КОМПОЗИЦИЯ НОСИТЕЛЯ ДЛЯ ТРАНСПОРТА НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2011 года по МПК A61K31/7105 A61K47/18 A61K47/28 A61K47/44 A61K48/00 

Уровень техники

Настоящее изобретение относится к низко-токсичной и высоко-безопасной композиции носителя для доставки нуклеиновой кислоты, композиции носителя, которая при использовании для введения нуклеиновой кислоты, такой как siРНК, в клетки животных или в организм, способна эффективно доставить нуклеиновую кислоту в клетки, в то же время, защищая нуклеиновую кислоту от деградации; и к композиции для доставки нуклеиновой кислоты.

Предпосылки создания изобретения

По последним данным биотехнологии было показано, что различные нуклеиновые кислоты проявляют биоактивные функции в клетках. Например, известно, что siРНК (малые интерферирующие РНК) вызывают деградацию мРНК генов-мишеней в клетках и ингибируют, таким образом, экспрессию генов-мишеней (РНК интерференция). Ингибирование экспрессии генов-мишеней при помощи РНК интерференции используется для облегчения или лечения симптомов заболевания, вызванного аномальной экспрессией специфических генов или генных кластеров, и, таким образом, ожидается разработка siРНК в качестве терапевтических агентов. Однако для того, чтобы использовать нуклеиновые кислоты, такие как siРНК, в качестве терапевтических агентов, важно, чтобы такие нуклеиновые кислоты проявляли свои функции в клетках-мишенях. Для этой цели необходимо, чтобы была создана технология эффективной доставки нуклеиновых кислот в клетки-мишени.

Известные технологии доставки экзогенных молекул нуклеиновой кислоты или генов в клетки включают лечение трудноизлечимых заболеваний у человека с использованием различных вирусов, включая ретровирусы, аденовирусы, герпесвирусы и т.д. Однако такие способы лечения подразумевают трудности из-за проблем с инфицирующей способностью, иммунореактивностью, продуктивностью и т.п. Таким образом, разрабатываются невирусные носители, которые не имеют проблем, вызванных вирусами и которые способны доставлять молекулы нуклеиновой кислоты в клетки.

Например, в Патентном документе 1 сообщалось о катионном липиде, имеющем специфическую структуру, как о доставляющем носителе невирусной нуклеиновой кислоты, который обеспечивает доставку нуклеиновых кислот, таких как siРНК, в клетки. Однако катионный липид, о котором сообщалось в Патентном документе 1, имеет недостаток в том, что проявляет токсичность при введении в культивируемые клетки или в организмы. Патентный документ 2 сообщает о композиции носителя, содержащей амфифильное соединение и поликатионы в качестве относительно низко-токсичного носителя, который может доставлять siРНК в клетки. Однако композиция, описанная в Патентном документе 2, также имеет проблемы, состоящие в ее токсичности для клеток при введении в них достаточного количества siРНК.

На фоне известного уровня техники является желательной разработка низко-токсичной композиции носителя для доставки нуклеиновой кислоты, которая может эффективно доставлять нуклеиновые кислоты, такие как siРНК, в клетки.

Патентный документ 1

Публикация нерассмотренной японской патентной заявки № 2002-529439

Патентный документ 2

Публикация нерассмотренной японской патентной заявки № 2005-508394

Сущность изобретения

Проблемы, которые решает изобретение

Целью настоящего изобретения является решить вышеупомянутые проблемы известного уровня техники. В частности, целью настоящего изобретения является получение композиции носителя, доставляющей нуклеиновые кислоты, с низкой токсичностью и высокой безопасностью, композиции носителя, при использовании которой для введения нуклеиновой кислоты, такой как siРНК, в клетки животных или в организм, способной эффективно доставить нуклеиновые кислоты в клетки, в то же время, защищая нуклеиновую кислоту от деградации; и композиции для доставки нуклеиновой кислоты, содержащей композицию носителя и нуклеиновую кислоту.

Средства решения проблем

Авторы настоящего изобретения провели обширные исследования, чтобы решить вышеупомянутые проблемы, и обнаружили, что композиция, содержащая (А) катионный липид со стероидным скелетом (стероидным ядром) в сочетании с (В) катионным липидом типа соли четвертичного аммония, пригодна в качестве носителя, доставляющего нуклеиновую кислоту, поскольку она обладает низкой токсичностью и способна эффективно доставлять нуклеиновые кислоты, в то же время, защищая нуклеиновые кислоты от деградации. Настоящее изобретение было осуществлено при помощи дальнейших исследований, основанных на этих открытиях.

Настоящее изобретение обеспечивает следующие пункты:

Пункт 1. Композиция носителя для доставки нуклеиновой кислоты, содержащая (А) катионный липид со стероидным скелетом (стероидным ядром) и (В) катионный липид типа соли четвертичного аммония.

Пункт 2. Композиция носителя по п.1, дополнительно содержащая (С) вещество на масляной основе.

Пункт 3. Композиция носителя по п.1, где компонент (А) представляет собой 3β-[N-(N',N'-диметиламиноэтан)карбамоил]холестерин и/или иодид 3β-[N',N',N'-триметиламиноэтан]холестерина.

Пункт 4. Композиция носителя по п.1, где компонент (В) является по крайней мере одним членом, выбранным из группы, состоящей из соли бромида диметилдиоктадециламмония, диолеоилтриметиламмонийпропана и гидрохлорида N-[1-(2,3-бис(олеоилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмония.

Пункт 5. Композиция носителя по п.1, где компонент (В) содержится в пропорции от 10 до 200 весовых частей на 100 весовых частей компонента (А).

Пункт 6. Композиция носителя по п.1, которая является композицией носителя для доставки siРНК.

Пункт 7. Композиция для доставки нуклеиновой кислоты, содержащая композицию носителя по любому из пп.1-5 и нуклеиновую кислоту.

Пункт 8. Композиция для доставки нуклеиновой кислоты по п.7, где нуклеиновой кислотой является siРНК.

Пункт 9. Способ введения нуклеиновой кислоты, включающий приведение композиции для доставки нуклеиновой кислоты по п.7 в контакт с клеткой для введения нуклеиновой кислоты в клетку.

Пункт 10. Применение (А) катионного липида со стероидным скелетом в сочетании с (В) катионным липидом типа соли четвертичного аммония для получения композиции носителя для доставки нуклеиновой кислоты.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 показывает результаты микроскопического исследования флуоресцентных изображений, полученных от нуклеиновой кислоты клеток после лечения с использованием каждого из тестируемых образцов;

Фиг.2 показывает таблицы, иллюстрирующие результаты измерения активности люциферазы клеток после лечения с использованием каждого из тестируемых образцов;

Фиг.3 показывает результаты измерения активности неприлизина (NEP) в легких крыс;

Фиг.4 показывает результаты измерения количества живых клеток после лечения с использованием каждого из тестируемых образцов; и

Фиг.5 показывает результаты окрашивания срезов тканей легкого крыс гематоксилином и эозином, на которых ядра, рибосомы и т.д. окрашены гематоксилином от синего до голубого, и цитоплазма, мембраны и красные кровяные клетки окрашены эозином красным.

Результаты изобретения

Композиция носителя для доставки нуклеиновой кислоты и композиция для доставки нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению обеспечивают следующие замечательные результаты.

(1) Нуклеиновые кислоты могут эффективно доставляться в клетки таким образом, что они могут эффективно проявлять свои функции в клетках.

(2) Деградация нуклеиновых кислот может быть подавлена в организмах и в культуральной среде.

(3) Переносчик и композиция обладают низкой токсичностью и высокой безопасностью.

Вследствие этого, композиция носителя для доставки нуклеиновой кислоты и композиция для доставки нуклеиновой кислоты пригодны для лечения различных заболеваний при помощи введения нуклеиновой кислоты и, в частности, для лечения трудноизлечимых заболеваний, которые трудно вылечить при помощи низкомолекулярных соединений.

Композиция для доставки нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению обладает также тем преимуществом, что она может быть лиофилизована, и таким образом, может храниться в лиофилизованном состоянии.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения

Ниже настоящее изобретение описано подробно.

Композиция носителя для доставки нуклеиновой кислоты

Композиция носителя для доставки нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению содержит (А) катионный липид со стероидным скелетом (стероидным ядром) и (В) катионный липид типа соли четвертичного аммония.

Композиция носителя по настоящему изобретению используется в качестве носителя для доставки (введения) нуклеиновых кислот в клетки.

Нуклеиновые кислоты, которые могут быть использованы с композицией носителя по настоящему изобретению, не имеют ограничений по виду и структуре при условии, что их нужно доставлять в клетки. Примеры таких нуклеиновых кислот включают siРНК, мРНК, тРНК, рРНК, кДНК, miРНК (микро РНК), рибозимы, антисмысловые олигонуклеотиды, ложные олигонуклеотиды, ДНК плазмиды, пептид-нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды, формирующие триплексы (TFO), гены и т.д. В частности, композиция носителя по настоящему изобретению используется для доставки siРНК в клетки. Нуклеиновые кислоты, доставляемые композицией носителя по данному изобретению, могут быть получены из людей, животных, растений, бактерий, вирусов и т.д., или химически синтезированы. Кроме того, такие нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными, двухцепочечными или трехцепочечными и не имеют ограничений по молекулярной массе. Кроме того, по настоящему изобретению также могут применяться нуклеиновые кислоты, модифицированные при помощи химических веществ, ферментов или пептидов. По настоящему изобретению такие нуклеиновые кислоты могут быть использованы отдельно или в сочетании.

Катионный липид со стероидным скелетом (здесь и далее иногда именуемый как «компонент (А)»), используемый в композиции носителя по настоящему изобретению, является липидом, который является катионным и имеет стероидный скелет (пергидроциклопентафенантреновое кольцо; С₁₇Н₂₈). Катионный липид со стероидным скелетом для использования по настоящему изобретению не имеет ограничений при условии, что он является фармацевтически приемлемым. Конкретные примеры таких липидов включают 3β-[N-(N',N'-диметиламиноэтан)карбамоил]холестерин (DC-Chol), иодид 3β-[N',N',N'-триметиламиноэтан]холестерина (TC-Chol), бис(гуинидин)-трен-холестерин (BGTC), N-холестерилоксикарбонил-3,7-диазанонан-1,9-диамин, β-аланин-диэтаноламин-холестерин, N⁴-сперминхолестерилкарбамат (GL-67), N[N⁴-3-аминопропилспермидин]холестерил карбамат (GL-78), N⁴-сперминхолестерилкарбоксиамид (GL-90), N¹,N⁸-бис(аргининкарбоксиамид)-N⁴-спермидинхолестерилкарбамат (GL-95), N-[N¹,N⁴,N⁸-трис(3-аминопропил)спермидин]холестерилкарбамат (GL-96) и подобные производные холестерина (катионные липиды с холестериновым скелетом); скваламин, 3α,7α,12α-трис(3-аминопропокси)-5β-холан-24-(N,N-бис(3-аминопропил)амин), 3α,7α,12α-трис(3-аминопропокси)-5β-холан-24-(N-(N-(3-аминопропил))-3-аминопропил)амин, 3α,7α,12α-трис(3-азидопропокси)-5β-холан-24-(N,N-бис(2-цианоэтил)амин)), 3α,7α,12α-трис(3-азидопропокси)-5β-холан-24-(N-(бензилоксикарбонил)-N-(3-гидроксипропил)амин) и подобные катионные липиды, с которыми связываются стероиды; колоколообразные сперминовые конъюгаты и подобные катионные липиды, с которыми связывается холевая кислота; катионные липиды, с которыми связывается стерольный гликозид; катионные липиды с которыми связывается стероидный сапонин; и т.д.

Такие простые катионные липиды со стероидным скелетом могут быть использованы отдельно или в сочетании.

Предпочтительные примеры катионных липидов со стероидным скелетом включают производные холестерина (катионные липиды с холестериновым скелетом), и более предпочтительные их примеры включают 3β-[N-(N',N'-диметиламиноэтан)карбамоил]холестерин и иодид 3β-[N',N',N'-триметиламиноэтан]холестерина (TC-Chol).

Катионный липид типа соли четвертичного аммония для использования в настоящем изобретении (здесь и далее иногда именуемый как «компонент (В)») не имеет ограничений при условии, что он является фармацевтически приемлемым. Его конкретные примеры включают бромид диметилдиоктадециламмония (DDAB), 1,2-димиристоил-3-триметиламмонийпропан, 1,2-диолеоил-3-триметиламмонийпропан (DOTAP), 1,2-диолеоил-3-триметиламмонийпропанметилсульфат, 1,2-дипалмитоил-3-триметиламмонийпропан, 1,2-дистеароил-3-триметиламмонийпропан, гидрохлорид N-(1-(2,3-бис(олеоилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмония (DOTMA), бромид димиристоилоксипропилдиметилгидроксиэтиламмония (DMRIE), бромид диолеоилоксипропилдиметилгидроксиэтиламмония (DORIE), бромид диметилдидодециламмония, гидрохлорид N-(α-триметиламмониоацетил)дидодецил-D-глютамина, гидрохлорид N-(α-триметиламмониоацетил)-О,O'-бис-(1Н,1Н,2Н,2Н-перфтордецил)-L-глютамина, гидрохлорид О,O'-дидодеканоил-N-(α-триметиламмониоацетил)диэтаноламина, бромид метилаллилдидодециламмония, гидрохлорид N-{p-(ω-триметиламмониобутилокси)бензоил}-дидодецил-L-глютамина, бромид 9-(ω-триметиламмониобутил)-3,6-бис(додеканоил)карбазола, гидрохлорид диметилдиоктадециламмония, бромид N-ω-триметиламмониодеканоил-дигексадецил-D-глютамина, бромид N-{p-(ω-триметиламмониогексилокси)-бензоил}-дитетрадецил-L-глютамина, бромидная соль p-(ω-триметиламмониодецилокси)-p'-октилоксиазобензола (MC-1-0810), бромидная соль p-{ω-(β-гидроксиэтил)диметил-аммонио-децилокси}-p'-октилоксиазобензола (МС-3-0810), бромидная соль О,О',O''-тридодеканоил-N-(ω-триметил-аммониодеканоил)трис(гидроксиметил)аминометана (ТС-1-12), 1,2-дилаурил-глицеро-3-этилфосфохолин, 1,2-димиристоил-глицеро-3-этилфосфохолин, 1,2-дипальмитоил-глицеро-3-этилфосфохолин, 1,2-дистеароил-глицеро-3-этилфосфохолин, 1,2-диолеоилглицеро-3-этилфосфохолин, 1-пальмитоил-2-ореоил-глицеро-3-этилфосфохолин и т.д. Такие катионные липиды типа соли четвертичного аммония могут быть использованы отдельно или в сочетании.

Среди таких катионных липидов типа солей четвертичного аммония предпочтительными являются бромид диметилдиоктадециламмония (DDAB), диолеилтриметиламмонийпропан (DOTAR), гидрохлорид N-(1-(2,3-бис(олеоилокси)пропил))-N,N,N-триметиламмония (DOTMA), гидрохлорид O,O'-дидодеканоил-N-(α-триметиламмониоацетил)диэтаноламина (DC-6-12, n=12; и DC-6-14, n=14), бромидная соль p-{ω-(β-гидроксиэтил)диметиламмонио-децилокси}-p'-октилоксиазобензола (МС-3-0810) и бромид O,O',O''-тридодеканоил-N-(ω-триметил-аммониодеканоил)трис(гидроксиметил)аминометана (ТС-1-12); и особенно предпочтительными являются бромид диметилдиоктадециламмония (DDAB), диолеоилтриметиламмонийпропан (DOTAR) и гидрохлорид N-(1-(2,3-бис(олеоилокси)пропил))-N,N,N-триметиламмония (DOTMA).

В композиции носителя по настоящему изобретению пропорция компонента (А) к компоненту (В) не имеет ограничений, и, с точки зрения улучшения эффективности доставки нуклеиновой кислоты в клетки, пропорция компонента (В) может быть, например, от 10 до 200 весовых частей, предпочтительно от 30 до 150 весовых частей и более предпочтительно от 75 до 125 весовых частей на 100 весовых частей компонента (А). Общая доля компонентов (А) и (В) от общего количества композиции носителя по настоящему изобретению может составлять, например, от 10 до 100 вес.%, предпочтительно от 20 до 80 вес.% и более предпочтительно от 40 до 70 вес.%.

Композиция носителя по настоящему изобретению может содержать вещество на масляной основе (здесь и далее иногда именуемый как «компонент (С)»), в дополнение к компонентам (А) и (В). Когда добавляют вещество на масляной основе, его свойства дают возможность регулировать эффективность введения нуклеиновой кислоты при помощи композиции, доставляющей нуклеиновую кислоту. Например, когда вещество на масляной основе добавлено, чтобы довести композицию носителя до конкретной плотности, степень контакта композиции носителя с клетками может регулироваться, улучшая таким образом эффективность их введения in vitro. С другой стороны, например, когда добавлено температурно-чувствительное вещество на масляной основе, ядро композиции носителя может быть дезинтегрировано при заданных температурных условиях, чтобы индуцировать флуктуации на поверхности клетки, тем самым, улучшая эффективность введения нуклеиновой кислоты. Кроме того, с другой стороны, например, когда добавляют вещество на масляной основе, которое обладает деструктивной способностью под воздействием внешних стимулов, ядро композиции носителя может быть дезинтегрировано при помощи внешнего стимула, чтобы индуцировать флуктуации на поверхности клетки, тем самым, улучшая эффективность введения нуклеиновой кислоты.

Примеры веществ на масляной основе, которые могут быть добавлены к композиции носителя по настоящему изобретению, включают перфторуглерод, перфторпентан, бромид перфтороктила, перфторгексан, перфтортрибутиламин, соевое масло, рафинированное соевое масло, гидрогенизированное соевое масло, неомыленное соевое масло, сквален, касторовое масло, гвоздичное масло, сорбитантриолеат, скипидарное масло, сафлоровое масло, жирную кислоту сафлорового масла, масляную кислоту, пальмовое масло, рапсовое масло, сивушное масло, оливковое масло, льняное масло, кунжутное масло, хлорофилловое масло, кротоновое масло, бергамотовое масло, кедровое масло, апельсиновое масло, фенхелевое масло, эвкалиптовое масло, кукурузное масло, лавандовое масло, майорановое масло, лимонное масло, хлопковое масло, кокосовое масло, масло яичного желтка, розовое масло, сосновое масло, миндальное масло, арахисовое масло, масло камелии, белое камфорное масло, масло ромашки, коричное масло, масло перечной мяты, этерифицированное кукурузное масло, имбирное масло, эфирное масло римской ромашки, эфирное масло из растения, кудрявомятное масло, подсолнечное масло, масло какао, масло зародышей пшеницы, оксидноцинковое масло, твердые масла, гидрогенизированные растительные масла, светлый жидкий парафин, жидкий парафин, триглицериды среднецепочечных жирных кислот, молочное масло, полутвердое апельсиновое масло, полиоксиэтиленовое касторовое масло, полиоксиэтиленовое гидрогенизированное касторовое масло 10, полиоксиэтиленовое гидрогенизированное касторовое масло 100, полиоксиэтиленовое гидрогенизированное касторовое масло 20, полиоксиэтиленовое гидрогенизированное касторовое масло 40, полиоксиэтиленовое гидрогенизированное касторовое масло 5, полиоксиэтиленовое гидрогенизированное касторовое масло 50, полиоксиэтиленовое гидрогенизированное касторовое масло 60, полиоксил 35 касторовое масло, технологические масла и т.д. Среди таких веществ на масляной основе перфторпентан является температурно-чувствительным и характеризуется кипением и переходом в газообразное состояние при 29,5˚С. Кроме того, перфторгексан, бромид перфтороктила и перфтортрибутиламин обладают деструктивной способностью под воздействием внешних стимулов и характеризуются способностью вызывать кавитацию в ядре композиции носителя и дезинтегрировать его, при получении внешнего стимула, такого как ультразвуковое излучение.

Когда содержится вещество на масляной основе, его доля не имеет ограничений при условии, что эффекты настоящего изобретения не нарушаются, и может составлять, например, от 0,1 до 50 весовых частей, предпочтительно от 1 до 30 весовых частей, более предпочтительно от 5 до 20 весовых частей на 100 частей по общему весу компонентов (А) и (В).

Носитель, доставляющий нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, кроме того, может содержать мембранно-фузогенный липид (вспомогательный липид), при необходимости. Композиция носителя по настоящему изобретению, когда содержит такой расплавляющий мембрану липид, имеет дополнительно улучшенную эффективность доставки нуклеиновой кислоты в клетки. Примеры таких расплавляющих мембрану липидов включают диолеоилфосфатидилэтаноламин, диолеоилфосфатидилхолин, трансфосфатидилфосфатидилэтаноламин, 1,2-бис-(10,12-трикосадиноил)-фосфоэтаноламин, 1,2-диэлаидоилфосфоэтаноламин, 1,2-дигексадецилфосфоэтаноламин, 1,2-дигексаноилфосфоэтаноламин, 1,2-дилауроилфосфоэтаноламин, 1,2 -дилинолеоилфосфоэтаноламин, 1,2-димиристоилфосфоэтаноламин, 1,2-диолеоилфосфоэтаноламин, 1,2-дипальмитолеоилфосфоэтаноламин, 1,2-дипальмитоилфосфоэтаноламин, 1,2-дифитаноилфосфоэтаноламин, 1,2-дистеароилфосфоэтаноламин, 1-пальмитоил-2-олеоилфосфоэтаноламин, 1-пальмитоил-2-(10,12-трикосадиноил)фосфоэтаноламин, 1,2-диолеоилфосфоэтаноламин-N-капроиламин, 1,2-дипальмитоилфосфоэтаноламин-N-капроиламин, 1,2-диолеоилфосфоэтаноламин-N,N-диметил, 1,2-дипальмитоилфосфоэтаноламин-N,N-диметил, 1,2-дипальмитоилфосфоэтаноламин-N-додеканоил, 1,2-диолеоилфосфоэтаноламин-N-додеканоил, 1,2-диолеоилфосфоэтаноламин-N-додеканиламин, 1,2-дипальмитоилфосфоэтаноламин-N-додеканиламин, 1,2-диолеоилфосфоэтаноламин-N-глутарил, 1,2-дипальмитоилфосфоэтаноламин-N-глутарил, 1,2-диолеоилфосфоэтаноламин-N-лактозу, 1,2-диолеоилфосфоэтаноламин-N-[4(р-малеимидметил)циклогексан]-карбоксилат, дипальмитоилфосфоэтаноламин-N-[4(р-малеимидметил)циклогексан]-карбоксилат, 1,2-дипальмитоилфосфоэтаноламин-N-[4(р-малеимидфенил)бутиламид], 1,2-диолеоилфосфоэтаноламин-N-[4(р-малеимидфенил)бутират], 1,2-диолеоилфосфоэтаноламин-N-метил, дипальмитоилфосфоэтаноламин-N-метил, 1,2-диолеоилфосфоэтаноламин-N-[3-(2-пиридилдитио)пропионат], 1,2-дипальмитоилфосфоэтаноламин-N-[3-(2-пиридилдитио)пропионат], 1,2-диолеоилфосфоэтаноламин-N-(сукцинил), 1,2-дипальмитоилфосфоэтаноламин-N-(сукцинил) и т.д. Среди таких липидов диолеоилфосфатидилэтаноламин может быть успешно использован в носителе, доставляющем нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению.

Когда содержится такой расплавляющий мембрану липид, его доля не имеет ограничений при условии, что эффекты настоящего изобретения не нарушаются, и может составлять, например, от 1 до 500 весовых частей, предпочтительно от 10 до 250 весовых частей и более предпочтительно от 25 до 100 весовых частей на 100 частей по общему весу компонентов (А) и (В).

Композиция носителя по настоящему изобретению может содержать различные добавки, такие как изотонирующие агенты, инертные наполнители, разбавители, загустители, стабилизаторы, буферы, консерванты и т.д., в соответствии с требованиями. Количество таких добавок для добавления может быть подходяще выбрано в зависимости от формы использования композиции носителя.

Композиция носителя по настоящему изобретению может быть получена смешиванием компонентов (А) и (В) и, необязательно, других компонентов.

Композиция для доставки нуклеиновую кислоту

Композиция для доставки нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включает композицию носителя, описанную выше, и нуклеиновую кислоту. В этой композиции нуклеиновая кислота формирует комплекс с компонентом(ами) композиции носителя посредством ионных и/или гидрофобных связей таким образом, что композиция для доставки нуклеиновой кислоты обладает улучшенной доставкой нуклеиновой кислоты в клетки.

Композицию для доставки нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению получают смешиванием композиции носителя с нуклеиновой кислотой или смешиванием нуклеиновой кислоты с компонентами композиции носителя в любом порядке.

В композиции для доставки нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению пропорция нуклеиновой кислоты к композиции носителя варьирует в зависимости от типов нуклеиновой кислоты и носителя для доставки нуклеиновой кислоты, типа клетки, как мишени доставки нуклеиновой кислоты и т.д., и доля нуклеиновой кислоты может составлять, например, от 0,1 до 300 весовых частей, предпочтительно от 1 до 100 весовых частей и более предпочтительно от 2,5 до 50 весовых частей на 100 частей по общему весу компонентов (А) и (В).

Кроме того, общее количество компонентов (А) и (В) в композиции для доставки нуклеиновой кислоты может составлять, например, от 10 до 90 вес.%, предпочтительно от 30 до 80 вес.% и более предпочтительно от 50 до 70 вес.% от общего веса композиции.

Композиция для доставки нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может содержать различные добавки, такие как изотонирующие агенты, инертные наполнители, разбавители, загустители, стабилизаторы, буферы, консерванты и т.д., в соответствии с формой использования. Количество таких добавок может быть подходяще выбрано в зависимости от формы использования композиции для доставки нуклеиновой кислоты.

В настоящем изобретении примеры клеток, к которым могут доставляться нуклеиновые кислоты, включают культивируемые клетки, клетки, выделенные из организмов (включая устойчивые клеточные линии), клетки in vivo и т.д.

Форма использования композиции для доставки нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению не имеет ограничений при условии, что композиция может прийти в контакт с клетками-мишенями для введения нуклеиновой кислоты. Когда нуклеиновая кислота доставляется в клетки in vivo, примеры форм использования композиции включают прямую инъекцию в ткани; инъекцию под кожу или в вену, мышцу, брюшную полость, глаз, пищеварительный орган, зуб и т.д.; введение при помощи вдыхания в полость носа, ротовую полость, легкие и т.д.; пероральное введение; трансдермальное введение; и трансмукозальное введение через слизистую ротовой полости, вагинальную слизистую, слизистую глаза или слизистую матки; и т.п. С другой стороны, когда нуклеиновую кислоту вводят в культивируемые клетки или клетки, выделенные из организма, композиция для доставки нуклеиновой кислоты может быть, например, предварительно добавлена в среду для культивирования клеток. Нуклеиновая кислота может также быть доставлена в культивируемые клетки или клетки, выделенные из организма, в присутствии сыворотки крови.

Наиболее предпочтительный вариант осуществления изобретения

Настоящее изобретение детально описано выше со ссылками на примеры и т.п., которые не предполагают ограничение объема изобретения.

Пример 1

Была приготовлена композиция носителя для доставки нуклеиновой кислоты, имеющая следующую формулу.

Бромид диметилдиоктадециламмония 0,9 мкг 3β-[N-(N',N'-диметиламиноэтан)карбамоил]холестерин 0,9 мкг Диолеоилфосфатидилэтаноламин 0,9 мкг Глицерин 40,5 мкг Дистиллированная вода 2 мкл OPTI-MEM среда (производство Invitrogen Corporation) соответствующее количество Общее количество 50 мкл

Пример 2

Сначала был приготовлен раствор, который содержит нуклеиновую кислоту, имеющий следующий состав.

SiРНК 2 пмоля OPTI-MEM среда (производства Invitrogen Corporation) соответствующее количество Общее количество 50 мкл

Затем 50 мкл композиции носителя из примера 1 смешали с 50 мкл раствора, содержащего нуклеиновую кислоту, и смесь инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре так, чтобы получить композицию для доставки нуклеиновой кислоты.

Пример 3

Была приготовлена композиция носителя для доставки нуклеиновой кислоты, имеющая следующую формулу.

Бромид диметилдиоктадециламмония 0,5 мг 3β-[N-(N',N'-диметиламиноэтан)карбамоил]холестерин 0,5 мг Диолеоилфосфатидилэтаноламин 0,5 мкг Сахароза 88,9мг Дистиллированная вода соответствующее количество Общее количество 1,0 мл

Пример 4

Была приготовлена композиция носителя для доставки нуклеиновой кислоты, имеющая следующую формулу.

Бромид диметилдиоктадециламмония 0,5 мг 3β-[N-(N',N'-диметиламиноэтан)карбамоил]холестерин 0,5 мг Диолеоилфосфатидилэтаноламин 0,5 мкг Дистиллированная вода соответствующее количество Общее количество 1,0 мл

Тестовый пример 1

Чтобы оценить способность композиции для доставки нуклеиновой кислоты из примера 2 доставлять siРНК в клетки, были проведены следующие тесты с использованием клеток А549 (клеточный штамм, выделенный из рака легкого человека; Dainippon Pharmaceutical Co.Ltd.) в качестве модельных клеток. В этом тесте использовали флуоресцентно-меченную GL3-siРНК (siРНК, связывающая светящуюся люциферазу; Dharmacon Corporation, Боулдер-Сити, CO, США; Последовательность: 5'-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT; Антисенс: 5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT).

Сначала, клетки А549, концентрация которых была доведена до 1,2 × 10⁵ клеток/мл средой DMEM (Dulbecco-Minimum Essentian Medium), были посажены в 24-луночные планшеты в количестве 6,0 × 10⁴ клеток на лунку. Затем в каждую лунку добавили 500 мкл по одному каждого из тестовых образцов, показанных в таблице 1, и инкубировали при 37˚С в 5% СО₂ в течение 24 часов. Флуоресцентные изображения, полученные от нуклеиновой кислоты, в клетках наблюдались при помощи флуоресцентного микроскопа (флуоресцентный микроскоп Olympus IX 71; Olympus, Токио, Япония) так, чтобы оценить способность каждого тестового образца доставлять siРНК в клетки.

Таблица 1 Тестовый образец Формула № Данные на Фиг.1 1 Композиция носителя + siРНК Композиция для доставки нуклеиновой кислоты из примера 2 2 LFA2000 + siРНК Среда OPTI-MEM, содержащая LFA2000 (Липофектамин2000; производство Invitrogen Corporation) (1,0 мг/мл) и siРНК (20 пмоль/мл) 3 NeoPhectin + siРНК Среда OPTI-MEM, содержащая NeoPhectin (производство NoePharm) (1,0 мг/мл) и siРНК (20 пмоль/мл) 4 siРНК Среда OPTI-MEM, содержащая siРНК (20 пмоль/мл)

Результаты показаны на Фиг.1. Когда добавлена только siРНК, не наблюдается флуоресценция в клетках. В отличии от этого, когда добавляют композицию для доставки нуклеиновой кислоты из примера 2 или хорошо известный носитель для доставки клетки (например, LFA 2000 или NeoPhectin) вместе с siРНК, в клетках наблюдалась флуоресценция. В особенности, когда была использована композиция для доставки нуклеиновой кислоты из примера 2, в клетках наблюдалась сильная флуоресценция. Эти результаты подтвердили, что композиция для доставки нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению проявляет отличную способность доставлять нуклеиновую кислоту.

Тестовый пример 2

Чтобы оценить подавление гена-мишени на белковом уровне, в клетки была временно введена плазмида, кодирующая ген люциферазы, и затем к клеткам была добавлена композиция для доставки нуклеиновой кислоты из примера 2 так, чтобы оценить количество экспрессии люциферазы. В тесте использовали GL3-siРНК (siРНК, связывающая светящуюся люциферазу; Dharmacon Corporation, Боулдер-Сити, CO, США; Последовательность: 5'-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT; Антисенс: 5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT).

Конкретнее, 10 мг pGL3 люциферазы или Renilla люциферазы (Promega, Медисо, Висконсин, США) было добавлено к 15 × 10⁶ клеток А549 (клеточный штамм, выделенный из рака легкого человека; Dainippon Pharmaceutical Co.Ltd.), и клетки были электропорированы с использованием нуклеофектора (Amaxa Inc., Гайтерсбург, Мериленд, США). Клетки, в которые была введена pGL3 люцифераза или Renilla люцифераза, были доведены до 1,2 × 10⁵ клеток/мл средой DMEM (Dulbecco-Minimum Essentian Medium), которая является бессывороточной или содержит 10% фетальной бычьей сыворотки по объему, и впоследствии были посажены в 24-луночные планшеты в количестве 6,0 × 10⁴ клеток на лунку. Затем в каждую лунку добавили 500 мкл по одному каждого из тестовых образцов, показанных в таблице 2, и инкубировали при 37˚С в 5% СО₂ в течение 24 часов. Клетки в лунках были лизированы путем конвенционного процесса, чтобы приготовить клеточные лизаты, и клеточные лизаты были оценены на люциферазную активность с использованием двух-люциферазной генераторной аналитической системы (Promega, Медисо, Висконсин, США). Активности люциферазы были оценены при помощи подсчета отношения светящейся люциферазы к активностям Renilla люциферазы (относительная активность: %)

Таблица 2 Тестовый образец Формула № Данные на Фиг.2 1 Композиция носителя + siРНК Композиция для доставки нуклеиновой кислоты из примера 2 2 LFA2000 + siРНК Среда OPTI-MEM, содержащая LFA2000 (Липофектамин2000; производство Invitrogen Corporation) (1,0 мг/мл) и siРНК (20 пмоль/мл) 3 NeoPhectin + siРНК Среда OPTI-MEM, содержащая NeoPhectin (производство NoePharm) (1,0 мг/мл) и siРНК (20 пмоль/мл) 4 siРНК Среда OPTI-MEM, содержащая siРНК (20 пмоль/мл) 5 LFA2000 Среда OPTI-MEM, содержащая LFA2000 (Липофектамин2000; производство Invitrogen Corporation) (1,0 мг/мл) 6 NeoPhectin Среда OPTI-MEM, содержащая NeoPhectin (производство NoePharm) (1,0 мг/мл) 7 Композиция носителя Среда OPTI-MEM, содержащая композицию носителя из примера 1 (50% по объему) 8 Контроль Среда OPTI-MEM

Результаты приведены в таблице 2. Результаты подтвердили, что использование композиции для доставки нуклеиновой кислоты из примера 2 способствовало высокоэффективной доставке siРНК в клетки и экспрессии функции siРНК в клетках, независимо от присутствия или отсутствия сыворотки в среде.

Тестовый пример 3

В этом тесте композиция носителя из примера 3 оценивалась на способность доставлять siРНК в клетки ткани легкого и на функциональность siРНК в клетках с использованием крысиного неприлизина (siРНК, связывающая крысиный неприлизин (NM_012608); RNA-TEC NV Corporation, Бельгия; Последовательность: 5'-GCUCCAAAGCCGAAGAAGAdTdT, Антисенс: 5'-UCUUCUUCGGCUUUGGAGCdTdT).

Композиция для доставки нуклеиновой кислоты была приготовлена при помощи смешивания композиции носителя из примера 3 с siРНК в отношении 1:1 по весу. Затем 0,4 мл тестового раствора, который был приготовлен при помощи разбавления композиции для доставки нуклеиновой кислоты соответствующим переносчиком (8,89 вес./объем % раствора сахарозы), было введено через легкие самцам SD крыс, весившим 250-320 г, в то время, как они были анестезированы ингаляционным анастезионным агентом изофлюраном (производство Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), с использованием IА-1B Ингаляционного устройства (PENNCENTURY, Филадельфия, Пенсильвания, США). Тестовый раствор был приготовлен при помощи разбавления композиции для доставки нуклеиновой кислоты так, как предназначено, чтобы доза siРНК составила от 0,04 до 1,2 мг/кг (на крысу). Через 24 часа после пульмонального введения каждую крысу анастезировали эфиром и фиксировали в лежачем положении. Была проведена срединная лапаротомия, и крыс умертвили при помощи кровопускания через брюшную нижнюю полую вену. Легкие были впоследствии удалены из крысы и промыты физиологическим раствором, охлажденным льдом. Используя удаленные легкие, было измерено количество экспрессии siРНК модельного гена-мишени, NEP (нейтральная эндопептидаза) и количество экспрессии siРНК гена домашнего хозяйства, GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа). Кроме того, была измерена активность крысиного неприлизина (NEP) в удаленных легких. Методы измерения и результаты подробно описаны ниже. В качестве контроля был аналогичным образом проведен тест при помощи введения крысам только носителя (8,89 вес./объем % раствора сахарозы) при тех же условиях. Для сравнения тест также провели с использованием siРНК (Takara, Япония; Последовательность: 5'-GAACGGCAUCAAGGUGAACTT, Антисенс: 5'-GUUCACCUUGAUGCCGUUCTT), связывающей EGFP (улучшенный зеленый флуоресцентный белок) вместо крысиного неприлизина.

Способ и результаты определения количества NEP siРНК и GAPDH мРНК

Общая РНК была изолирована из доли удаленного легкого и была очищена, используя RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Германия). Было проведено превращение мРНК в кДНК, используя SuperScript III First-Strand систему синтеза для RT-PCR (Invitrogen, Калифорния, США). Количество мРНК для модельного гена-мишени NEP (нейтральная эндопептидаза) было количественно измерено при помощи PCR в реальном времени, используя готовую кДНК. Аналогичным образом было количественно измерено количество мРНК для гена домашнего хозяйства GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа). Подавление экспрессии мРНК неприлизина оценивали при помощи подсчета отношения мРНК NEP к мРНК GAPDH.

Результат подтвердил, что экспрессия мРНК неприлизина в легких существенно подавлялась при помощи siРНК неприлизина в дозе 0,08 мг/кг. Поскольку эта доза ниже, чем те, о которых сообщалось ранее, в качестве обеспечивающих эффекты РНК интерференции in vivo, было показано, что эффективная доставка siРНК в клетки ткани легкого может достигаться при помощи использования композиции носителя из примера 3.

Способ и результаты измерения активности крысиного неприлизина (NEP)

Часть удаленных легких была гомогенизирована, и была измерена активность крысиного неприлизина в гомогенате. Активность крысиного неприлизина (NEP) определили при помощи измерения того, сколько субстрата NEP, DAGNPG (N-дансил-D-Ala-Gly-р-нитро-Phe-Gly: SIGMA) было гидролизовано за данный период в присутствии или отсутствие специфического ингибитора NEP, фосфорамидона (SIGMA), и оценки различий в количествах гидролизата в присутствии и отсутствие ингибитора. Гомогенат легкого крысы использовался в количестве 50 мкл; субстрат DAGNPG в концентрации 1 мМ; и ингибитор, фосфорамидон, где он присутствовал, был добавлен до концентрации 10 мМ так, чтобы реакции проводились в общем объеме 100 мкл. Реакции проводились при 37˚С в течение 10 минут и были остановлены при помощи инкубации при 90˚С в течение 10 минут. Активность NEP была определена при помощи измерения количеств итогового гидролизата DAG (дансил-D-Ala-Gly). Количество полученного гидролизата было определено при помощи измерения флуоресценции гидролизата: возбуждение производилось при 360 нм и испускание флуоресценции измерялось при 535 нм.

Результаты в случае дозы siРНК 0,4 мг/кг показаны на Фиг.3. Результаты показывают, что активность NEP в легких была существенно подавлена при помощи NF-siРНК в дозе 0,4 мг/кг. Соответственно, вышеупомянутые результаты подтвердили, что эффективная доставка siРНК в клетки ткани легкого может быть достигнута при помощи использования композиции носителя из примера 3.

Тестовый пример 4

Композиция носителя из примера 1 была оценена на цитотоксичность, используя систему анализа пролиферации Premix WST-1 (Takara, Сига, Япония). Конкретнее, клетки А549 (клеточный штамм, выделенный из рака легкого человека; Dainippon Pharmaceutical Co.Ltd.), концентрация которых была доведена до 1×10⁵ клеток/мл средой DMEM (Dulbecco-Minimum Essentian Medium), были посажены в 96-луночные планшеты в количестве 10⁴ клеток на лунку. По одному каждого из тестовых образцов, например, композиции носителя из примера 1, LFA2000 (Липофектамин2000; производство Invitrogen), и NeoPhectin (производство NoePharm Corporation) затем было добавлено в каждую лунку в концентрации от 2 до 20 мкг/мл. Затем было добавлено 10 мкл раствора Premix WST-1 в каждую лунку, и клетки инкубировались при 37˚С в течение 1 часа. Затем был изменен коэффициент поглощения каждой лунки при 450 нм, используя спектрофотометр для прочтения микропланшетов (Tecan, Майендорф, Швейцария). В качестве контроля в лунки была добавлена среда вместо тестовых образцов, и измерение было проведено аналогичным образом. Коэффициент поглощения при 450 нм отображает коэффициент поглощения формазанового красителя, который образуется из WST-1 при помощи редуктазы. Поскольку существует линейная зависимость между этим коэффициентом поглощения и живыми клетками, была подготовлена калибровочная кривая между количеством посаженных клеток и коэффициентом поглощения. Количество клеток в каждом тестовом образце было определено, основываясь на калибровочную кривую.

Результаты показаны на Фиг.4. Результаты подтвердили, что количество клеток практически не уменьшилось с добавлением композиции носителя из примера 1, и, следовательно, композиция носителя обладает слабой токсичностью и является высокобезопасной.

Тестовый пример 5

Самцам SD крыс (SLC, Токио, Япония), весившим 250-320 г, ввели через легкие тестовый раствор, приготовленный при помощи разбавления 500 мкг композиции носителя из примера 4 с дистиллированной водой до 0,4 мл, используя 1A-IC устройство, производства Penncentury Corporation. Каждую крысу после введения вернули в клетку и содержали в нормальных условиях. Через двадцать четыре часа после пульмонального введения 50 мг/кг (1 мл/кг) крысе был внутрибрюшинно введен пентобарбитан (Нембутал, производство Dainippon Pharmaceutical Co. Ltd.), и крыса под действием анестезии была впоследствии зафиксирована в лежачем положении. Была проведена срединная лапаротомия, и крыс умертвили при помощи кровопускания через брюшную нижнюю полую вену. Легкие были впоследствии удалены из крысы и промыты физиологическим раствором, охлажденным льдом. Были приготовлены срезы из ткани удаленного легкого, и срезы исследовали микроскопически при помощи окрашивания гематоксилином и эозином так, чтобы оценить токсичность композиции носителя для ткани легкого. Для сравнения были проведены тесты при тех же условиях, как описано выше, используя LFA2000 (Липофектамин2000; производство Invitrogen) или NeoPhectin (производство NoePharm Corporation) вместо композиции носителя из примера 4. Поскольку крысы были убиты при помощи введения 500 мкг LFA2000, тест проводили с дозой LFA2000, замененной на 250 мкг.

Результаты показаны на Фиг.5. У крыс, которым местно вводили LFA2000 и NeoPhectin в легкие, случилось воспаление, и наблюдались местные отеки. В отличие от этого, подтвердилось, что такие воспалительные симптомы были снижены у крыс, которым была введена композиция носителя из примера 4. Результаты подтвердили, что композиция носителя из примера 4 обладает низкой токсичностью даже после местного пульмонального введения и является высокобезопасной.

Композиция носителя для доставки нуклеиновой кислоты содержит (А) катионный липид со стероидным скелетом и (В) катионный липид типа соли четвертичного аммония. Компонент (А) представляет собой 3β-[N-(N',N'-диметиламиноэтан)карбамоил]холестерин и/или иодид 3β-[N',N',N'-триметиламиноэтан]холестерина, компонент (В) является, по меньшей мере, одним членом, выбранным из группы, состоящей из соли бромида диметилдиоктадециламмония, диолеоилтриметиламмонийпропана и гидрохлорида N-(1-(2,3-бис(олеоилокси) пропил))-N,N,N-триметиламмония. Компонент (В) содержится в композиции в пропорции от 10 до 200 вес.ч. на 100 вес.ч. компонента (А). Композиция носителя предназначена для доставки нуклеиновой кислоты в клетку. Композиция носителя характеризуется низкой токсичностью, эффективно доставляет нуклеиновые кислоты в клетки, защищая кислоту от деградации. 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл.

1. Композиция носителя для доставки нуклеиновой кислоты, содержащая (А) катионный липид со стероидным скелетом и (В) катионный липид типа соли четвертичного аммония.

2. Композиция носителя по п.1, дополнительно содержащая (С) вещество на масляной основе.

3. Композиция носителя по п.1, где компонент (А) представляет собой 3β-[N-(N',N'-диметиламиноэтан)карбамоил]холестерин и/или иодид 3β-[N',N',N'-триметиламиноэтан]холестерина.

4. Композиция носителя по п.1, где компонент (В) является по крайней мере одним членом, выбранным из группы, состоящей из соли бромида диметилдиоктадециламмония, диолеоилтриметиламмонийпропана и гидрохлорида N-[1-(2,3-бис(олеоилокси)пропил)]-N,N,N-триметиламмония.

5. Композиция носителя по п.1, где компонент (В) содержится в пропорции от 10 до 200 вес.ч. на 100 вес.ч. компонента (А).

6. Композиция носителя по п.1, где композиция носителя является композицией носителя для доставки siPHK.

7. Композиция для доставки нуклеиновой кислоты, содержащая композицию носителя по любому из пп.1-5 и нуклеиновую кислоту.

8. Композиция для доставки нуклеиновой кислоты по п.7, где нуклеиновой кислотой является siPHK.

9. Способ введения нуклеиновой кислоты, включающий приведение композиции для доставки нуклеиновой кислоты по п.7 в контакт с клеткой для введения нуклеиновой кислоты в клетку.

10. Применение (А) катионного липида со стероидным скелетом в сочетании с (В) катионным липидом типа соли четвертичного аммония для получения композиции носителя для доставки нуклеиновой кислоты.