СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОКОНЪЮГАТОВ НА ОСНОВЕ ПОЛИКАТИОНОВ, ПРИГОДНЫХ ДЛЯ ТРАНСПОРТИРОВКИ В ОРГАНИЗМ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ Российский патент 2005 года по МПК A61K47/48 

Предметом данного изобретения является получение биоконъюгатов на основе поликатионов, которые пригодны для транспортировки различных типов активных веществ в организм, то есть для функционирования в качестве носителей.

Новые биоконъюгаты поликатионов согласно изобретению готовят посредством связывания молекул [(k)Mx] и/или [(i)Mx], несущих подходящие для конъюгации функциональные группы, которые могут быть либо идентичными молекулами, либо (две или более/ т.е. х) молекулами разных видов, посредством химических связей с данным представителем изополипептидных поликатионов, имеющих свободные α -аминогруппы, в качестве молекул носителей; и биоконъюгаты, синтезированные таким образом, можно описать общей формулой (I):

и в поликатионных биоконъюгатах присутствуют изополипептидные поликатионные молекулы носителей (далее: молекулы носителей), имеющие свободные α -аминогруппы, которые можно описать общей формулой (I/a):

(свободная α -аминогруппа)

и в каждой молекуле носителя общей формулы (I/a) имеются мономеры одинаковой конфигурации (т.е. либо D-, либо L-), и отдельные мономеры не связаны друг с другом своими аминогруппами в α -положениях, а связаны посредством своих аминогрупп в других положениях (т.е. в β -, γ -, δ -, ε -, и т.д.), согласно значению m, и поэтому их структуры отличаются от структур полипептидов, построенных посредством обычных α -аминопептидных связей, обычно встречающихся в организмах млекопитающих;

где r является средним значением между 20 и 400;

m=0, 1, 2, 3,... k;

[(k)Mx] (означает молекулы усилителя и/или связывающие молекулы, конъюгированные ковалентными (=k) связями с изополипептидной поликатионной молекулой носителя, и

[(i)Mx] означает молекулы усилителя, конъюгированные ионными (=i) связями с изополипептидной поликатионной молекулой носителя, принимая во внимание, что указанные молекулы усилителей и связывающие молекулы, имеющие соответствующие функциональные группы для конъюгации, могут быть либо идентичными молекулами, либо (две или более, т.е. х) молекулами разных видов и молекулы усилителей могут быть конъюгированы

- непосредственно и/или

- опосредованно через связывающую молекулу,

и, кроме того, наличие соединения [(k)Mx] и [(i)Mx] в одном и том же поликатионном биоконъюгате обозначают [(k/i)Mx]. На основе общей формулы (I) новых поликатионных биоконъюгатов согласно изобретению далее можно получить молекулы общей формулы (II), (III), (IV), (VI), (VII), (IX), (X), (XI) и схематичных формул (V), (VIII), (IX/a), (Х/а), (XI/a).

Если молекулы усилителей [Ex_i], которые могут быть либо идентичными, либо (две или более, т.е. х) разных видов, непосредственно конъюгированы с данным представителем молекул носителей общей формулы (I/a) ковалентными связями, тогда:

[(k)Mx]=[(Ex_i]_p1,

и новые поликатионные биоконъюгаты описываются общей формулой

Если связывающие молекулы [(-)Сх_j] исключительно анионного характера, которые могут быть либо идентичными молекулами, либо (две или более, т.е. х) молекулами разных видов, конъюгированы с данным представителем молекул носителей общей формулы (I/a) ковалентными связями, появляется дополнительная возможность для установления ионных связей с катионами, которые могут быть либо одинаковыми, либо (две или более, т.е. х) разных видов, и тогда:

[(k)Mx]=[(-)Сх_j]_р2

и новые конъюгаты описываются общей формулой (III):

Если молекулы усилителей [Ех_ek], которые могут быть либо одинаковыми молекулами, либо (две или более, т.е. х) молекулами разных видов, опосредованно конъюгированы ковалентными связями с данным представителем молекул носителей общей формулы (I/a) через связывающие молекулы [Сх_ck], которые могут быть либо идентичными, либо (две или более, т.е. х) разных видов, тогда:

[(k)Mx]=[Cx_ck-Ex_ek]_p3,

и новые поликатионные биоконъюгаты описываются общей формулой (IV):

В том случае когда молекулы усилителей [Ex_i] и/или [Cx_ck-EX_ek] и/или связывающие молекулы [(-)Сх_j] анионного характера также конъюгированы с данным представителем молекул носителей общей формулы (I/a) и, кроме того, среди р₁, р₂ и p₃ по меньшей мере два значения больше 0, тогда:

[(k)Mx]=[Ex_i]_p1+[Cx_ck-Ех_ek]_р3+[(-)Сх_j]_р2,

и новые поликатионные биоконъюгаты описываются схематичной формулой (V):

где Ex в [Ex_i]_p1 означает молекулы усилителей Ex разных (″ х″ ) видов, непосредственно конъюгированные ковалентными связями с данным представителем молекул носителей общей формулы (I/a) и

i показывает, являются ли молекулы усилителей Ех, конъюгированные с данной молекулой носителя ковалентными связями, идентичными молекулами (i=l), или они относятся к разным видам в количестве i (i=2, 3,... х вид);

(-)Сх в [(-)CX_j]_p2 означает связывающие молекулы (-)Сх исключительно анионного характера разных (х) видов, конъюгированные ковалентными связями с данным представителем молекул носителей общей формулы (I/a), чтобы придать ему способность к образованию ионных связей с катионами,

j показывает, являются ли связывающие молекулы (-)Сх, конъюгированные с данной молекулой носителя ковалентными связями, идентичными молекулами (j=1), или они относятся к разным видам в количестве j (j=2, 3,... х вид);

Сх-Ех в [Сх_сk-Еx_еk]_р3 означает молекулы усилителей Ех разных (″ х″ ) видов, конъюгированные ковалентными связями опосредованно через связывающие молекулы Сх разных видов (х), и указанные молекулы Сх также конъюгированы ковалентными связями с данным представителем молекул носителей общей формулы (I/a),

ck показывает, являются ли связывающие молекулы Eх, конъюгированные с данной молекулой носителя ковалентными связями, идентичными молекулами (ck=1), или они относятся к разным видам в количестве ck (ck=2, 3,... х); и указанные связывающие молекулы Сх, в сущности зависящие от структуры молекул усилителей Ех, могут быть нейтральными и/или анионного и/или катионного характера,

ek показывает, являются ли молекулы усилителей Ех, конъюгированные ковалентными связями с данной молекулой носителя опосредованно через связывающие молекулы Сх, идентичными (ek=1) или они относятся к разным видам в количестве ek (ek=2, 3,... х).

Кроме того, степень насыщения в % данного представителя молекул носителей общей формулы (I/a) молекулами усилителей [Ех_i]_р1 и/или [CX_ck-Ex_ek]_p3 и/или связывающими молекулами [(-)Сх_j]_р2 задана разными значениями p₁, р₂ и р₃ принимая во внимание, что суммарное значение p₁+р₂+p₃ в одном данном поликатионном конъюгате >0 и ≤ 100; посредством чего определяется соотношение между свободными (не вовлеченными в пептидные связи) и связанными NH₂-группами, что в свою очередь влияет на заряд и катионный характер поликатионных биоконъюгатов; и, таким образом

p₁ означает степень насыщения в молекулы носителя общей формулы (I/a) молекулами усилителей [Ex_j]

р₂ означает степень насыщения в % молекулы носителя общей формулы (I/a) связывающими молекулами [(-)Сх_j] исключительно анионного характера,

р₃ означает степень насыщения в % молекулы носителя общей формулы (I/a) молекулами усилителей [Cx_ck-Ex_ek], которые связаны со связывающими молекулами

и на основе указанного выше в схематичной формуле (V) р+p₂+p₃ >0 и ≤ 100, и среди p₁, p₂ и р₃ по меньшей мере два значения больше 0; кроме того, в данном поликатионном биоконъюгате молекулы Ех в [Ех_j] и молекулы (-)Сх в [(-)Сх_j] необязательно идентичны молекулам Ех и Сх, присутствующим в [Cx_ck-EX_ek], и эта дивергенция обозначена х и будет обсуждаться позже в примерах соответствующим образом выбранных молекул усилителей, кроме того r и m имеют такие же значения, как в общей формуле (I).

Если молекулы усилителей [(-)АХ_s] анионного характера, которые могут быть либо одинаковыми молекулами, либо (две или более, т.е. х) молекулами разных видов, непосредственно конъюгированы ионными связями со свободными α -аминогруппами данного представителя молекул носителей общей формулы (I/a), тогда:

[(i)Mx]=[(-)Ax_s]_t,

и новые поликатионные биоконъюгаты описываются общей формулой (VI):

Если молекулы усилителей [(+)Kx_u] катионного характера, которые могут быть либо одинаковыми молекулами, либо (две или более, т.е. ″ х″ ) молекулами разных видов, конъюгированы опосредованно через связывающие молекулы [(-)Сх_j] исключительно анионного характера, которые могут быть идентичными молекулами или (две или более, т.е. х) молекулами разных видов, ионными связями с данным представителем конъюгатов общей формулы (III), тогда:

[(k)Mx]*[(i)Mx]=[(k/i)Mx]=[(-)Сх_j]_р2·_[(+)Kxu]z,

и новые поликатионные биоконъюгаты описываются общей формулой (VII):

Если дополнительные молекулы усилителей [(-)АХ_s] анионного характера, которые могут быть либо одинаковыми молекулами, либо (две или более, т.е. х) молекулами разных видов, непосредственно конъюгированы ионными связями со свободными α -аминогруппами данного представителя поликатионных биоконъюгатов общей формулы (VII), тогда:

[(k/i)Mx]={[(-)Сх_j]_р2·_{[(+)Kxu]z}· [(-)Axs]t,}

и новые поликатионные биоконъюгаты описываются схематичной формулой (VIII):

Если дополнительные молекулы усилителей [(-)Аx_s] анионного характера, которые могут быть либо идентичными молекулами, либо (две или более, т.е. х) молекулами разных видов, конъюгированы ионными связями со свободными α -аминогруппами данного представителя поликатионных биоконъюгатов общей формулы (II) или (IV) или схематичной формулы (V), тогда:

[(k/i)Mx]=[Ex_i]_p1·_{[(-)Axs]t, или [Схck-Ехek]р3·[(-)Axs]t, или [Exi]p1+[Схck-Ехek]р3·[(-)Ахs]t,}

и новые поликатионные биоконъюгаты описываются общей формулой (IX) или схематичной формулой (IХ/а):

В случае данного представителя поликатионных биоконъюгатов схематичной формулы (V), в котором имеются связывающие молекулы [(-)Cx_j] анионного характера, которые также могут быть либо идентичными молекулами, либо (две или более, т.е. х) молекулами разных видов, этот представитель, таким образом, частично приобретает анионный характер, так что дополнительные молекулы усилителей [(+)Kx_u] катионного характера, которые могут быть либо идентичными молекулами либо (две или более, т.е. х) молекулами разных видов, могут быть конъюгированы с ним ионными связями, тогда:

[(k/i)Mx]=[Ex_i]_p1+{[(-)Cx_j]_p2·_{[(+)Kxu]z} или}

[Cx_ck-Ex_ek]_p3+{[(-)Сх_j]_р2·_{[(+)Kxu]z} или}

[Ex_i]_p1+[Сх_ck-Еx_еk]_р3+{[(-)Cx_j]_p2·_[(+)Kxu]z},

и новые поликатионные биоконъюгаты описываются общей формулой (X) или схематичной формулой (Х/а):

Если дополнительные молекулы усилителей [(-)Ах_s] анионного характера, которые могут быть либо идентичными молекулами либо (две или более, т.е. х) молекулами разных видов, непосредственно конъюгированы ионными связями со свободными α -аминогруппами данного представителя поликатионных биоконъюгатов общей формулы (X), тогда:

[(k/i)Mx]=[Ex₁]_p1+{[(-)Сх_j]_р2·_{[(+)Kxu]· [(-)Axs]t или}

[Cx_ck-Ex_ek]_p3+[(-)Сх_j]_р2·_{[(+)Kxu]z}· [(-Axs]t или}

[Ex_i]_p1+[Cx_ck-Ex_ek]_p3+{[(-)CX_j]_p2·_{[(+)Kxu]Z}· [(-)Axs]t,}

и новые поликатионные биоконъюгаты описываются общей формулой (XI) или схематичной формулой (ХI/а):

где:

(-)Ax в [(-)АX_s]_t, означает молекулы усилителей (-)Ах анионного характера разных (х) видов, непосредственно конъюгированные ионными связями с данным представителем молекул носителей общей формулы (I/а),

s показывает, являются ли анионные/полианионные молекулы (-)Ах, конъюгированные с данной поликатионной молекулой носителя ионными связями, идентичными молекулами (s=1), или они относятся к разным видам в количестве s (s=2, 3,... х вид);

(+)Кх в [(+)Кх_u]_z означает молекулы усилителей (+)Кх разных (х) видов катионного характера, которые опосредованно конъюгированы ионными связями через связывающие молекулы [(-)Сх_j] разных (х) видов анионного характера с данным представителем молекул носителей общей формулы (I/а), то есть, по существу, с конъюгатом общей формулы (III), и

u показывает, являются ли катионы и/или поликатионы (+)Кх, конъюгированные с данным соединением общей формулы (III) ионными связями, идентичными молекулами (u=1), или они относятся к разным видам а количестве u (u=2, 3,... х вид); и кроме того,

t показывает степень насыщения в % молекулы носителя общей формулы (I/а) молекулами усилителей [(-)Ах_s], и

z показывает степень насыщения в % поликатионного биоконъюгата общей формулы (I) или молекулы носителя общей формулы (I/a) молекулами усилителей [(+)Кx_u, которые конъюгированы опосредованно через связывающие молекулы [(-)Cx_j] анионного характера,

t в общей формуле (VI),

z в общей формуле (VII),

t+z в схематичной формуле (VIII),

t+p₁ или t+р₃ или t+p₁+р₃ в общей формуле (IX) и в схематичной формуле (IХ/а),

z+p₁ или z+р₃ или z+p₁+р₃ в общей формуле (X) и в схематичной формуле (Х/а),

t+z+p₁ или t+z+р₃ или t+z+p₁+р₃ в общей формуле (XI) и в схематичной формуле (XI/а), и значение каждой из этих сумм находится в пределах>0, но>100; кроме того, в соответствии с этим NН₂-группы, которые не насыщены t, и/или z, и/или p₁, и/или р₃, будут оставаться свободными, посредством чего определяется соотношение между свободными (не вовлеченными в химические связи) и связанными NН₂-группами, которое в свою очередь влияет на заряд и катионный характер поликатионных биоконъюгатов, поскольку z показывает степень насыщения молекул носителей катионными молекулами усилителей [(+)Кх_u], которые конъюгированы опосредованно через связывающие молекулы [(-)Cx_j], поэтому z=р₂, кроме того,

r и m и [(k)Mx_j] имеют такой же смысл, как и в общей формуле (I),

[Ex_i]_p1 имеет такое же значение, как в общей формуле (II),

[(-)Cx_j]_р2 имеет такое же значение, как в общей формуле (III),

[Cx_ck-Ex_ek]_р3 имеет такое же значение, как в общей формуле (IV).

Новизна поликатионных биоконъюгатов общей формулы (I), предмета данного изобретения, состоит в том, что в них в качестве поликатионных молекул носителей присутствуют изополипептиды, имеющие свободные α -аминогруппы, синтез которых осуществляют связыванием мономеров диаминомоно-карбоновых кислот, из которых построены данные изополипептиды, не за счет их аминогрупп в α -положении, а посредством их аминогрупп в других (β -, γ -, δ -, ε -, и т.д.) положениях, и способ, применяемый для получения указанных молекул носителей, раскрыт в описании патента Венгрии HU 202553 В, с датой приоритета 21.10.1987, названного "Process for the preparation of isopolypeptides from diamino-monocarbonic acids and of drugs containing them, and a plant protection agent containing polyisolysine", затем в работе Szokan et al.: "Structure Determination and Synthesis of Lysine Isopeptides Influencing on Cell Proliferation" (Biopolymers, J. Wiley & Sons, Inc. 42: 305-318, 1997).

С данным представителем молекул носителей общей формулы (I/a) в новых поликатионных биоконъюгатах общей формулы (I), полученных согласно изобретению, в качестве соответствующим образом выбранной молекулы усилителя может быть связана практически любая органическая и/или неорганическая молекула, имеющая подходящие для конъюгации функциональные группы, согласно способу, показанному общими формулами (II), (III), (IV), (VI), (VII), (IX), (X), (XI) и схематичными формулами (V), (VIII), (IX/a), (X/a), (XI/a). Все указанные молекулы усилителей можно предпочтительно выбрать, не ограничивающим образом, из группы соединений, перечисленных ниже:

- гормоны и антагонисты гормонов разных видов (стероид, белок, пептид и т.д.) и активные фрагменты пептидных гормонов, и их производные;

- насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты, холестерины, фосфолипиды (фосфоглицериды, сфингомиелины и т.д.) и их производные;

- нуклеиновые кислоты/антисмысловые олигонуклеотиды;

- моносахариды, олигосахариды и полисахариды и их производные;

- витамины и их производные;

- известные противоопухолевые лекарственные средства и активные вещества и их производные;

- аминокислоты, олигопептиды, полипептиды, кроме того, гликопротеиды и липопротеиды, их фрагменты и их производные.

Новые поликатионные биоконъюгаты общей формулы (I), полученные согласно способу, описанному в изобретении, содержат молекулы носителей общей формулы (I/a), и данный представитель указанных молекул носителей конъюгирован химическими (ковалентными и/или ионными) связями с молекулами усилителей, которые соответствующим образом выбраны, согласно намеченному действию (например, антипролиферативному, антимикробному действию, для доставки генов, улучшения качества диагностической магнитно-резонансной томографии и т.д.), и указанные молекулы усилителей могут быть либо идентичными, либо (две или более, т.е. х) разных видов, и благодаря применению многочисленных молекул усилителей в данном поликатионном биоконъюгате общей формулы (I) можно одновременно получить многообразные прямые и/или опосредованные воздействия. Несколько примеров соединений, которые предпочтительно можно использовать для этой цели, перечислены ниже.

Соединения, содержащие часть молекул усилителей прямого действия, неограничивающего характера:

- соединения, обладающие антипролиферативным действием, например: цитостатики, используемые в клинической практике, далее, цитокины, которые влияют на деление и дифференцировку клеток (например, различные факторы роста, а также антитела, продуцируемые против рецепторов этих факторов, интерфероны и т.д.), затем пептиды/белки, которые ингибируют образование новых кровеносных сосудов вокруг опухолевых клеток (ангиостатины, эндостатины), кроме того, нуклеиновые кислоты/антисмысловые олигонуклеотиды, оказывающие антипролиферативное действие на злокачественно трансформированные клетки;

- соединения, обладающие антимикробным действием, например: противовирусные, антибактериальные, противогрибковые, противопротозойные и т.д. соединения, используемые в клинической практике, кроме того, нуклеиновые кислоты/сложные антисмысловые олигонуклеотиды, которые ингибируют репликацию у микроорганизмов;

- нуклеиновые кислоты, выделенные или синтезированные для целей переноса генов, которые пригодны для лечения наследственных болезней (например, кистозного фиброза);

- соединения, улучшающие качество диагностической магнитно-резонансной томографии, например: парамагнитные ионы металлов и комплексы, содержащие ионы металлов такого вида, особенно молекулярные комплексы иона гадолиния (Gd) (например, димеглуминовая соль Gd-диэтилентриаминпентауксусной кислоты);

- соединения, обладающие иммуномодулирующим действием (например, интерлейкины, факторы некроза опухолей, и т.д.), которые регулируют данную функцию иммунной системы; и

- многочисленные соответствующим образом подобранные соединения другого действия, не охарактеризованные здесь, которые можно использовать с определенными целями в качестве молекул усилителей.

Соединения, содержащие часть молекул усилителей опосредованного действия, которые проявляют или увеличивают избирательность, не ограничивающего характера:

- по отношению к антипролиферативному действию, например: моноклональные антитела, обладающие специфичным сродством к поверхностному антигену данной опухолевой клетки, а также антитела или любые соединения, обладающие сродством к рецепторам такого вида (например, рецептору трансферрина или рецептору фолата среди витаминов, и т.д.), которые присутствуют в большей степени на поверхности опухолевых клеток, чем нормальных (злокачественно не трансформированных) клеток;

- кроме того, по отношению к антипролиферативному и любым другим предназначенным воздействиям любое соединение, которое обладает специфичным сродством к определенному рецептору, исключительно присутствующему только на поверхности данной нормальной клетки (указанный рецептор не появляется в результате патологического процесса), то есть, например, асиалогликопротеидные рецепторы клеточной поверхности клеток печени (с которыми специфично связывается концевая галактоза макромолекул), или любое другое соединение, связывающее рецепторы, которые присутствуют в большей степени на поверхности данной клетки-мишени;

- вообще соединения, которые могут связываться с данной клеткой-мишенью (например, микроорганизмами или клетками, инфицированными микроорганизмами и т.д.), чтобы добиться опосредованного усиливающего действия.

Соединения, содержащие часть молекул усилителей прямого и одновременно опосредованного действия, не ограничивающего характера:

- по отношению к антипролиферативному действию, например: гормоны, антагонисты гормонов и их производные, среди полипептидных гормонов особенно хорионический гонадотропный гормон человека, который обладает антипролиферативным действием, кроме того, антитела, продуцируемые против рецепторов факторов роста разных видов, которые присутствуют в большей степени на поверхности данной опухолевой клетки, чем на других клетках, и одновременно оказывают антипролиферативное действие по отношению к данным злокачественно трансформированным клеткам, кроме того, иммунотоксины, которые продуцируются против данной опухолевой клетки;

- по отношению к антимикробному действию, например: нейтрализующие антитела, которые продуцируются против данных микроорганизмов (например, вирусов, бактерий, грибов и т.д.), кроме того, иммунотоксины, которые продуцируются против данного микроорганизма.

Новые поликатионные биоконъюгаты общей формулы (I), полученные согласно изобретению, содержат молекулы носителей общей формулы (I/a), и данный представитель указанных молекул носителей конъюгирован с молекулами усилителей, которые могут быть либо идентичными, либо (две или более, т.е. х) разных видов, которые соответствующим образом выбраны согласно указанным выше примерам, и конъюгацию данных молекул усилителей обозначают символом [Ex_i]_p1 и/или [... -Ex_ek]_р3, который показывает, что молекулы связаны ковалентными связями, кроме того, [(-)Ax_s]_t, имеющие анионный характер, и/или [(+)Kx_u]_z, имеющие катионный характер, показывают, что молекулы связаны ионными связями.

Новые поликатионные биоконъюгаты общей формулы (I), полученные согласно изобретению, содержат молекулы носителей общей формулы (I/a), и данный представитель указанных молекул носителей конъюгирован с молекулами усилителей, которые могут быть либо идентичными, либо (две или более, т.е. х) разных видов, которые соответствующим образом выбраны согласно указанным выше примерам, и молекулы усилителей могут быть конъюгированы непосредственно и/или опосредованно через связывающие молекулы, и последние могут связывать молекулы усилителей ковалентно или ионными связями, при этом ковалентно связывающие молекулы обозначают символами [СХ_ck-... ]р₃, а связывающие ионными связями обозначают [(-)Сх_j]_р2 соответственно, и указанные связывающие молекулы могут быть соответствующим образом выбраны, не ограничивающим образом, из дикарбоновых кислот, трикарбоновых кислот, углеводородов, или аминокислот, или элонгаторов пептидной цепи.

Новые поликатионные биоконъюгаты общей формулы (I), полученные согласно изобретению, содержат молекулы носителей общей формулы (I/a), и данный представитель указанных молекул носителей конъюгирован с молекулами усилителей, которые могут быть либо идентичными, либо (две или более, т.е. х) разных видов, которые соответствующим образом выбраны согласно указанным выше примерам, и конъюгация молекул усилителей ковалентными и/или ионными химическими связями осуществляется непосредственно и/или опосредованно в определенном соотношении, предпочтительно, чтобы добиться насыщения от 10 до 100%.

Предпочтительные представители молекул носителей общей формулы (I/a) в новых поликатионных биоконъюгатах общей формулы (I) согласно изобретению включают 60-120-членные, нерацемические полиизо-L-лизины, т.е. гидробромиды поли-(ε )-L-лизина, которые сами по себе обладают некоторой антипролиферативной и антивирусной активностями, как раскрыто в описании патента HU 202553 В, дата приоритета в Венгрии 21 октября 1987.

Предметом изобретения является представление того, что каждый из новых поликатионных биоконъюгатов общей формулы (I), полученный согласно способу, описанному в данном изобретении, содержит молекулы носителей общей формулы (I/a), и эти молекулы носителей (которые сами по себе обладают определенным антипролиферативным действием) конъюгированы химическими связями с соединениями, обладающими антипролиферативным действием (некоторые соединения, соответствующим образом выбранные для этой цели, перечислены выше среди молекул усилителей прямого действия), и полученные таким образом биоконъюгаты успешно применяются для лечения злокачественных новообразований, развивающихся в организмах млекопитающих (далее: опухолей), отдельно или в сочетании с известными способами, ингибирующими опухоли, принятыми в клинической практике.

Дополнительные молекулы усилители, приводящие к развитию соответствующим образом подобранной избирательности, о которых подробно сообщается выше (среди молекул усилителей непрямого действия), связанные с биоконъюгатами, полученными согласно изобретению, увеличивают концентрацию активных веществ в опухолях, в связи с этим нежелательные побочные эффекты могут быть снижены, и таким образом, эффективность лечения может быть дополнительно увеличена.

Конъюгаты, подобные указанным новым поликатионным биоконъюгатам антипролиферативного действия согласно данному изобретению, уже были получены ранее. Также были опубликованы посвященные этому работы, на некоторые из которых авторы изобретения ссылаются ниже:

Bogdanov A.A. Jr., Martin С., Bogdanova A.V. et al.: An adduct of cis-diamininedichloroplatinum (II) and poly (ethylene glycol)poly(L-lysine)-succinate: synthesis and cytotoxic properties; Bioconjug. Chem., 1996 Jan-Feb; 7(1): 144-9.

Di-Stefano G., Busi C., Derenzini M. et al.: Conjugation of S-fluoro-2'-deoxyuridine with lactosaminated poly-L-lysine to reduce extrahepatic toxicity in the treatment of hepatocarcinomas; Ital. J.Gastroenterol-Hepatol., 1998 Apr; 30(2): 173-7.

Paprocka M., Boratynski J., Dus D. et al.: Conjugation of the monoclonal antibody 17-1A with the nitroacridine compound C921 with the poly-L-lysine as an intermediate agent; Arch. Immunol. Ther. Exp. Warsz., 1997; 45(4): 343-9.

Salazar A.M., Levy H.B., Ondra S. et al.: Long-term treatment of malignant gliomas with intramuscularly administered polyinosinic-polycytidylic acid stabilized with polylysine and carboxymethylcellulose: an open pilot study; Neurosurgery., 1996 Jun; 38(6): 1096-103; discussion 1103-4.

Другим обнаруженным фактом, включенным в данное изобретение, является особенность молекул носителей общей формулы (I/a) в новых поликатионных биоконъюгатах общей формулы (I), которые, являясь поликатионами, подходят для транспортировки, а также введения в клетки-мишени соответствующим образом выбранных нуклеиновых кислот полианионного характера в качестве молекул усилителей, связанных с ними ионными связями, т.е. для переноса генов, используя тот эффект, что при конъюгировании дополнительных молекул усилителей ковалентными связями, детали которого смотри выше, результатом которого является развитие соответствующим образом подобранной избирательности, новые поликатионные биоконъюгаты избирательно связываются с клетками-мишенями или в значительно более высокой степени связываются с ними, чем с клетками другого типа.

Конъюгаты, подобные указанным новым поликатионным биоконъюгатам согласно данному изобретению, способные к переносу генов, уже были получены ранее. Работы о них опубликованы в научной литературе, на некоторые из этих публикаций авторы ссылаются далее в качестве примеров:

Erbacher P., Roche А.С., Monsigny М., Midoux P.: The reduction of the positive charges of polylysine by partial gluconoylation increases the transfection efficiency of polylysine/DNA complexes; Biochim. Biophys. Acta., 1997 Feb 21; 1324(1): 27-36.

Ferkoi Т., Perales J.C., Mularo F., Hanson R.W.: Receptor-mediated gene transfer into macrophages; Proc.Natl. Acad.Sci.USA, 1996 Jan 9: 93(1): 101-5.

Kollen W., Erbacher P., Midoux P. et al.: Glycosylated polylysines. Nonviral vectors for gene transfer into cystic fibrosis airway epithelial cells; Chest., 1997 Jun; 111 (6 Suppl): 95S-96S.

Liang W.W., Shi X., Deshpande D. et al.: Oligonucleotide targeting to alveolar macrophages by mannose receptor-mediated endocytosis; Biochim.Biophys.Acta., 1996 Mar 13; 1279(2): 227-34.

Schneicter H., Huse К., Birkenmeier G. et al.: Gene transfer mediated by alpha2-macroglobulin; Nucleic Acids Res., 1996 Oct 1; 24 (19): 3873-4.

Schwarzenberger P., Spence S.E., Gooya J.M. et al.: Targeted gene transfer to human hematopoietic progenitor cell lines through the c-kit receptor; Blood., 1996 Jan 15; 87(2): 472-8.

Sosnowski В.A., Gonzalez A.M., Chandler L.A. et al.: Targeting DNA to cells with basic fibroblast growth factor (FGF2); J.Biol.Chem., 1996 Dec 27; 271(52): 33647-53.

Stewart A.J., Pichon C., Meunier L. et al.: Enhanced biological activity of antisense oligonucleotides complexed with glycosylated poly-L-lysine; Mol.Pharmacol., 1996 Dec; 50 (6): 1487-94.

Кроме того, новые поликатионные биоконъюгаты, которые подходят для переноса генов, в случае дополнительной конъюгации с соединениями, обладающими антипролиферативным действием (соответствующим образом выбранные соединения, подробно описанные среди молекул усилителей прямого действия), подходят для более эффективного лечения опухолей. Об этом также опубликованы научные публикации, на некоторые из которых авторы ссылаются ниже:

Cristiano R.J., Roth J.A.: Epidermal growth factor mediated DNA delivery into lung cancer cells via the epidermal growth factor receptor; Cancer Gene Ther., 1996 Jan-Feb; 3(1): 4-10.

Foster B.J., Kern J.A.: HER2-targeted gene transfer. Hum.Gene Ther., 1997 Apr 10; 8(6): 719-27.

Ginobbi P., Geiser Т.A, Ombres D., Citro G.: Folic acid-polylysine carrier improves efficacy of c-myc antisense oligodeoxynucleotides on human melanoma (M 14) cells; Anticancer Res., 1997 Jan-Feb; 17(1A): 29-35.

Nguyen D.M., Wiehle S.A, Roth J.A., Cristiano R.J.: Gene delivery into malignant cells in vivo by a conjugated adenovirus/DNA complex; Cancer Gene Ther., 1997 May-Jun; 4(3): 183-90.

Schachtschabel U., Pavlinkova G., Lou D., Kohler H.: Antibody-mediated gene delivery for B-cell lymphoma in vitro; Cancer Gene Ther., 1996 Nov-Dec; 3(6): 365-72.

Shimizu N., Chen J., Gamou S., Takayanagi A.: Immunogene approach toward cancer therapy using erythrocyte growth factor receptor-mediated gene delivery; Cancer Gene Ther., 1996 Mar-Apr; 3(2): 113-20.

Watanabe N., Sato Y., Yamauchi N., Niitsu Y.: Gene delivery into human cancer cells via transferrin receptor; Nippon Rinsho., 1998 Mar; 56(3): 724-30.

Другое представление также относится к предмету данного изобретения, а именно, что каждый из новых поликатионных биоконъюгатов общей формулы (I), полученных согласно способу, описанному в изобретении, содержит молекулы носителей общей формулы (I/a), и эти молекулы носителей (которые сами по себе обладают определенным антивирусным действием) конъюгированы химической связью с соответствующим образом выбранными соединениями, обладающими антивирусным действием, в качестве молекул усилителей и вследствие этого усиливают антивирусное действие новых поликатионных биоконъюгатов.

Новые поликатионные биоконъюгаты, которые получают способом, описанным в предыдущем параграфе, кроме того, конъюгированные химической связью с соответствующим образом подобранными соединениями, которые проявляют или усиливают избирательность по отношению к клеткам-мишеням, которые инфицированы вирусом (соответствующим образом подобранные соединения подробно описаны среди молекул усилителей непрямого действия), пригодны для увеличения относительной концентрации новых поликатионных биоконъюгатов антивирусного характера в клетках, которые инфицированы вирусом, и вследствие этого эффективность лечения будет увеличена, а побочные эффекты в значительной степени снижены. Конъюгаты, подобные указанным новым поликатионным биоконъюгатам антивирусного действия согласно данному изобретению, уже были получены ранее. Работы о них также опубликованы, на некоторые из этих публикаций авторы ссылаются ниже:

Di-Stefano G., Colonna F.P., Bongini A. et al.: Ribavirin conjugated with lactosaminated poly-L-lysine: selective delivery to the liver and increased antiviral activity in mice with viral hepatitis; Biochem.Pharmocol., 1997 Aug 1; 54(3): 357-63.

Fiume L., Di-Stefano G., Busi C. et al.: Liver targeting of antiviral nucleoside analogues through the asialoglycoprotein receptor; J.Viral.Hepat., 1997; 4(6): 363-70.

Fiume L; Di-Stefano G; Busi C. et al.: Hepatotropic conjugate of adenine arabinoside monophosphate with lactosaminated poly-L-lysine. Synthesis of the carrier and pharmacological properties of the conjugate; J.Hepatol., 1997 Feb: 26(2): 253-9.

Nakazono К., Ito Y., Wu C.H., Wu G.Y.: Inhibition of hepatitis В virus replication by targeted pretreatment of complexed antisense DNA in vitro; Hepatology., 1996 Jun; 23(6): 1297-303.

Другое представление также относится к предмету данного изобретения, а именно, что каждый из новых поликатионных биоконъюгатов общей формулы (I), полученных согласно способу, описанному в изобретении, содержит молекулы носителей общей формулы (I/a), и эти молекулы носителей конъюгированы химической связью с соединениями, обладающими различного вида антимикробными действиями (соответствующим образом подобранные соединения подробно описаны среди молекул усилителей прямого действия), и, вследствие этого, новые поликатионные биоконъюгаты в значительной степени увеличивают антимикробное действие, превышая антивирусные свойства, описанные в трех предыдущих параграфах.

Новые поликатионные биоконъюгаты, которые получают способом, описанным в предыдущем параграфе, кроме того, конъюгированные химической связью с соединениями, которые проявляют или усиливают избирательность по отношению к клеткам-мишеням, которые инфицированы микроорганизмами разных видов (соответствующим образом подобранные соединения подробно описаны среди молекул усилителей непрямого действия), пригодны для увеличения относительной концентрации поликатионных биоконъюгатов антимикробного характера в клетках, которые инфицированы указанными микроорганизмами, и вследствие этого эффективность лечения будет увеличена, а побочные эффекты в значительной степени снижены.

Другое представление также относится к предмету данного изобретения, а именно, что каждый из новых поликатионных биоконъюгатов общей формулы (I), полученных согласно способу, описанному в изобретении, содержит молекулы носителей общей формулы (I/a), и эти молекулы носителей конъюгированы химической связью с макромолекулярными парамагнитными контрастирующими средствами, например, молекулярными комплексами гадолиния и его производными (соответствующим образом подобранные соединения подробно описаны среди молекул усилителей прямого действия), и вследствие этого новые поликатионные биоконъюгаты в значительной степени улучшают качество диагностической магнитно-резонансной томографии посредством увеличения контраста между органами, тканями разных видов, а также различными патологическими изменениями, например, опухолями.

Новые поликатионные биоконъюгаты, которые получают способом, описанным в предыдущем параграфе, кроме того, конъюгированные химической связью с соединениями, которые проявляют или усиливают избирательность по отношению к разного вида органам-мишеням или различным патологическим изменениям (соответствующим образом подобранные соединения подробно описаны среди молекул усилителей опосредованного действия), пригодны для значительного увеличения относительной концентрации поликатионных биоконъюгатов контрастирующего парамагнитного характера в разного вида органах, тканях, а также в местах различных патологических изменений, и вследствие этого дополнительно повышают качество магнитно-резонансной томографии.

Конъюгаты, подобные указанным новым поликатионным биоконъюгатам парамагнитного характера согласно данному изобретению, уже были получены ранее. Работы о них также опубликованы, на некоторые из этих публикаций авторы ссылаются ниже:

Opsahl L.R., Uzgiris E.E., Vera D.R.: Tumor imaging with a macromolecular paramagnetic contrast agent: gadopentetate dimeglumine-polylysine; Acad.Radiol., 1995 Sep; 2(9): 762-7.

Su M.Y., Muhler A., Lao X./ Nalcioglu О.: Tumor characterization with dynamic contrast-enhanced MRI using MR contrast agents of various molecular weights; Magn.Reson.Med., 1998 Feb; 39(2): 259-69.

Vera D.R., Buonocore M.H., Wisner E.R. et al.: A molecular receptor-binding contrast agent for magnetic resonance imaging of the liver; Acad.Radiol., 1995 Jun; 2(6): 497-506.

Vogi T.J., Hoffmann Y., Juergens M. et al.: Experimentelle Evaluierung der kontrastmittelverstдrkten, hochauflosenden MR-Angiographie am Tiermodell. Gd-DTPA gegenuber Gd-DTPA-Polylysin; Radiologie, 1996 Mar; 36(3): 254-62.

Другое представление также относится к предмету данного изобретения, а именно, что каждый из новых поликатионных биоконъюгатов общей формулы (I), полученных согласно способу, описанному в изобретении, содержит молекулы носителей общей формулы (I/a), и эти молекулы носителей как поликатионы делают поликатионные биоконъюгаты пригодными для проникновения в организм млекопитающего посредством трансдермального транспорта при ионтофорезе.

Новые поликатионные биоконъюгаты, которые транспортируют через кожу, оказывают свое действие главным образом в различных слоях кожи и в подкожных тканях в области ионтофореза и некоторое количество их действует системно. Указанные виды действия зависят от размера молекул, физико-химических свойств и типа соответствующим образом выбранной молекулы усилителя поликатионных биоконъюгатов прямого и/или опосредованного действия, а также природы прикладываемого электрического поля.

Концентрация новых поликатионных биоконъюгатов, которые получают в соответствии с терапевтическими целями (например, антипролиферативное или антивирусное действия и т.д.) и которые содержат соответствующим образом подобранные и подробно описанные выше молекулы усилителей прямого и/или опосредованного действия, возрастает в месте трансдермального применения, и вследствие этого локальная эффективность лечения будет в значительной степени увеличиваться, а побочные эффекты будут уменьшаться. Если целью является достижение системного действия посредством трансдермального применения, преимущество будет проявляться в постоянном неинвазивном введении поликатионных биоконъюгатов, которые минуют желудочно-кишечную систему. Конъюгаты, подобные указанным новым поликатионным биоконъюгатам, подходящие для трансдермального применения согласно данному изобретению, уже были получены ранее. Работы о них также опубликованы, на некоторые из этих публикаций авторы ссылаются ниже:

Turner N.G., Ferry L., Price M. et al.: Iontophoresis of poly-L-lysines: the role of molecular weight?; Pharm.Res., 1997 Oct; 14(10): 1322-31.

Vanbever R., Prausnitz MR., Preat V.: Macromolecules as novel transdermal transport enhancers for skin eiectroporation; Pharm.Res., 1997 May; 14(5): 638-44.

Другое представление также относится к предмету данного изобретения, а именно, что каждый из новых поликатионных биоконъюгатов общей формулы (I), полученных согласно способу, описанному в изобретении, содержит молекулы носителей общей формулы (I/a), и эти молекулы носителей конъюгированы с подробно описанными выше молекулами усилителей прямого и/или опосредованного действия, которые соответствующим образом выбраны в соответствии с заданной терапевтической целью (например, антипролиферативное или антивирусное действие, или генотерапия и т.д.) и указанные новые поликатионные биоконъюгаты помещены в катионные липосомы, и вследствие этого эффективность лечения будет увеличена, а побочные эффекты в значительной степени снижены. Конъюгаты, подобные указанным новым поликатионным биоконъюгатам, которые подходят для того, чтобы поместить их в катионные липосомы, согласно данному изобретению уже были получены ранее. Работы о них также опубликованы, на некоторые из этих публикаций авторы ссылаются ниже:

Gao X., Huang L: Potentiation of cationic liposomemediated gene delivery by polycations; Biochemistry, 1996 Jan 23; 35(3): 1027-36.

Lee R.J., Huang L.: Foiate-targeted, anionic liposome-entrapped polylysine-condensed DNA for tumor cell-specific gene transfer; J.Biol.Chem., 1996 Apr 5; 271(14): 8481-7.

Mack K.D.f Walzem R.L., Lehmann-Bruinsma K. et al.: Polylysine enhances cationic liposome-mediated transfection of the hepatoblastoma cell line Hep G2; Biotechnol.Appi.Biochem., 1996 Jun; 23 (Pt3): 217-20.

Saldeen J., Curiel D.T., Eizirik D.L. et al.: Efficient gene transfer to dispersed human pancreatic islet cells in vitro using adenovirus-polylysine/DNA complexes or polycationic liposomes; Diabetes, 1996 Sep; 45(9): 1197-203.

Vitiello L., Chonn A., Wasserman J.D. et al.: Condensation of plasmid DNA with polylysine improves liposome-mediated gene transfer into established and primary muscle cells; Gene Ther., 1996 May; 3(5): 396-404.

Zeiphati 0., Szoka F.C. Jr.: Mechanism of oligonucleotide release from cationic liposomes; Proc.Natl. Acad.Sci.USA, 1996 Get 15; 93(21): 11493-8.

Биологически эффективные конъюгаты, которые были описаны в научных медицинских обзорах и цитированы выше, содержат молекулы носителей, которые построены из мономеров диаминомонокарбоновых кислот, а именно лизинов, которые связаны друг с другом пептидными связями через аминогруппы в α -положениях, следовательно, в результате их синтеза образуется поли-(α )-L-лизин, и указанные факты некоторым образом являются косвенным подтверждением представлений данного изобретения.

На основе всех указанных выше аспектов новизна изобретения состоит в том, что каждый из поликатионных биоконъюгатов общей формулы (I), полученных согласно изобретению, содержит молекулы носителей общей формулы (I/a), и эти молекулы носителей построены из мономеров диаминомонокарбоновых кислот, которые связаны пептидными связями, образованными через аминогруппы в (β -, γ -, δ - ε -... , и т.д.) положениях, соответствующих значению m, а не через аминогруппы в α -положении, и поэтому в результате синтеза образуются β -, γ -, δ -, ε -... и т.д. полипептиды, которые структурно совершенно отличаются от тех полипептидов, которые были описаны в цитированных научных обзорах. Поэтому биологические свойства новых поликатионных биоконъюгатов общей формулы (I) будут изменены. Например, они более устойчивы к протеолитическим ферментам, кроме того, молекулы носителей общей формулы (I/a) сами по себе обладают определенной антипролиферативной, антивирусной активностью, и как следствие предпочтительно модифицируется биологическая эффективность новых поликатионных биоконъюгатов общей формулы (I). Новые поликатионные биоконъюгаты общей формулы (I) согласно изобретению готовят в виде фармацевтических препаратов, которые применимы перорально, парентерально или трансдермально для системного или локального использования.

Предпочтительные представители новых поликатионных биоконъюгатов общей формулы (I) согласно изобретению представляют собой такие биоконъюгаты, в которых молекулами носителями общей формулы (I/a) являются поли-(ε )-L-лизины, поэтому препараты некоторых представителей иллюстрируются следующими приведенными ниже примерами.

ПРИМЕР 1. Получение гидробромида пальмитоил-поли(ε )-L-лизина

Схема реакции:

Формула гидробромида пальмитоил-поли-(ε )-L-лизина, согласно общей формуле (II) новых поликатионных биоконъюгатов по изобретению, представляет собой:

где m=3, r=99±2,

Е=СН₃(CH₂)₁₄-CO-,

i=1; т.е. с молекулой носителя химической связью связан только один вид молекул усилителей, и

p₁=12±2%.

a) Гидробромид поли-(ε )-L-лизина (средняя М.м.=12700±200, удельный угол оптического вращения=+32,4° , степень полимеризации: R=99±2), в качестве молекулы носителя согласно изобретению общей формулы (I/a) синтезировали, следуя способу, описанному в примере 1i) описания заявки на выдачу патента Венгрии HU 202553 В.

b) для получения пальмитоил-N-гидроксисукцинимида требовалась реакция пальмитоилирования: 1,28 г (5 ммоль) пальмитиновой кислоты и 0,58 г (5 ммоль) N-гидроксисукцинимида растворяли в 12 мл абс. тетрагидрофурана и к полученному раствору добавляли 1,03 г (5 ммоль) дициклогексилкарбодиимида, затем смесь перемешивали в течение 4 часов при 0° С, потом оставляли при +4° С на 12 часов и осажденный дициклогексилкарбамид, который образовался в ходе реакции, фильтровали через стеклянный фильтр в вакууме и три раза промывали тетрагидрофураном, полученный таким образом прозрачный раствор концентрировали досуха, твердый остаток растворяли в 100 мл этилацетата и последний три раза промывали 5% раствором бикарбоната натрия, затем три раза водой, в результате чего получали 1,08 г конечного продукта пальмитоил-N-гидроксисукцинимида в кристаллической форме белого цвета. Чистоту продукта контролировали ТСХ и ИКС.

с) 250 мг гидробромида поли-(ε )-L-лизина, полученного согласно способу, описанному в примере 1а), растворяли в 1,5 мл воды, рН раствора доводили до 8 добавлением 1 н. NaOH при энергичном перемешивании, затем раствор осветляли добавлением 1/5 мл тетрагидрофурана и 0,5 мл диметилформамида и после добавления 50 мг бикарбоната натрия при энергичном перемешивании, 28 мг пальмитоил-N-гидроксисукцинимида, свежеприготовленного согласно примеру 1b) и растворенного в 0,2 мл смеси 6:1 тетра-гидрофурана/диметилформамида, добавляли к реакционной смеси с последующим энергичным перемешиванием в течение 4 часов, при поддержании рН, равным 8, добавлением в раствор по каплям 5 н. гидроокиси натрия, и потом оставляли на 12 часов при +4° C. После этого по каплям добавляли 0,1 мл азеотропного раствора бромистого водорода, затем реакционную смесь вливали в избыток (20 мл) тетрагидрофурана, осадок промывали тетрагидрофураном три-четыре раза до тех пор, пока он не становился порошкообразным, затем последний промывали два раза диэтиловым эфиром и затем сушили; таким образом, получали конечный продукт гидробромид пальмитоил-поли-(ε )-L-лизина. Выход составлял 245 мг. Свободные аминогруппы продукта проверяли анализом с тринитробензолсульфоновой кислотой, согласно которому степень насыщения составляла 12±2° C. При увеличении количества пальмитоил-N-гидроксисукцинимидного реагента степень насыщения также увеличивалась и достигала необходимого уровня в %.

ПРИМЕР 2. Получение гидробромида гемисукцинил-поли(ε )-L-лизина

Схема реакции:

Формула бромистоводородной соли гемисукцинил-поли(ε )-L-лизина, согласно общей формуле (III) новых соединений по изобретению, представляет собой:

где:

m=3, r=99±2,

(-)С=-OC-CH₂-CH₂-COOH;

j=1; т.е. с молекулой носителя ковалентной связью связан только один вид связывающих молекул, и

р₂=20±2%.

a) Гидробромид поли-(ε )-L-лизина в качестве молекулы носителя общей формулы (I/a) изобретения синтезировали согласно способу примера 1а) данного описания.

b) 60 мг гидробромида поли-(ε )-L-лизина, полученного согласно примеру 1а), растворяли в 2 мл воды и рН раствора доводили до 8, добавляя 1 н. гидроокись натрия при энергичном перемешивании, затем к раствору частями добавляли 30 мг свежеприготовленного янтарного ангидрида примерно в течение времени, равного 40 минутам, при этом поддержание рН на уровне 8 осуществляли добавлением по каплям 5 н. NaOH, после чего дополнительно перемешивали в течение 40 минут, и в конце реакции рН смеси понижали до 4,5 6 н. соляной кислотой, затем помещали в диализный мешок и потом диализовали против воды в течение 48 часов при температуре +4° С, меняя воду четыре раза, конечный продукт бромистоводородную соль гемисукцинил-поли-(ε )-L-лизина, выделяли сушкой вымораживанием. Выход составлял 46 мг. Свободные аминогруппы продукта проверяли анализом с тринитробензолсульфоновой кислотой, согласно которому степень насыщения составляла 20° C. При увеличении количества янтарной кислоты степень насыщения также увеличивалась и достигала надлежащего необходимого уровня в %.

ПРИМЕР 3. Получение гидробромида холестеролгемисукцинил-поли-(ε )-L-лизина

Схема реакции:

Формула бромистоводородной соли холестеролгемисукцинил-поли-(ε )-L-лизина, согласно общей формуле (IV) новых поликатионных биоконъюгатов согласно изобретению представляет собой:

где m=3, r=99±2,

С=-ОС-СН₂-СН₂-СО-;

Е=холестерин;

ek=ck=1; т.е. с молекулой носителя ковалентной связью связан только один вид молекул усилителей и связывающих молекул, и

р₃=15±2%.

а) Гидробромид поли-(ε )-L-лизина в качестве молекулы носителя общей формулы (I/a) согласно изобретению синтезировали согласно примеру 1a) данного описания.

b) Для получения сложного эфира холестеролгемисукцинат-N-гидроксисукцинимида требовалась конъюгация: 0,98 г (2 ммоль) коммерчески доступного (например, от Sigma) холестерол-гемисукцината и 0/23 г (2 ммоль) N-гидроксисукцинимида растворяли в 10 мл абс. тетрагидрофурана, затем добавляли 0,41 г (2 ммоль) дициклогексилкарбодиимида и смесь перемешивали при 0° С в течение 4 часов, потом оставляли на 12 часов и образованный таким образом осадок дициклогексилкарбамида отфильтровывали через стеклянный фильтр в вакууме, три раза промывали тетрагидрофураном и полученный таким образом прозрачный раствор концентрировали досуха, твердый остаток растворяли в 50 мл этилацетата и последний три раза промывали 5% раствором бикарбоната натрия, затем три раза водой. Затем сушили добавлением сиккатива сульфата натрия, после чего промывали этилацетатом и концентрировали раствор. Конечный продукт сложный эфир холестеролгемисукцинат-N-гидроксисукцинимида получали в виде белого кристаллического материала. Выход составлял 0,73 г. Чистоту контролировали ТСХ и ИКС.

c) 240 мг бромистоводородной соли поли-(ε )-L-лизина, синтезированной согласно примеру 3а), растворяли в 4,8 мл воды, рН раствора доводили до 8 добавлением 1 н. гидроокиси натрия при энергичном перемешивании и, добавляя 1,6 мл тетрагидрофурана, получали прозрачный раствор, затем в него вливали 200 мг бикарбоната натрия при энергичном перемешивании, при добавлении 50 мг сложного эфира холестеролгемисукцинат-N-гидроксисукцинимида, свежеприготовленного согласно примеру 3b), растворенного в 2,4 мл тетрагидрофурана, и раствор выдерживали, сильно перемешивая при комнатной температуре в течение 4 часов, при этом поддерживая значение рН 8 добавлением в раствор по каплям 5 н. гидроокиси натрия. Затем раствор оставляли на 12 часов при +4° С, после этого по каплям добавляли 0,3 мл азеотропного бромистого водорода и реакционную смесь вливали в избыток (30 мл) тетрагидрофурана. После этого осадок промывали тетрагидрофураном три-четыре раза, до тех пор, пока он не становился порошкообразным. Последний промывали два раза диэтиловым эфиром, сушили и таким образом получали конечный продукт гидробромид холестеролгемисукцинил-поли-(ε )-L-лизина с выходом 275 мг. Свободные аминогруппы продукта проверяли анализом с тринитробензолсульфоновой кислотой, согласно которому степень насыщения составляла 15±2%. При увеличении количества сложного эфира холестеролгемисукцинат-N-гидроксисукцинимида степень насыщения также увеличивалась и достигала надлежащего необходимого уровня в %.

ПРИМЕР 4. Получение гидробромида поли-(ε )-L-лизин-цисплатина

Схема реакции:

Формула гидробромида поли-(ε )-L-лизинцисплатика, согласно новым поликатионным биоконъюгатам общей формулы (VII) в соответствии с изобретением представляет собой:

где m=3, r=99±2,

(-)С=-ОС-СН₂-СН₂-СОО^-

(+)К=цисплатин,

u=j=1; т.е. только один вид молекул усилителей и связывающих молекул соответственно связываются ионными связями с молекулой носителя, и

z=р₂=80±2%.

10 мг цисплатина (Platidiam®, производитель: Lachema, Czech.Rep.) растворяли в 3 мл воды и к полученному раствору добавляли 23 мг бромистоводородной соли гемисукцинил-поли-(ε )-L-лизина с 80% уровнем сукцинилирования, полученной согласно примеру 1 данного описания, раствор оставляли на 48 часов при +4° С, затем помещали в диализный мешок и диализовали против воды в течение 48 часов при температуре +4° С, меняя воду четыре раза, затем конечный продукт гидробромид поли-(ε )-L-лизин-цисплатина выделяли сушкой вымораживанием. Выход составлял 15 мг. Содержание Pt (т.е. содержание цисплатина) в продукте анализировали атомно-абсорбционной спектроскопией, согласно которой массовое отношение Pt/Br=16; молярное отношение=6,5; содержание Pt=2,7 мг/г; количество цисплатина в молекуле гидробромида поли-(ε )-L-лизинцисплатина было пропорционально степени сукцинилирования гидробромида гемисукцинил-поли-(ε )-L-лизина.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучали подавляющее опухоли действие поликатионных биоконъюгатов, которое является частью предмета изобретения, in vitro на культурах опухолевых клеток и in vivo на трансплантируемых опухолях грызунов. Ингибирующее действие на пролиферацию клеток in vitro и ингибирующее действие на рост опухолей in vivo различных поликатионных биоконъюгатов, полученных согласно изобретению, сравнивали с контролем, не подвергавшимся воздействию.

Биологические эксперименты выполняли с использованием соединений, которые были получены согласно примерам 1, 2, 3 и 4 изобретения, а именно

- гидробромида пальмитоил-поли-(ε )-L-лизина,

- гидробромида гемисукцинил-поли-(ε )-L-лизина,

- гидробромида холестеролгемисукцинил-поли-(ε )-L-лизина,

- гидробромида поли-(ε )-L-лизинцисплатина.

Эксперименты in vitro

Эксперименты in vitro выполняли с гидробромидом пальмитоил-поли-(ε )-L-лизина, гидробромидом гемисукцинил-поли-(ε )-L-лизина и гидробромидом поли-(ε )-L-лизинцисплатина.

Линии клеток, используемых в экспериментах:

- линия клеток лимфоцитарного лейкоза мышей Р388, полученная от Arthur D. Little Inc., Cambridge, Mass., USA, поддерживаемая in vitro в National Institute of Oncology, Budapest, Hungary (Cancer Treat.Rep., 1986; 70: 279-284);

- линия клеток рака молочной железы человека MCF-7, исходно полученная из American Type Culture Collection;

- линия клеток рака простаты человека РС3, полученная из American Type Culture Collection;

Способы, используемые в экспериментах in vitro:

1. Анализ клоногенной активности

Клетки MCF-7 или РС3 помещали в чашки Петри, затем клетки инкубировали в соответствующей среде и условиях с серийными разведениями различных поликатионных биоконъюгатов, полученных согласно изобретению. Затем подсчитывали колонии, состоящие минимум из 30 клеток и усредняли значения, полученные из трех параллельных чашек. Подсчитывали относительную эффективность образования колоний, принимая контрольные значения за 100 процентов. (Cancer Detection and Prevention, 20(2): 146-152, 1996).

2. Ингибирование пролиферации

Анализ с сульфородамином В (SRB): примерно от одной до двух тысяч клеток помещали в каждую лунку специального небольшого пластикового планшета (микропланшеты с лунками). Клетки инкубировали в соответствующей среде и условиях и после прилипания к поверхности обрабатывали серийными разведениями различных поликатионных биоконъюгатов, полученных согласно изобретению. К концу эксперимента клетки фиксировали, красили SRB и регистрировали оптическую плотность, которая прямо пропорциональна пролиферации клеток, в считывающем устройстве CLS 962 для ELISA на микропланшетах. Рассчитывали относительное ингибирование пролиферации, принимая контрольные значения за 100 процентов (Cancer Detection and Prevention, 20(2): 146-152, 1996).

Способ подсчета клеток в камере типа Neubauer: суспензионные культуры экспоненциально растущих клеток, которые были помещены в соответствующую среду и условия, обрабатывали серийными разведениями различных поликатионных биоконъюгатов, полученных согласно изобретению, и через 24 и 48 часов после обработки клетки красили трипановым синим, подсчитывали обработанные и контрольные клетки в модифицированной гемоцитометрической камере типа Neubauer. Относительное ингибирование пролиферации рассчитывали, принимая контрольные значения за 100 процентов.

Эксперименты in vivo

Эксперименты in vivo выполняли с гидробромидом пальмитоил-поли-(ε )-L-лизина и гидробромидом холестеролгемисукцинил-поли-(ε )-L-лизина в виде монотерапии и вместе с Cytoxan® (Bristol-Myers) в качестве примера комбинированной терапии, и соединения вводили в режиме терапии однократной и многократными дозами и применяли их внутривенно и внутрибрюшинно.

Ингибирующее действие поликатионных биоконъюгатов на рост опухолей изучали на следующих трансплантируемых опухолях грызунов:

- клетки лимфоидного лейкоза Р-388, полученные от Cambridge, Mass., USA, трансплантировали в/б и п/к животным: самцам мышей инбредной линии BDF1 массой 22-24 г, разводимых в соответствующих условиях в отсутствии патогенов (SPF);

- саркому S-180, полученную от Chester Beatty I., London, трансплантировали п/к животным: самцам мышей инбредной линии BDF1 массой 22-24 г, разводимых в соответствующих условиях в отсутствии патогенов (SPF);

Результаты биологических экспериментов

Эксперименты in vitro

На культурах опухолевых клеток in vitro гидробромид пальмитоил-поли-(ε )-L-лизина, гидробромид холестеролгемисукцинил-поли-(ε )-L-лизина и гидробромид поли-(ε )-L-лизинцисплатина оказывали зависимое от дозы ингибирование образования колоний и пролиферации клеток, наиболее эффективное ингибирование показано при использовании гидробромида пальмитоил-поли-(ε )-L-лизина и гидробромида поли-(ε )-L-лизинцисплатина.

Эксперименты in vivo

На основе средних объемов опухолей и кривых роста опухолей обнаружено значительное ингибирующее действие гидробромида пальмитоил-поли-(ε )-L-лизина и гидробромида холестеролгемисукцинил-поли-(ε )-L-лизина на трансплантируемые опухоли грызунов, кроме того, комбинированная обработка гидробромидом пальмитоил-поли-(ε )-L-лизина плюс Cytoxan® значительно ингибировала рост опухолей и значительно увеличивала продолжительность жизни экспериментальных животных, которым инокулировали опухоли, по сравнению с необработанным контролем, а также с животными, которых обрабатывали только Cytoxan®.

Из таблиц 1 и 2 следует, что уровень насыщения существенно влияет на токсичность. Причем это наиболее ярко выражено в случае внутривенного введения по значениям LD50 и LD100 при 60% и 20% насыщении.

Данные таблицы 3 показывают, что при увеличении насыщенности янтарным ангидридом (или другой подходящей молекулой) токсичность молекулы носителя может быть уменьшена или даже устранена, и/или биологическая активность, как следствие этого, будет изменена. К такой созданной молекуле носителя, которая является основной частью биоконъюгата, молекулы усилителя могут быть присоединены в различном соотношении.

Таблица 4 показывает, что аналогично с производными на основе янтарного ангидрида производные с пальмитоиловой кислотой с разным уровнем насыщения демонстрируют различное ингибирующее действие.

Изобретение относится к области медицины и касается новых поликатионных биоконъюгатов общей формулы I, пригодных для транспортировки различных активных веществ в организм. Конъюгаты обладают повышенной активностью и низкой токсичностью. 2 с. и 34 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Поликатионные биоконъюгаты, каждый из которых содержит изополипептидные поликатионные молекулы носителей, имеющие свободные α -аминогруппы, и одну или более молекул усилителя и/или молекулы усилителя со связывающими молекулами, где поликатионный биоконъюгат имеет общую формулу (I)

где

“r” является средним значением в пределах от 20 до 400 и означает количество мономеров ацильных групп диаминомонокарбоновых кислот;

“m”=0, 1, 2, 3, ... 20;

“М” означает молекулы усилителя и/или связывающие молекулы, имеющие соответствующие функциональные группы для коньюгирования с молекулой носителя;

“х” показывает, что тип молекул усилителя и/или связывающих молекул в конкретном поликатионном биоконъюгате может быть идентичным (х=1) или разного (х>1) вида и “х” может быть 0, 1, 2, ... 10, указывая число различных групп молекул, конъюгированных с молекулой носителя;

"(k)" означает молекулы усилителя и/или связывающие молекулы, связанные ковалентными (=k) связями с молекулой носителя;

“(i)” означает молекулы усилителя, связанные ионными (=i) связями с молекулой носителя;

где молекулы усилителей могут быть связаны непосредственно и/или опосредованно через связывающую молекулу [(k)Mx] с молекулой носителя при условии, что наличие как [(k)Mx], так и [(i)Mx] в одном и том же поликатионном биоконъюгате [(i)Mx]· [(k)Mx] обозначается как [(k/i)Mx]; и среди [(k)Mx] и [(i)Mx] значение “х” по меньшей мере у одного из них отличается от 0 в одном и том же поликатионном биоконъюгате.

(свободная α -аминогруппа)

где “r” и “m” имеют такие же значения, как в общей формуле (I).

[(k)Mx]=[Ex_i]_p1,

и поликатионные биоконъюгаты имеют общую формулу (II)

где “Е” означает все молекулы усилителей, непосредственно конъюгированных ковалентными связями с молекулами носителей общей формулы (I/a), и

“x_i” показывает, что молекулы усилителей “Е”, конъюгированные с молекулой носителя являются идентичными (x_i=1) или различных (x_i>1) видов, согласно величине x_i;

“p₁” означает степень насыщения в % молекулы носителя общей формулы (I/a) молекулами усилителей [Ex_i], значение которой >0 и <100, за счет которого определяется соотношение между свободными NН₂-группами, не вовлеченными в образование химических связей, и связанными NH₂-группами, влияя таким образом на катионный характер поликатионных биоконъюгатов, и

“r” и “m” имеют такие же значения, как в общей формуле (I).

[(k)Mx]=[(-)Cx_j]_p2

и конъюгаты имеют общую формулу (III)

где "(-)С" означает все связывающие молекулы исключительно анионного характера связанные ковалентными связями с данным представителем молекул носителей общей формулы (I/a);

“x_j” показывает, что связывающие молекулы "(-)С", конъюгированные с молекулой носителя, являются идентичными (x_j=1), либо различных (x_j>1) видов согласно величине “x_j”;

“р₂” означает степень насыщения в % молекулы носителя связывающими молекулами [(-)Cx_j], значение которой >0 и <100, за счет которого определяется соотношение между свободными NH₂-группами, не вовлеченными в образование химических связей, и связанными NН₂-группами, влияя таким образом на катионный характер поликатионных биоконъюгатов, и

“r” и “m” имеют такие же значения, как в общей формуле (I).

[(k)Mx]=[Cx_ck - Ex_ek]_p3,

и поликатионные биоконъюгаты имеют общую формулу (IV)

где “С” и “Е” означают все молекулы усилителей, конъюгированные ковалентными связями опосредованно через связывающие молекулы Cx_ck, которые также конъюгированы ковалентными связями с молекулами носителей общей формулы (I/a);

“x_ck” показывает, являются ли связывающие молекулы “Сх-”, конъюгированные с молекулой носителя, идентичными (x_ck=1) либо различных (x_ck>1) видов согласно числу “x_ck”;

“x_ek” показывает, являются ли молекулы усилителей “-Ех”, конъюгированные с молекулой носителя опосредованно через связывающие молекулы Сх ковалентными связями, идентичными (x_ek=1) либо различных (x_ek>1) видов согласно числу “x_ek”;

“р₃” означает степень насыщения в % молекулы носителя [Cx_ck-Ex_ek] молекулами усилителей, которые связаны со связывающими молекулами, значение которого >0 и <100, за счет которого определяется соотношение между свободными NH₂-группами, не вовлеченными в образование химических связей, и связанными NН₂-группами, влияя таким образом на катионный характер поликатионных биоконъюгатов; и

“r” и “m” имеют такие же значения, как в общей формуле (I).

a) молекулами усилителей [Ex_i], и/или

b) связывающими молекулами [(-)Cx_j] анионного характера, и/или

c) опосредованно связанными молекулами усилителей [Cx_ck-Ex_ek], которые могут быть либо идентичными (x_i и/или x_j и/или x_ck и/или x_ek=1), или разных (x_i и/или x_j и/или x_ck и/или x_ek>1) видов, при условии, что из молекул типов [Ex_i] и/или [(-)Cx_j] и/или [Cx_ck-Ex_ek] по меньшей мере две присутствуют в биоконъюгате, и в указанных биоконъюгатах [(k)Mx] варьирует следующим образом:

[(k)Mx]=[Ex_i]_p1+[(-)Cx_j]_p2, или [(k)Mx]=[Ex_i]_p1+[Cx_ck - Ex_ek]_p3, или [(k)Mx]=[Cx_ck - Ex_ek]_p3+[(-)Cx_j]_p2, или [(k)Mx]=[Ex_i]_p1+[Cx_ck - Ex_ek]_p3+[(-)Cx_j]_p2, и поликатионные биоконъюгаты имеют общую формулу (V)

(свободная

α -аминогруппа)

где “[Ex_i]_p1” имеет такое же значение, как в общей формуле (II),

"[(-)Cx_j]_p2" имеет такое же значение, как в общей формуле (III),

“[Cx_ck-Ex_ek]_p3” имеет такое же значение, как в общей формуле (IV),

“m” имеет такое же значение, как в общей формуле (I),

и значение “p₁”+“р₂”+“р₃” >0 и <100 и среди “p₁”, “p₂” и “р₃” по меньшей мере два значения больше 0;

кроме того, в данном поликатионном биоконъюгате молекулы “Ех” в [Ex_i] и молекулы (-)Сх в [(-)Cx_j] необязательно идентичны молекулам “Еx” и “Сx”, присутствующим в [Cx_ck-Ex_ek], и это несовпадение обозначено как "x_i/x_j/x_ck/x_ek".

[(k)Mx]=[(-)Ax_s]_t

и поликатионные биоконъюгаты имеют общую формулу (VI)

где “(-)А” означает все молекулы усилителей анионного характера, которые непосредственно конъюгированы с молекулами носителей общей формулы (I/a) ионными связями;

“x_s” показывает, являются ли анионные/полианионные молекулы усилителей “(-)Ах”, конъюгированные с молекулой носителя, идентичными (x_s=1), или разных (x_s>1) видов согласно числу “x_s”;

“t” показывает степень насыщения в % данного представителя молекул носителей молекулами усилителей [(-)Ax_s]_t, значение которого >0 и <100, за счет которого определяется соотношение между свободными NH₂-группами, не вовлеченными в образование химических связей, и связанными NH₂-группами, влияя таким образом на катионный характер поликатионных биоконъюгатов, и

“r” и “m” имеют такие же значения, как в общей формуле (I).

[(k)Mx]=[(-)Cx_j]_p2·_[(+)Kxu]z,

и поликатионные биоконъюгаты имеют общую формулу (VII)

где “(+)K” означает все молекулы усилителей катионного характера вида “х”, непосредственно конъюгированных ионными связями через связывающие молекулы [(-)Cx_j]_p2 с данным представителем соединений общей формулы (III);

“x_u” показывает, являются ли катионные и/или поликатионные молекулы усилителя [(+)Kх_u], связанные с данным соединением общей формулы (I), идентичными (x_u=1), или разных (x_u>1) видов, согласно числу “x_u”;

“z” показывает степень насыщения в % данного представителя конъюгатов общей формулы (III) молекулами усилителя [(+)Kх_u], значение которого >0 и <100, за счет которого определяется соотношение между свободными NН₂-группами, не вовлеченными в образование химических связей, и связанными NH₂-группами, влияя таким образом на катионный характер поликатионных биоконъюгатов, и что молекулы [(+)Kх_u]_z катионного характера могут быть конъюгированы только через связывающие молекулы [(-)Cx_j]_p2 анионного характера с соединениями общей формулы (III), поэтому “р₂”=“z”,

“[(-)Cx_j]_p2” имеет такое же значение, как в общей формуле (III),

“r” и “m” имеют такие же значения, как в общей формуле (I).

[(k/i)Mx]={[(-)Cx_j]_p2·_{[(+)Кxu]z}· [(-)Axs]t,}

и поликатионные биоконъюгаты имеют общую формулу (VIII)

где “[(-)Cx_j]_p2·_{[(+)Kxu]z” имеет такое же значение, как в общей формуле (VII),}

“[(-)Ax_s]_t” имеет такое же значение, как в общей формуле (VI),

“m” и “r” имеют такое же значение, как в общей формуле (I).

[(k/i)Mx]=[Ex_i]_p1·_{[(-)Axs]t, или}

[(k/i)Mx]=[Cx_ck-Ex_ek]_p3·_{[(-)Axs]t, или}

[(k/i)Mx]=[Ex_i]_p1+[Cx_ek]_p3·_[(-)Axs]t,

и поликатионные биоконъюгаты описываются общей формулой (IX)

где “[(-)Ax_s]_t” имеет такое же значение, как в общей формуле (VI),

“[Ex_i]_p1” имеет такое же значение, как в общей формуле (II),

“[Cx_ck-Ex_ek]_p3” имеет такое же значение, как в общей формуле (IV),

[(k/i)Mx], [(k)Mx], “m” и “r” имеют такие же значения, как в общей формуле (I),

“p₁+t” или “р₃+t” или “p₁+р₃+t” >0 и <100,

“p₁” и/или “р₃”>0,

“t”>0.

[(k/i)Mx]=[Ex_i]_p1+{[(-)Cx_j]_p2·_{[(+)Кxu]z}, или}

[(k/i)Mx]=[Cx_ck-Ex_ek]_p3+{[(-)Cx_j]_p2·_{[(+)Kxu]z}, или}

[(k/i)Mx]=[Ex_i]_p1+[Cx_ck-Ex_ek]_p3+{[(-)Cx_j]_p2·_[(+)Kxu]z},

и поликатионные биоконъюгаты имеют общую формулу (X):

где “[(-)Cx_j]_p2·_{[(+)Kxu]z” имеет такое же значение, как в общей формуле (VII),}

“[Ex_i]_p1” имеет такое же значение, как в общей формуле (II),

“[Cx_ck-Ex_ek]_p3” имеет такое же значение, как в общей формуле (IV),

“[(k/i)Mx”, [(k)Mx”, “m” и “r” имеют такие же значения, как в общей формуле (I), кроме того,

“p₁+z”, или “р₃+z” или “p₁+р₃+z” >0 и <100,

“p₁” и/или “р₃”>0,

“z”=“р₂”>0.

[(k/i)Mx]=[Ex_i]_p1+{[(-)Cx_j]_p2·_{[(+)Kxu]z)· [(-)Ахs]t,или}

[(k/i)Mx]=[Cx_ck-Ex_ek]_p3+{[(-)Cx_j]_p2·_{[(+)Кxu]z}· [(-) Axs]t, или}

[(k/i)Mx]=[Ex_i]_p1+[Cx_ck-Ex_ek]_p3+([(-)Cx_j]_p2·_{[(+)Kxu]z}· [(-)Axs]t,}

и поликатионные биоконъюгаты имеют общую формулу (XI)

где [(-)Ax_s]_t имеет такое же значение, как в общей формуле (VI),

“[(-)Cx_j]_p2·_{[(+) Кхu]z” имеет такое же значение, как в общей формуле (VII),}

“[Ex_i]_p1” имеет такое же значение, как в общей формуле (II),

“[Cx_ck-Ex_ek]_p3” имеет такое же значение как в общей формуле (IV),

“[(k/i)Mx”, “[(k)Mx”, “m” и “r” имеют такие же значения, как в общей формуле (I),

“p₁”+“р₃”+“t”+“z”, “p₁”+“t”+“z” или “р₃”+“t”+“z” >0 и ≤ 100, и среди

“p₁” или “р₃”, по меньшей мере один из них имеет значение >0; и

“t”>0,

“z”=“р₂”>0.