СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ СОСТОЯНИЯ НОВОРОЖДЕННЫХ ОТ ЖЕНЩИН С ГЕСТОЗОМ РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/68 G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и неонатологии, и может быть использовано для дородового прогнозирования состояния новорожденного от женщин с гестозом различной степени тяжести.

Известен способ прогнозирования состояния новорожденных детей путем определения активности сукцинатдегидрогеназы и альфа-глицерофосфатдегидрогеназы в лимфоцитах периферической крови беременной за 1-3 дня до родов [5]. При значениях активности сукцинатдегидрогеназы 4,12-8,75 гранул/лимф. и альфа-глицерофосфатдегидрогеназы 3,00-5,15 гранул/лимф. прогнозируют тяжелое состояние новорожденного с выраженными метаболическими нарушениями в первые три дня жизни, а при значениях активности сукцинатдегидрогеназы 13,50-18,25 гранул/лимф. и альфа-глицерофосфатдегидрогеназы 5,70-9,45 гранул/лимф. прогнозируют удовлетворительное состояние с метаболическими изменениями функционального характера.

Известный способ является недостаточно точным, так как не учитывает, что у беременной женщины может быть гестоз, который может повлиять на состояние новорожденного ребенка. Цитохимический метод, используемый в известном способе для определения активности ферментов, является полуколичественным, что дополнительно снижает точность прогнозирования. Кроме того, способ реализуется только за 1-3 дня до родов, вследствие чего акушеры-гинекологи не успевают применить медикаментозные средства, направленные на улучшение состояния новорожденных.

Задачей изобретения является создание нового информативного способа прогнозирования состояния новорожденных от женщин с гестозом различной степени тяжести в первые минуты жизни.

Задача достигается тем, что с помощью биолюминесцентного метода в тромбоцитах крови беременных с гестозом различной степени тяжести при сроке беременности 32-38 недель определяют активность глутатионредуктазы (ГР), НАДФ-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДФГДГ) и НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы (НАДФИЦДГ). Затем рассчитывают коэффициент обмена никотинамиддинуклеотидфосфата (КОН), представляющий собой отношение активности ГР к произведению активностей НАДФГДГ и НАДФИЦДГ.

Т.е.: КОН=ГР/(НАДФГДГ·НАДФИЦЦГ).

При значении КОН, равном 1,3 и ниже, прогнозируют оценку состояния новорожденного по шкале Апгар 6 и менее баллов. При значении КОН выше 1,3 прогнозируют оценку состояния новорожденного по шкале Апгар 7-10 баллов.

Значение 1,3 получено опытным путем на основании сопоставления результатов проведенного биолюминесцентного анализа активности ферментов в тромбоцитах у беременных женщин с различной степенью гестоза и последующего клинического состояния новорожденных.

Одной из причин развития гестоза беременных является расстройство системы гемостаза, которое рассматривается как одно из важнейших патогенетических звеньев в развитии данной патологии [2, 7]. Патологические изменения в системе гемостаза у беременных женщин ведут к серьезным клиническим последствиям, в том числе и для плода и новорожденного. Ключевую роль в системе гемостаза играют тромбоциты. Именно эти клетки создают основу клеточного звена системы гемостаза, а также в тромбоцитах синтезируется ряд ключевых факторов плазменного звена гемостаза, в частности фибриноген. Функция тромбоцитов во многом определяется состоянием их внутриклеточной метаболической системы. Именно в результате оптимального соотношения уровня интенсивности различных метаболических процессов тромбоцит выполняет свою функцию, в том числе и по синтезу биологически активных веществ, принимающих участие в процессах свертывания крови. Одним из важных метаболических параметров, в том числе регулирующих и интенсивность синтетических процессов, является соотношение восстановленной и окисленной форм никотинамиддинуклеотида (НАДФН/НАДФ⁺). Величина данного соотношения определяется активностью НАДФ-зависимых дегидрогеназ, восстанавливающих НАДФ⁺ и окисляющих НАДФН.

Глутатионредуктаза (ГР, КФ 1.6.4.2) катализирует восстановление окисленного глутатиона (дисульфидной формы) за счет НАДФН. Фермент локализуется в цитоплазматическом компартменте. Считается, что одной из главных функций глутатиона является сохранение ферментов, в активном центре которых имеются SH-группы, в активной восстановленной форме. Обсуждается коферментная функция глутатиона и его роль в транспорте аминокислот через мембрану [1].

НАДФ-зависимая глутаматдегидрогеназа (НАДФГДГ, КФ 1.4.1.4) осуществляет окислительное дезаминирование L-глутаминовой кислоты, используя в качестве кофактора НАДФ⁺. Ферментативная реакция глутаматдегидрогеназы является обратимой, соответственно аммиак в присутствии НАДФН и α-кетоглутаровой кислоты может участвовать в синтезе глутамата. Глутаматдегидрогеназа является олигомерным ферментом с молекулярной массой 312000, который состоит из 6 субъединиц. Фермент проявляет свою активность только в мультимерной форме. При диссоциации глутаматдегидрогеназы на субъединицы, которая происходит в присутствии НАДФН, гуанозинтрифосфата и ряда стероидных гормонов, фермент теряет способность осуществлять окислительное дезаминирование глутаминовой кислоты, но приобретает способность осуществлять дезаминирование ряда других аминокислот. Подобная особенность характеризует аллостерический механизм регуляции глутаматдегидрогеназы и определяет данный фермент как регуляторный в системе аминокислотного обмена.

НАДФ-зависимая изоцитратдегидрогеназа (НАДФИЦДГ, КФ 1.1.1.42) осуществляет реакцию дегидрирования изолимонной кислоты в присутствии НАДФ⁺. В ходе данной реакции изолимонная кислота одновременно и декарбоксилируется. Фермент является аллостерическим, в качестве специфического активатора необходим адензиндифиосфат. Фермент локализуется как в митохондриальном, так и цитоплазматическом компартментах клеток. В митохондриях НАДФИЦДГ осуществляет вспомогательную дегидрогеназную реакцию для цикла трикарбоновых кислот [6].

Способ выполняется следующим образом.

Забор венозной крови у беременных женщин с различной степенью тяжести гестоза при сроке беременности 32-38 недель осуществляют утром, натощак в количестве 9 мл. В качестве антикоагулянта используют 3,8% раствор цитрата натрия. Тромбоциты выделяют из венозной крови по методу, предложенному Савченко Е.А. с соавт. (2006) [4]. Для этого венозную кровь смешивают с 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1. Обогащенную тромбоцитами плазму получают путем центрифугирования стабилизированной крови при 140 g в течение 10 минут. Из пробирки осторожно отбирают супернатант, переносят в чистую пробирку и доводят до 10 мл буфером №1 (90 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 36 мМ цитрата натрия, 10 мМ ЭДТА, рН=7,2). Полученную смесь центрифугируют 15 мин при 400 g. Осадок ресуспензируют в 10 мл буфера №1 и повторно центрифугируют 1 мин при 400 g. Отбирают 9 мл супернатанта, который вновь центрифугируют при 400 g в течение 15 мин. Супернатант аккуратно сливают, а к осадку добавляют 10 мл буфера №2 (0,13 М NaCl, 0,02 М Трис-HCl буфера, 0,03 М ЭДТА, 0,015 М глюкозы, рН=7,4) и центрифугируют в том же режиме. После чего осадок разводят в 400 мкл буфера №2 и центрифугируют 50 с при 140 g. Для дальнейших исследований забирают 250 мкл супернатанта. Для определения активности НАДФН- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ из забранного супернатанта с тромбоцитами отбирают объем, содержащий 10⁷ клеток. Разрушают тромбоциты методом осмотического лизиса с доведением общего объема до 2,5 мл (конечная концентрация клеток составляет 4×10⁶/мл). Активность ГР, НАДФГДГ, НАДФИЦДГ определяют с помощью биолюминесцентного метода. Для этого в 150 мкл инкубационной смеси, содержащей соответствующий субстрат и кофактор, вносят 50 мкл суспензии разрушенных тромбоцитов. Конкретные значения концентраций субстратов и кофакторов, а также рН среды для определяемых ферментов представлены в таблице 1.

Таблица 1 Фермент Субстрат, мМ Кофактор, мМ РН буфера ГР GSH-0,5 НАДФН-0,0025 7,4 НАДФГДГ Глутамат - 0,5 НАДФ-1,65 9,8 НАДФИЦДГ Изоцитрат - 1,375 НАДФ-0,075 7,4 Примечание: среду с рН 9,8 готовят на Трис-HCl буфере (ICN Biomedicals Inc., США); с рН 7,4 - на К⁺, Na⁺ - фосфатном буфере (буфер готовят из K₂HPO₄ и NaH₂PO₄ (Реахим, Россия)).

Необходимо отметить, что в инкубационную смесь для определения активности НАДФИЦДГ дополнительно добавляют АДФ в концентрациях 2,15 мМ.

После инкубации исследуемых проб при 37°С в течение 30 минут для НАДФИЦДГ и НАДФГДГ или 5 минут для ГР к 200 мкл инкубационной смеси добавляют 50 мкл флавинмононуклеотида (ФМН) в концентрации 1,5×10^-5 M, 50 мкл 0,0005% миристинового альдегида и 10 мкл ферментативной системы НАДН: ФМНоксидоредуктаза-люцифераза (все реактивы биолюминесцентной системы разводят в 0,1 М К⁺, Na⁺ - фосфатном буфере с рН 7,0). После смешивания биолюминесцентных реактивов и инкубационной пробы с помощью биохемилюминометра, например марки "БЛМ-8803", измеряют свечение. Учитывая, что в клетках имеется определенное количество субстратов для течения различных метаболических реакций, в том числе и катализируемых исследуемыми ферментами, определяют показатели, условно названные "субстратный фон ферментов". Определение производят в тех же условиях, что и для вышеперечисленных дегидрогеназ, но в инкубационную смесь вместо соответствующего субстрата вносят буфер. В результате измерения свечения на биолюминометре получают относительные значения активности исследуемых ферментов. Чтобы получить абсолютные значения активности, строят графики зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации НАДФН (калибровочный график). Для этого 200 мкл стандартного раствора НАДФН в диапазоне 10^-9-10^-4 М вносят в кюветы биолюминометра, содержащие ФМН, миристиновый альдегид и НАДФН:ФМНоксидоредуктазу-люциферазу в концентрациях, указанных выше, после чего производят измерение интенсивности биолюминесценции. В связи с широким диапазоном рН буферов, используемых для определения дегидрогеназной активности, а также рН-зависимостью биолюминесценции ферментативной системы из светящихся бактерий, калибровочные графики строят для каждого рН буфера. Активность НАДФ-зависимых дегидрогеназ рассчитывают по формуле:

А=Δ[С]×V/Т,

где:

А - активность дегидрогеназы, Е на 2×10⁵ тромбоцитов (1Е=1 мкмоль/мин [1]);

Δ[С] - разница концентраций НАДФН в пробах "фермент" и "фон фермента", мкмоль;

V - объем пробы, мл;

Т - время инкубации, мин.

Затем рассчитывают КОН по отношению активности ГР к произведению активностей НАДФГДГ и НАДФИЦДГ. При величине КОН, равной 1,3 и ниже, прогнозируют низкую оценку состояния новорожденного по шкале Апгар (6 и менее баллов) и назначают лечебно-профилактические мероприятия беременной женщине. При значениях КОН выше 1,3 прогнозируют удовлетворительное состояние новорожденного с оценкой по шкале Апгар 7-10 баллов.

Величина КОН, равная 1,3 и ниже, свидетельствует о выраженном превалировании восстановления НАДФ⁺ над окислением НАДФН в дегидрогеназных реакциях, что повышает уровень пластических процессов и соответственно синтез факторов свертывания. Доказано, что при гестозе повышается активность свертывающего звена гемостаза, нарастает гиперкоагуляция и тромбинемия [3].

Данный способ апробирован на 76 беременных женщин с гестозом, находящихся на стационарном лечении в отделении патологии беременных МУЗ Родильного дома №1 (г.Красноярск). Результаты обследования представлены в табл.2.

Таблица 2 Величина КОН у беременных женщин с гестозом, впоследствии родивших детей с нормальным и ухудшенным клиническим состоянием (по шкале Апгар) Статистические показатели Оценка по шкале Апгар 7-10 баллов Оценка по шкале Апгар 6 и менее баллов Количество обследованных 59 17 Медиана 9,24 0,06 Минимальное значение 1,29 0,03 Максимальное значение 86,12 1,30

Активность ГР, НАДФГДГ и НАДФИЦДГ в тромбоцитах у беременных с гестозом определяли с помощью биолюминесцентного метода. По результатам обследования установлено, что впоследующем 59 женщин родили детей с нормальным клиническим состоянием (оценка по шкале Апгар на 1 минуте 7-8, на 5 минуте - 8-10). У этих женщин величина КОН составила 1,29-86,12. У одной женщины прогноз не совпал. КОН у нее был равен 1,29, но она родила клинически здорового ребенка (оценка по шкале Апгар на 1 минуте - 6, на 5 минуте - 8). 17 женщин впоследующем родили детей с ухудшенным клиническим состоянием (оценка по шкале Апгар на 1 минуте 5-6, на 5 минуте - 3-6). У этих женщин величина КОН составила 0,03-1,30. Таким образом, отмечено совпадение прогноза в 98,8%.

Пример 1. Беременная Ж., 25 лет. История родов №1818. Находилась на стационарном лечении в отделении патологии беременных МУЗ Родильного дома №1 с 25.05.05 по 14.06.05 с диагнозом: беременность 38 недель, гестоз легкой степени тяжести. При проведении биолюминесцентного анализа установлена следующая активность ферментов в тромбоцитах крови: ГР=195,17 мкЕ на 2×10⁵ тромбоцитов; НАДФГДГ=2,15 мкЕ на 2×10⁵ тромбоцитов; НАДФИЦЦГ=17,27 мкЕ на 2×10⁵ тромбоцитов. Величина КОН составила 5,26. Прогноз: состояние ребенка при рождении будет оценено на 7-10 баллов по шкале Апгар (удовлетворительное клиническое состояние).

Роды самостоятельные, произошли в 40 недель. Родился ребенок с оценкой состояния по шкале Апгар на 1 минуте жизни - 8 баллов, на 5 минуте - 9 баллов.

Пример 2. Беременная Б., 22 года. История родов №833. Находилась на стационарном лечении в отделении патологии беременных МУЗ Родильного дома №1 с 06.05.06 по 24.05.06 с диагнозом: беременность 35 недель, гестоз легкой степени тяжести. При проведении биолюминесцентного анализа установлена следующая активность ферментов в тромбоцитах крови: ГР=993,0 мкЕ на 2×10⁵ тромбоцитов; НАДФГДГ=10,50 мкЕ на 2×10⁵ тромбоцитов; НАДФИЦДГ=394,57 мкЕ на 2×10⁵ тромбоцитов. Величина КОН составила 0,24. Прогноз: состояние ребенка при рождении будет оценено ниже 7 баллов по шкале Апгар (неудовлетворительное клиническое состояние).

Роды путем экстренного кесарева сечения произошли в 37 недель. Родился ребенок с оценкой состояния по шкале Апгар на 1 минуте - 5 баллов, на 5 минуте - 6 баллов.

Пример 3. Беременная И., 25 лет. История родов №95. Находилась на стационарном лечении в отделении патологии беременных МУЗ Родильного дома №1 с 17.01.06 по 02.02.06 с диагнозом: беременность 38 недель, гестоз средней степени тяжести. При проведении биолюминесцентного анализа установлена следующая активность ферментов в тромбоцитах крови: ГР=4207,0 мкЕ на 2×10⁵ тромбоцитов; НАДФГДГ=1,05 мкЕ на 2×10⁵ тромбоцитов; НАДФИОДГ=2336,04 мкЕ на 2×10⁵ тромбоцитов. Величина КОН составила 1,72. Прогноз: состояние ребенка при рождении будет оценено на 7-10 баллов по шкале Апгар (удовлетворительное клиническое состояние).

Роды самостоятельные, произошли в 40 недель. Родился ребенок с оценкой состояния по шкале Апгар на 1 минуте - 8 баллов, на 5 минуте - 8 баллов.

Пример 4. Беременная С., 24 года. История родов №875. Находилась на стационарном лечении в отделении патологии беременных МУЗ Родильного дома №1 с 12.05.06 по 03.06.06 с диагнозом: беременность 32 недель, гестоз средней степени тяжести. При проведении биолюминесцентного анализа установлена следующая активность ферментов в тромбоцитах крови: ГР=2615,09 мкЕ на 2×10⁵ тромбоцитов; НАДФГДГ=4,28 мкЕ на 2×10⁵ тромбоцитов; НАДФИОДГ=890,18 мкЕ на 2×10⁵ тромбоцитов. Величина КОН составила 0,69. Прогноз: состояние ребенка при рождении будет оценено ниже 7 баллов по шкале Апгар (неудовлетворительное клиническое состояние).

Роды путем планового кесарева сечения произошли в 35 недель. Родился ребенок с оценкой состояния по шкале Апгар на 1 минуте - 5 баллов, на 5 минуте - 3 балла.

Пример 5. Беременная И., 24 года. История родов №953. Находилась на стационарном лечении в отделении анестезиологии и реаниматологии МУЗ Родильного дома №1 с 25.05.06 по 15.06.06 с диагнозом: беременность 35 недель, гестоз тяжелой степени тяжести. При проведении биолюминесцентного анализа установлена следующая активность ферментов в тромбоцитах крови: ГР=3148,23 мкЕ на 2×10⁵ тромбоцитов; НАДФГДГ=157,17 мкЕ на 2×10⁵ тромбоцитов; НАДФИЦДГ=14,74 мкЕ на 2×10⁵ тромбоцитов. Величина КОН составила 1,36. Прогноз: состояние ребенка при рождении будет оценено на 7-10 баллов по шкале Апгар (удовлетворительное клиническое состояние). Роды путем планового кесарева сечения произошли в 36 недель. Родился ребенок с оценкой состояния по шкале Апгар на 1 минуте - 8 баллов, на 5 минуте - 8 баллов.

Пример 6. Беременная Валиева P.M., 38 лет. История родов №877. Находилась на стационарном лечении в отделении анестезиологии и реаниматологии МУЗ Родильного дома №1 с 12.05.06 по 14.06.06 с диагнозом: беременность 32 недели, гестоз тяжелой степени тяжести. При проведении биолюминесцентного анализа установлена следующая активность ферментов в тромбоцитах крови: ГР=158,11 мкЕ на 2×10⁵ тромбоцитов; НАДФГДГ=1,87 мкЕ на 2×10⁵ тромбоцитов; НАДФИЦЦГ=124,35 мкЕ на 2×10⁵ тромбоцитов. Величина КОН составила 0,68. Прогноз: состояние ребенка при рождении будет оценено ниже 7 баллов по шкале Апгар (неудовлетворительное клиническое состояние).

Роды путем экстренного кесарева сечения произошли в 35 недель. Родился ребенок с оценкой состояния по шкале Апгар на 1 минуте - 4 балла, на 5 минуте - 3 балла, что подтверждает правильность прогноза.

Технический результат, получаемый при реализации предлагаемого способа:

- прогноз осуществляется за 2-6 недель до родов, что позволяет применить профилактические меры, направленные на улучшение состояния новорожденного;

- высокий уровень совпадения прогноза - 98,8%.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет за 2-6 недель до родов с высокой степенью точности осуществить прогнозирование состояния новорожденных у женщин с гестозом различной степени тяжести, что дает возможность своевременно провести лечебно-профилактические мероприятия и соответственно снизить частоту патологических состояний у новорожденных.

Источники информации

1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - М.: Медицина, 1998. - 704 с.

2. Желев В.А., Каннская Н.В., Белова Н.Г. и др. Организация работы лаборатории гемостаза в акушерской практике // Клиническая лабораторная диагностика. - 2006. - №9. - С.27-28.

3. Макацария А.Д. Тромботические состояния в акушерской практике. - М., 2004. - 35 с.

4. Савченко Е.А., Савченко А.А., Герасимчук А.Н., Грищенко Д.А. Оценка метаболического статуса тромбоцитов в норме и при ишемической болезни сердца//Клиническая лабораторная диагностика. - 2006. - №5. - С.33-36.

5. Способ прогнозирования состояния новорожденных детей. RU 2265850 С2. Опубл. 10.12.2005.

6. Строев Е.А. Биологическая химия. - М.: Высш. шк., 1986. - 479 с.

7. Шабанова Е.Ю., Миндукшев И.В., Малаховская Е.А. и др. Кооперативный характер гиперчувствительности тромбоцитов к АДФ // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 2005. - Т. 140, №9. - С.261-265.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и неонатологии. У женщин с гестозом различной степени тяжести при сроке беременности 32-38 недель в тромбоцитах периферической крови определяют активность глутатионредуктазы (ГР), НАДФ-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДФГДГ) и НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы (НАДФИЦДГ). Рассчитывают коэффициент обмена никотинамиддинуклеотидфосфата (КОН), представляющий собой отношение активности ГР к произведению активностей НАДФГДГ и НАДФИЦДГ. При значении КОН, равном 1,3 и ниже, прогнозируют оценку состояния новорожденного по шкале Апгар 6 и менее баллов, а при значении КОН выше 1,3 - 7-10 баллов. Использование способа позволяет повысить точность прогнозирования состояния новорожденных детей. 2 табл.

Способ прогнозирования состояния новорожденных детей путем исследования активности ферментов в периферической крови беременных, отличающийся тем, что с помощью биолюминесцентного метода в тромбоцитах крови беременных с гестозом различной степени тяжести при сроке беременности 32-38 недель определяют активность глутатионредуктазы (ГР), НАДФ-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДФГДГ) и НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы (НАДФИЦДГ), рассчитывают коэффициент обмена никотинамиддинуклеотидфосфата (КОН), представляющий собой отношение активности ГР к произведению активностей НАДФГДГ и НАДФИЦДГ, и при значении КОН, равном 1,3 и ниже, прогнозируют оценку состояния новорожденного по шкале Апгар 6 и менее баллов, а при значении КОН выше 1,3 - 7-10 баллов.