавлением 0,1% Tween-20 (Serva)), после чего вносили блокирующий раствор (5% обезжиренное сухое молоко (ООО «ТФ-Дитол») в PBS-T) 200 мкл в лунку и инкубировали 2 ч при комнатной температуре. Затем вновь отмывали планшет два раза и в определенные лунки вносили по 100 мклразведения FITC-меченных моноклональные антител к белку NP вируса гриппа А 6D11 (1:40), либо поликлональных мышиных антител к белку N вируса SARS-CoV-2 (1:1000) или к поликлональных мышиных антител к белку NS1 вируса гриппа (1:1000) (последние были получены путем иммунизации мышей соответствующими рекомбинантными белками). Инкубировали планшет в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Далее планшет отмывали четыре раза. Лунки с антителами к NP заливали PBS-T. В оставшиеся лунки вносили флуоресцентный конъюгат анти-мышиных IgG антител, меченых AlexaFluor 488 (ab150113, Abcam) в разведении 1:300. Планшет инкубировали в течение 1 ч. Вновь проводили отмывку шесть раз и заливку PBS-T всего планшета. Фотографии клеток получали с использованием флуоресцентного микроскопа Axio Vert.A1 (Zeiss) и встроенной фотокамеры Axio ICc5 (Zeiss), на увеличении 40х.

Результаты, представленные на Фиг. 4 демонстрируют различия в локализации белка NS1 в зараженных клетках. При заражении клеток вирусом дикого типа A/PR8-NSwt белок NS1 активно экспрессируется и локализован по всей клетке, включая цитоплазму, ядро и ядрышки. Укорачивание белка NS1 до 124 аминокислот (вирус A/PR8-NS124) приводит к изменению его локализации – белок утрачивает способность локализоваться в ядрышках зараженных клеток и локализуется в цитоплазме в виде гранул. Ранее подобная локализация была описана для других штаммов с укороченным NS1 [Pulkina A.A. etal. Evidence for the extracellular delivery of influenza NS1 protein // MIR Journal. 2021;8(1):27-37. doi: 10.18527/2500-2236-2021-8-1-27-37]. Наиболее вероятно это связано с утратой сигнала NLS/NoLS, располагающегося в С-концевом домене NS1 [Hale BG, Randall RE, Ortín J, Jackson D. The multifunctional NS1 protein of influenza A viruses. J Gen Virol. 2008; 89 (Pt 10):2359-2376. doi:10.1099/vir.0.2008/004606-0]. При этом из опубликованных работ также заметно, что добавление различных белков (например, гены Luc, ESAT-6) в состав укороченной рамки считывания NS1 не восстанавливало локализацию белка NS1 в ядрышках [Pulkina A.A. et al. Evidence for the extracellular delivery of influenza NS1 protein // MIR Journal. 2021; 8(1):27-37. doi: 10.18527/2500-2236-2021-8-1-27-37; Kuznetsova I, Shurygina AP, Wolf B, et al. Adaptive mutation in nuclear export protein allows stable transgene expression in a chimaeric influenza A virus vector. J Gen Virol. 2014; 95(Pt 2): 337-349. doi:10.1099/vir.0.056036-0]. Отсутствие в ядрышках зараженных клеток белка NS1, участвующего в сплайсинге других вирусных белков, может быть одной из причин существенного снижения экспрессии этих белков, что ранее было продемонстрировано в отношении белков M1 и М2 у вирусов с укороченным NS1 [Egorov A, Brandt S, Sereinig S, et al. Transfectant influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells. J Virol. 1998; 72(8) :6437-6441. doi:10.1128/JVI.72.8.6437-6441.1998]. Снижение экспрессии белков M1 и M2 может существенно влиять на репродуктивные свойства рекомбинантных вирусов с укороченным белком NS1. Из уровня техники описан подход к повышению репродуктивных свойств вируса с удаленным NS1 путем восстановления экспрессии белка М2, за счет мутации в некодирующей области, влияющей на сплайсинг соответствующей мРНК [WO2016074644].

Для рекомбинантных вирусов, описанных в настоящем изобретении A/PR8-NS124_N231 и A/PR8-NS124_N211, локализация укороченного белка NS1 в ядрышках восстановлена (Фиг. 4), что связано с использованием в составе открытой рамки считывания NS1 фрагмента SEQIDNO: 1, содержащего сигнал NoLS, заимствованный из белка N вируса SARS-CoV-2,. Таким образом, использование последовательности SEQIDNO: 1 при конструировании вирусов гриппа с укороченным NS1 влияет на локализацию белка NS1 в клетке и таким образом может усиливать репродуктивные свойства вирусов за счет восстановления сплайсинга других вирусных белков.

Результаты, представленные на Фиг. 5 демонстрируют, что описанные в настоящем изобретении рекомбинантные вирусы A/PR8-NS124_N231 и A/PR8-NS124_N211 обеспечивают экспрессию антигена N вируса SARS-CoV-2 при заражении клеток и таким образом, могут презентировать данный антиген для развития специфического иммунного ответа.

Пример 4.Влияние конструкции фрагмента-вставки на формирование SARS-CoV-2 N-специфичного Т-клеточного иммунного ответа при интраназальной иммунизации лабораторных мышей рекомбинантными вирусами гриппа, кодирующими фрагмент белка N вируса SARS-CoV-2 в составе рамки считывания укороченного белка NS1.

Тестирование рекомбинантных вирусов гриппа A/PR8-NS124_N231 и A/PR8-NS124_N211, кодирующих фрагмент белка N вируса SARS-CoV-2 в составе рамки считывания укороченного белка NS1, на способность стимулировать N-специфический иммунный ответ проводили на линейных черных мышах C57/black. В исследованиях использовали здоровых животных, на которых ранее не проводили какие-либо испытания. Иммунизацию проводили интраназально по 6,0 lgЭИД₅₀/мышь по 30 мкл/мышь вируса. В качестве контроля использовали интактных мышей. Через 10 суток после иммунизации у мышей проводили оценку Т-специфичного Т-клеточного ответа в легких.

Для этого животных умерщвляли путем цервикальной дислокации, осуществляли перфузию левого желудочка 10 мл холодного DPBS, после чего извлекали легкие. Органы гомогенизировали при помощи гомогенизатора Tissue Lyser II (Qiagen) и обрабатывали смесью коллагеназы (Sigma) и ДНКазы I (Sigma) в течение 30 мин при 37ºC. Гомогентаты тканей пропускали через 70 мкм клеточный фильтр. Клетки однократно отмывали (500g, 7мин) в DPBS, содержащем 2.5% фетальной телячьей сыворотки (Gibco). Лизис эритроцитов осуществляли при помощи реагента RBC Lysis Buffer (Biolegend). Клетки повторно отмывали в DPBS + 2.5% FBS. Подсчет осуществляли при помощи проточного цитометра Cytoflex (Beckman Coulter). Для оценки адаптивного вирус-специфичного иммунного ответа клетки рассевали в плоскодонные планшеты с плотностью 2 * 10^6 кл/100 мкл и стимулировали коктейлем петидов белка N вируса SARS-CoV-2 (PepTivator® SARS-CoV-2 Prot_N, MiltenyiBiotec). Одновременно в среду добавляли ингибитор клеточного транспорта брефельдин А (BD Biosciences). Стимуляцию проводили в течение 6 ч в присутствии ко-стимулирующих антител к CD28 (Biolegend). В контрольные лунки вносили все перечисленные реагенты, за исключением специфического стимулятора.

После стимуляции клетки окрашивали флуорохром-конъюгированными антителами CD8-PE/Cy7, CD44-BV510, CD62L-APC/Cy7, IFNγ-FITC, TNFα-BV421, IL2-PE. Для идентификации жизнеспособности клеток был использован маркеры Zombie Red. Блокировку неспецифического связывания антител осуществляли при помощи реагента True Stain, содержащего антитела к CD16/CD32 (Biolegend). Окрашивание проводили с помощью набора для внутриклеточного окрашивания Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences), согласно инструкции производителя. Результаты окрашивания детектировали на проточном цитометре Cytoflex (Beckman Coulter). Результаты анализировали в программе Kaluza Analisis 2.1 (Beckman Coulter).

Полученные результаты на Фиг. 7 демонстрируют существенные различия в способности рекомбинантных штаммовA/PR8-NS124_N231 и A/PR8-NS124_N211 стимулировать CD8 N-специфический Т-клеточный ответ у лабораторных животных. Так у мышей, иммунизированных A/PR8-NS124_N231, средний уровень N-специфических цитокин-продуцирующих CD8+ Т-лимфоцитов находился на уровне интактных мышей в пределах 1% от общего числа Т-клеток. У мышей иммунизированных A/PR8-NS124_N211 средний уровень CD8+ был значимо выше. Высокие уровни CD8+ антиген-специфических клеток отмечены у всех мышей, иммунизированных штаммом A/PR8-NS124_N211 и только у одной мыши из группы A/PR8-NS124_N231. Такая разница обусловлена наличием в составе гетерологичной вставки в гене NS вируса A/PR8-NS124_N211 последовательности SEQIDNO: 2, содержащей иммунодоминантный эпитоп (IEDB epitope ID 34851), который релевантен как для мышей C57/black (аллель H2-Db), так и для людей с наиболее распространенной аллелью HLA-A*02:01. Таким образом, использование последовательности SEQ ID NO: 2 при конструировании вирусов гриппа с укороченным NS1 и вставкой фрагмента белка N вируса SARS-CoV-2 увеличивает способность данных вирусов стимулировать Т-клеточный иммунный ответ.

Пример 5. Аттенуация для лабораторных мышей рекомбинантного вируса гриппа, кодирующего фрагмент белка N вируса SARS-CoV-2 в составе рамки считывания укороченного белка NS1.

Оценка безопасности была проведена на основе показателей динамики массы тела и летальности в группах лабораторных мышей C57/black, иммунизированных прототипным штаммом A/PR8-NS124_N211 (как описано в Примере 4) по сравнению с вирусом гриппа «дикого типа» A/PR8-NSwt и аттенуированным вирусным вектором без вставки A/PR8-NS124. Анализ динамики массы тела привитых животных с использованием теста множественных сравнений Даннета показал значимо меньшее снижение массы тела животных, получивших A/PR8-NS124_N211 по сравнению с группой животных, получивших вирус гриппа «дикого» типа, начиная со 2-го дня после иммунизации (р<0,05). Снижение массы тела животных в группе A/PR8-NS124_N211 была сопоставима с группой аттенуированного вектора без вставки (Фиг. 6). Полученные данные свидетельствуют об аттенуированном фенотипе вакцинного кандидата по сравнению с вирусом гриппа «дикого» типа. Также показано отсутствие усиления патогенности вакцинного кандидата по сравнению с аттенуированным вирусным вектором без вставки.

Фармакокинетика вакцинного кандидата была проанализирована по таким характеристикам, как репродукция в месте введения с образованием инфекционного потомства и диссеминация вирусного вектора от места аппликации в отдаленные органы (легкие и бронхи, носовые турбины, селезенка, мозг) методами ОТ-ПЦР и/или выделения инфекционного потомства в клеточной культуре. Сравнение фармакокинетических показателей проводили с группой животных, получивших подробно охарактеризованный аттенуированный гриппозный вектор без вставки A/PR8-NS124. На 4-й день исследования средний уровень вирусной нагрузки в тканях легких у животных, получивших вирус A/PR8-NS124_N211составлял 4.8 ± 0.4 lgТИД50 и значимо не отличался от такового для группы пустого вектора A/PR8-NS124 (4.6 ± 0.1). В обеих группах количество вирусной РНК в тканях легких была выше, чем в тканях верхних дыхательных путей (ΔCt колебалось от 5,8 до 10,6). В гомогенатах тканей селезенки и головного мозга РНК вируса гриппа выявлено не было ни у одного из экспериментальных животных. Таким образом, по показателям репродукции в респираторном тракте привитых животных (легкие, носовые турбины) прототипный штамм A/PR8-NS124_N211 проявлял аттенуированный фенотип на уровне охарактеризованного ранее гриппозного вектора без вставки, при этом не зафиксировано диссеминация штамма в отдаленные органы при интраназальном применении.

Пример 6.Защитная эффективность прототипного рекомбинантного вируса гриппа, кодирующего фрагмент белка N вируса SARS-CoV-2 в составе рамки считывания укороченного белка NS1, на модели экспериментального заражения сирийских хомячков вирусом SARS-CoV-2

В исследовании использовали самок сирийских хомячков в возрасте 3-4 недели на момент первой вакцинации. Животных иммунизировали интраназально под наркозом, вводя препараты вирусов или плацебо в оба носовых хода, в каждой группе было по 6 животных. Доза прототипного штамма и контрольного вектора без вставки составляла 7.0 lgЭИД50/животное. Заражение животных проводили через 4 недели после иммунизации. Вирус SARS-CoV-2 (клинический изолят, номер в коллекции 11308А, клайд GR, линия B.1.1) вводили интраназально в оба носовых хода, в дозе 5 lgТЦИД50/животное в объеме 100 мкл/животное. После заражения и до эвтаназии проводили ежедневный клинический осмотр с регистрацией массы и температуры тела животных. Через 3 и 6 дней после заражения по 3 животных из группы подвергали эвтаназии с забором сывороток и органов для оценки иммунологических показателей и тяжести течения инфекции.

Вирусовыделение из нижних и верхних дыхательных путей животных изучали на 3-и сутки после заражения по инфекционной активности вируса в суспензии органов, измеренной методом титрования в клетках Vero. У контрольных животных (группа плацебо) отмечены высокие титры вируса SARS-CoV-2 в легких (до 8,5 lgTЦИД50/мл), трахее (до 6,7 lgТЦИД50/мл) и носовых ходах (до 8,0 lgTЦИД50/мл). Статистически значимое подавление инфекционной активности вируса в легких и носовых ходах было отмечено у животных, иммунизированных прототипным штаммом A/PR8-NS124_N211, которое составило в легких – 0,9 lg и в носовых ходах – 1,2 lg (Фиг. 8).

Полученные результаты демонстрируют защитную эффективность против COVID-19 рекомбинантного вируса гриппа, кодирующего фрагмент белка N вируса SARS-CoV-2 в составе рамки считывания укороченного белка NS1, при профилактическом введении наивным животным.

Пример 7. Защитная эффективность вакцинных штаммов, кодирующего фрагмент белка N вируса SARS-CoV-2 в составе рамки считывания укороченного белка NS1, на модели экспериментального заражения мышей вирусом SARS-CoV-2 вариант бета

В исследовании использовали мышей BALB/c (самки, 6-8 недель, Питомник лабораторных животных «Пущино» РАН). В каждой экспериментальной группе было по 15 животных, в группе интактных было 5 животных. Первую группу мышей прививали двукратно интраназально вакцинными штаммами в дозе 6.0 lgЭИД50 (штаммы A/Cambodia/NS124_N (H3N2) и A/Guangdong/NS124_N (H1N1pdm09). В качестве контроля неспецифической активации иммунитета группу мышей прививали аттенуированным гриппозным вектором без вставки в аналогичной дозе. Для схемы «прайм-буст» мышей сначала прививали внутримышечно очищенным формалин-инактивированным коронавирусом, сорбированным на гидроксиде алюминия, затем через 3 недели проводили «буст»-вакцинацию вакцинным штаммом A/Guangdong/NS124_N (H1N1pdm09). В качестве контроля служили мыши, получившие только «прайм»- иммунизацию инактивированным коронавирусом, в аналогичной дозе - 2.5 мкг с 10 мкг гидроксида алюминия. Группа контроля заражения получала плацебо (фосфатно-солевой буфер) интраназально двукратно. Также исследование содержало группу интактных мышей для контроля фоновых иммунологических реакций.

Через 3 недели после второй иммунизации всех мышей, кроме интактных, инфицировали новым коронавирусом SARS-CoV-2 генетической линии бета (южноафриканский вариант), который способен заражать мышей без предварительной адаптации [R. Kant et al., “Common Laboratory Mice Are Susceptible to Infection with the SARS-CoV-2 Beta Variant,” Viruses, vol. 13, no. 11, 2021, doi: 10.3390/v13112263].

После заражения у животных ежедневно определяя массу тела (Фиг. 9А). Контрольные животные, получившие плацебо, на фоне заражения существенно похудели, потеряв до 85 % исходного веса на 3-ий день после инфекции. Мыши, праймированные внутримышечно инактивированным коронавирусом, продемонстрировали быстрое снижение веса в первые сутки после заражения, которое усилилось на второй день, после чего вес постепенно восстановился. Мыши, привитые вакцинными штаммами или контрольным вектором без вставки, на фоне заражения худели меньше, чем животные из группы плацебо, и полностью восстановили вес к 5-м суткам. Мыши, привитые по схеме «прайм-буст», практически не худели на фоне заражения. Полученные результаты могут свидетельствовать о значительной роли бустирующей интраназальной иммунизации в снижении тяжести течения инфекции.

На 5-ый день после заражения у контрольных и иммунизированных животных определили вирусную нагрузку в легких. Количество вируса оценивали методом титрования образцов бронхо-альвеолярного лаважа в культуре клеток Vero (Фиг. 9Б). Двукратная иммунизация вакцинными штаммами статистически значимо снижала количество инфекционного вируса (на 1.4 lgТИД50) в легких мышей. Наибольшее снижение вирусной нагрузки зафиксировано у мышей, иммунизированных инактивированным коронавирусом или в схеме прайм-буст, у них на 5-е сутки после заражения в БАЛ не обнаружено инфекционного вируса.

Полученные результаты демонстрируют защитную эффективность против COVID-19 вакцинных штаммов на основе рекомбинантного вируса гриппа, кодирующего фрагмент белка N вируса SARS-CoV-2 в составе рамки считывания укороченного белка NS1, при двукратном профилактическом введении наивным животным и при однократном введении праймированным животным.

Пример 8. Защитная эффективность вакцинных штаммов, кодирующего фрагмент белка N вируса SARS-CoV-2 в составе рамки считывания укороченного белка NS1, на модели летальной гриппозной инфекции у мышей.

В исследовании кросс-протекции использовали белых беспородных мышей BALB/c (самки, 6-8 недель, Питомник лабораторных животных «Рапполово»). В каждой экспериментальной группе было по 10 животных. Заражение мышей проводили через 28 дней после второй вакцинации интраназально в дозе 10 МЛД50/животное в объеме 30 мкл. Для заражения использовали патогенные для мышей штаммы A/Aichi/2/68 (H3N2) и A/California/07/2009 (H1N1pdm09), полученные из коллекции вирусов ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России. Все использованные вирусы вызвали летальную инфекцию у мышей в группе плацебо, приведшую к гибели от 60 % до 70 % животных. При этом в группе вакцинированных животных гибели мышей не наблюдали (Фиг 10 Б и Г). В группе плацебо зараженные мыши теряли в среднем от 20 до 40 % веса. В группах мышей, иммунизированных вакцинными штаммами, наблюдали незначительное снижение массы тела мышей, которое не превышало 5-7 % от исходных значений и было значимо ниже, чем в группе плацебо (Фиг 10.А и В).

Полученные результаты демонстрируют защитную эффективность против гриппозной инфекции вакцинных штаммов на основе рекомбинантного вируса гриппа, кодирующего фрагмент белка N вируса SARS-CoV-2 в составе рамки считывания укороченного белка NS1, при двукратном профилактическом введении наивным животным.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Recombinant

influenza virus intended for the prevention of Covid-19 and

influenza, method of its production and use11.xml" softwareName="WIPO

Sequence" softwareVersion="2.2.0" productionDate="2022-12-25">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate></FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>0</ApplicantFileReference>

<ApplicantNamelanguageCode="ru">Smorodintsev Research Institute of

Influenza of the Ministry of Health of the Russian

Federation</ApplicantName>

<InventionTitlelanguageCode="ru">Recombinant influenza virus

intended for the prevention of Covid-19 and influenza, method of its

production and use</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceDatasequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>12</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..12</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Immunodominant and signal sequence

derived from SARS-CoV-2 nucleoprotein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..12</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q9">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Severe acute respiratory syndrome-related

coronavirus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>LALLLLDRLNQL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceDatasequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>9</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..9</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Signal sequence derived from SARS-CoV-2

nucleoprotein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..9</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Severe acute respiratory syndrome-related

coronavirus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>KKPRQKRTA</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceDatasequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>287</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..287</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Chimearic protein comprising truncated

NS1 (1-124) from Influenza A virus and (211-369) fragment of

SARS-CoV-2 nucleoprotein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..287</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGST

LGLDIETATRAGKQIVERILKEESDEALKMTMASVPASRYLTDMTLEEMSREWSMLIPKQKVAGPLCIRM

DQAIMGGLEAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVT

QAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDD

KDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPK</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceDatasequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>267</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..267</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q7">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Chimearic protein comprising truncated

NS1 (1-124) from Influenza A virus and (231-369) fragment of

SARS-CoV-2 nucleoprotein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..267</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>RVADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERIL

KEESDEALKMTMASVPASRYLTDMTLEEMSREWSMLIPKQKVAGPLCIRMDQAIMGGLEAGNGGDAALAL

LLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQEL

IRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYK

TFPPTEPK</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области медицины, биотехнологии и вирусологии. Описан способ получения рекомбинантного вируса гриппа, предназначенного для профилактики COVID-19 и гриппа. Способ характеризуется использованием в составе рамки считывания укороченного белка NS1 вируса гриппа гетерологичного фрагмента, содержащего, но не ограничивающегося, иммунодоминантные и сигнальные последовательности SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2, заимствованные из белка N вируса SARS-CoV-2. Представлены: рекомбинантный вирус гриппа, полученный указанным способом, который является вирусом гриппа А с укороченным до 124 аминокислот белком NS1, содержащим последовательности SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2; рекомбинантный вирус гриппа A/Guangdong/NS124_N (H1N1pdm09), семейство Orthomyxoviridae, род Influenza Virus A, полученный указанным способом, депонированный в Государственной коллекции вирусов под № 2981; рекомбинантный вирус A/Cambodia/NS124_N (H3N2), семейство Orthomyxoviridae, род Influenza Virus A, полученный указанным способом, депонированный в Государственной коллекции вирусов под № 2982. Описан способ профилактики COVID-19 и гриппа, характеризующийся иммунизацией субъектов любым из представленных рекомбинантных вирусов гриппа посредством интраназального введения. Технический результат - получение высокопродуктивных генетически стабильных рекомбинантных вирусных гриппов на основе гриппозного вектора, экспрессирующих фрагмент белка Nвируса SARS-CoV-2, которые в режиме интраназального введения индуцируют выраженный поствакцинальный N-специфический гуморальный и Т-клеточный иммунный ответ и обеспечивают кросс-специфичную защиту от инфекции вирусом SARS-CoV-2 и гриппа. Указанный технический результат достигается за счет того, что способ получения рекомбинантного вируса гриппа заключается в использовании вируса гриппа, кодирующего в составе рамки считывания укороченного до 124 аминокислотных остатков белка NS1 гетерологичный фрагмент, содержащий, но не ограничивающийся, последовательностями SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2, заимствованными из белка N вируса SARS-CoV-2, которые обеспечивают более высокий уровень репродукции рекомбинантного вируса в основных субстратах производства, более активную экспрессию гетерологичного трансгена и более высокую иммуногенность по сравнению с аналогичными рекомбинантными вирусами, не содержащими указанных последовательностей. 5 н. и 2 з.п. ф-лы, 10 ил., 4 табл., 7 пр.

1. Способ получения рекомбинантного вируса гриппа, предназначенного для профилактики COVID-19 и гриппа, характеризующийся использованием в составе рамки считывания укороченного белка NS1 вируса гриппа гетерологичного фрагмента, содержащего, но не ограничивающегося, иммунодоминантные и сигнальные последовательности SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2, заимствованные из белка N вируса SARS-CoV-2.

2. Рекомбинантный вирус гриппа, полученный способом по п.1, является вирусом гриппа А с укороченным до 124 аминокислот белком NS1, содержащим последовательности SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2.

3. Рекомбинантный вирус гриппа A/Guangdong/NS124_N (H1N1pdm09), семейство Orthomyxoviridae, род Influenza Virus A, полученный способом по п.1, депонированный в Государственной коллекции вирусов под № 2981.

4. Рекомбинантный вирус A/Cambodia/NS124_N (H3N2), семейство Orthomyxoviridae, род Influenza Virus A, полученный способом по п.1, депонированный в Государственной коллекции вирусов под № 2982.

5. Способ профилактики COVID-19 и гриппа, характеризующийся иммунизацией субъектов рекомбинантным вирусом гриппа по пп.2-4 посредством интраназального введения.

6. Способ профилактики COVID-19 и гриппа по п.5, характеризующийся иммунизацией рекомбинантным вирусом гриппа по пп.2-4 у иммунологически наивных и иммунологически праймированных субъектов.

7. Способ профилактики COVID-19 и гриппа по п.5 или 6, характеризующийся иммунизацией субъектов рекомбинантным вирусом гриппа по пп.2-4, путем однократного или двукратного введения с интервалом от 14 до 28 дней.