СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ГЕМОРРАГИЧЕСКИХ ОСЛОЖНЕНИЙ ПОСЛЕ ХИМИОТЕРАПИИ У БОЛЬНЫХ ОСТРЫМИ ЛЕЙКОЗАМИ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к области медицины, а именно к гематологии и онкологии. Может быть использовано при лечении больных острыми лейкозами.

Острые лейкозы занимают ведущее место по частоте встречаемости среди гемобластозов. Возникновение геморрагических осложнений после проведенной химиотерапии у больных острыми лейкозами значительно ухудшает качество их жизни и влияет на исход заболевания.

Большинство исследователей отмечают влияние состояния системы гемостаза на исход заболевания и выживаемость больных острыми лейкозами после проведенного лечения [1, 2, 3].

Известен способ прогнозирования кровотечений на ранней стадии острого миелобластного лейкоза по функции тромбоцитов с использованием питометрического проточного анализатора [4]. О возможности возникновения кровотечений у больных судят по низким показателям Р-селектина и количества тромбоцитов.

Известный способ недостаточно информативен, так как прогноз возникновения кровотечений после химиотерапии осуществляется только по функции тромбоцитов. При этом не учитываются функции всех других систем, участвующих в регуляции системы гемостаза. Кроме того, данный способ является дорогостоящим, так как основан на использовании цитометрического проточного анализатора.

Задачей изобретения является повышение достоверности прогнозирования за счет применения показателей, отражающих регуляторную активность клеток иммунной системы.

Задача достигается тем, что до проведения химиотерапии у больных острым лейкозом определяют активности ферментов лимфоцитов периферической крови - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) и НАДФ-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДФГДГ).

Доказано регуляторное влияние лимфоцитов на состояние системы гемостаза [5, 6, 7, 8]. Причем регуляция состояния системы гемостаза осуществляется на нескольких уровнях. Во-первых, Т-лимфоциты синтезируют цитокины, которые оказывают влияние на процессы пролиферации и дифференцировки стволовых клеток различных ростков кроветворения, в том числе и мегакариоцитарного. Во-вторых, установлено, что гомеостаз системы гемостаза на периферии поддерживается аутоантителами, образующимися против активированных факторов свертывания крови, а также синтезом ряда биологически активных веществ. В то же время доказано, что функциональная активность лимфоцитов определяется интенсивностью их метаболических процессов, причем наиболее информативными показателями внутриклеточного метаболизма являются дегидрогеназы [9]. Это позволяет использовать их в качестве показателей, характеризующих метаболическое и функциональное состояние лимфоцитов у больных острыми лейкозами в прогнозе геморрагических осложнений после химиотерапии.

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (Г6ФДГ; КФ 1.1.1.49) осуществляет дегидрирование глюкозо-6-фосфата с помощью кофермента НАДФ. Г6ФДГ катализирует инициализирующую и ключевую реакцию пентозофосфатного цикла. НАДФ-зависимая глутаматдегидрогеназа (НАДФГДГ; КФ 1.4.1.4) осуществляет восстановительное аминирование 2-оксоглутаровой кислоты, в качестве кофермента используя НАДФН.

Сущность способа заключается в исследовании активности ферментов лимфоцитов периферической крови больных острым лейкозом до проведения химиотерапии. Для этого из венозной крови больных выделяют лимфоциты, а затем с помощью биолюминесцентного метода определяют активности двух дегидрогеназ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) и НАДФ-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДФГДГ). О возможности возникновения геморрагических осложнений у больных судят по сочетанию величин активности этих дегидрогеназ в лимфоцитах крови. При сочетании активности Г6ФДГ в пределах от 10,02 до 66,51 мкЕ и НАДФГДГ в пределах от 84,27 до 257,39 мкЕ прогнозируют развитие геморрагических осложнений, а при сочетании активности Г6ФДГ в пределах от 0,01 до 4,45 мкЕ и НАДФГДГ в пределах от 0,01 до 52,86 мкЕ прогнозируют отсутствие геморрагических осложнений. Сочетание активности Г6ФДГ в пределах от 4,46 до 10,01 мкЕ и НАДФГДГ в пределах от 52,87 до 84,26 мкЕ характерно только для здоровых людей.

Способ выполняют следующим образом. У больного с диагнозом острого лейкоза, не зависимо от стадии и типа заболевания, до проведения химиотерапии забирают венозную кровь из локтевой вены свободным током в пробирки с гепарином. Выделяют лимфоциты путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина по стандартной методике А.Boyum. Подсчитывают концентрацию лимфоцитов, например, в камере Горяева. Чистота выхода лимфоцитов должна составлять не менее 97%. 1 млн выделенных клеток используют для определения активности Г6ФДГ и НАДФГДГ биолюминесцентным методом [10, 11]. Для этого суспензию выделенных лимфоцитов, содержащую клетки в концентрации 1,0 млн/мл, разрушают путем осмотического лизиса с добавлением дистиллированной воды (1:5 по объему) и 1,0-2,0 мМ дитиотреитола. Затем непосредственно определяют активность дегидрогеназ.

Для определения активности Г6ФДГ в 150 мкл инкубационной смеси, содержащей 1,5 мМ Г6Ф и 0,025 мМ НАДФ в 0,1 М трис-HCl буфере рН 9,8, вносят 50 мкл суспензии разрушенных лимфоцитов. После инкубации исследуемой пробы при 37°С в течение 30 минут к 200 мкл инкубационной смеси добавляют 50 мкл флавинмононуклеотида (ФМН) в концентрации 1,5×10^-5 M, 50 мкл 0,0005% миристинового альдегида и 10 мкл ферментативной системы НАДФН:ФМНоксидоредуктаза-люцифераза (все реактивы биолюминесцентной системы разводят в 0,1 М K⁺, Na⁺-фосфатном буфере с рН 7,0). После смешивания биолюминесцентных реактивов и инкубационной пробы с помощью биолюминометра, например, марки "БЛМ-8803" измеряют свечение.

Для определения активности НАДФГДГ в 150 мкл инкубационной смеси, содержащей 100,0 мМ 2-оксоглутарата, 0,0025 мМ НАДФН и 5,0 мМ NH₄Cl в 0,1 М K⁺, Na⁺-фосфатном буфере рН 7,4, вносят 50 мкл суспензии разрушенных лимфоцитов. После инкубации исследуемой пробы при 37°С в течение 5 минут к 200 мкл инкубационной смеси добавляют те же биолюминесцентные реактивы и в тех же дозировках, что используют для определения активности Г6ФДГ.

Учитывая, что в клетках имеется определенное количество субстратов для течения различных метаболических реакций, в том числе и катализируемыми исследуемыми НАДФ-зависимыми дегидрогеназами, определяют показатель, условно названный "фон фермента". Определение ведут в тех же условиях, что и для вышеперечисленных дегидрогеназ, но в инкубационную смесь вместо соответствующего субстрата вносят буфер. В результате измерения свечения на биолюминометре получают относительные значения активности исследуемых ферментов. Чтобы получить абсолютные значения активности, строят график зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации НАДФН (калибровочный график). Для этого 200 мкл стандартного раствора НАДФН в диапазоне 10^-9-10^-4 М вносят в кюветы биолюминометра, содержащие ФМН, миристиновый альдегид и НАДФН: ФМНоксидоредуктазу-люциферазу в концентрациях, указанных выше, после чего производят измерение интенсивности биолюминесценции. В связи с широким диапазоном рН буферов, используемых для определения активности Г6ФДГ и НАДФГДГ, а также рН-зависимостью биолюминесценции биферментной системы, калибровочные графики строят для каждого фермента отдельно. Активность НАДФ-зависимых дегидрогеназ рассчитывают по формуле:

где А - активность дегидрогеназы, Е на 10⁴ лимфоцитов (1Е=1 мкмоль/мин);

Δ[С] - для Г6ФДГ - разница концентраций НАДФН в пробах "фермент" и "фон фермента", мкмоль;

для НАДФГДГ - разница концентраций НАДФН в пробах "фон фермента" и "фермент", мкмоль;

V - объем пробы, мл;

Т - время инкубации, мин.

Данный метод апробирован на 70 больных острым миелобластным лейкозом и 65 больных острым лимфобластным лейкозом, поступивших в гематологическое отделение Краевой клинической больницы №1 г.Красноярска.

Клинический пример 1. Больная А., 63 года. Поступила на стационарное лечение в гематологическое отделение ККБ №1 с диагнозом: острый миелобластный лейкоз, 1 атака. При поступлении состояние больной средней степени тяжести, беспокоит сильная слабость, повышенная утомляемость, сонливость.

Определена активность Г6ФДГ и НАДФГДГ в лимфоцитах крови.

Г6ФДГ=47,23 мкЕ

НАДФГДГ=118,1 мкЕ

По результатам определения активности Г6ФДГ и НАДФГДГ больной угрожает развитие геморрагических осложнений после химиотерапии. Больной назначена химиотерапия по программе "7+3". Через 12 дней у больной возникло желудочное кровотечение. Состояние больной после проведенной терапии крайне тяжелое. Произведена эндоскопическая операция по остановке кровотечения и назначена симптоматическая терапия.

Клинический пример 2. Больная И., 51 год. Поступила на стационарное лечение в гематологическом отделении ККБ №1 с диагнозом: острый миелобластный лейкоз, некупируемая 1 атака, курс индукции ремиссии 2. При поступлении состояние больной средней степени тяжести, беспокоит выраженная слабость.

Определена активность Г6ФДГ и НАДФГДГ в лимфоцитах крови.

Г6ФДГ=0,01 мкЕ

НАДФГДГ=3,27 мкЕ

По результатам определения активности Г6ФДГ и НАДФГДГ больной не угрожает развитие геморрагических осложнений после химиотерапии. Больной назначен курс химиотерапии по программе "7+3". Лечение перенесла хорошо, клиническое состояние стабильно на протяжении всей терапии, осложнений во время терапии и после не наблюдалось.

Клинический пример 3. Больной Е., 37 лет. Поступил на стационарное лечение в гематологическое отделение ККБ №1 с диагнозом: острый лимфобластный лейкоз, опухолевая форма, 1 атака. При поступлении состояние больного средней степени тяжести, беспокоят увеличенные лимфатические узлы в подмышечной, паховой областях, одышка.

Определена активность Г6ФДГ и НАДФГДГ в лимфоцитах крови.

Г6ФДГ=1,7 мкЕ

НАДФГДГ=2,3 мкЕ

По результатам определения активности Г6ФДГ и НАДФГДГ больному не угрожает развитие геморрагических осложнений после химиотерапии. Больному назначаен курс химиотерапии по программе Hi-Dexa. Лечение больной перенес хорошо, осложнений во время терапии и после не было.

Клинический пример 4. Больной С., 42 лет. Поступил на стационарное лечение в гематологическое отделение ККБ №1 с диагнозом: острый лимфобластный лейкоз, опухолевая форма, 1 атака. При поступлении состояние больного средней степени тяжести, беспокоит одышка и увеличенные подмышечные, подключичные, надключичные, шейные лимфатические узлы.

Определена активность Г6ФДГ и НАДФГДГ в лимфоцитах крови.

Г6ФДГ=37,2 мкЕ

НАДФГДГ=119,4 мкЕ

По результатам определения активности Г6ФДГ и НАДФГДГ больному угрожает развитие геморрагических осложнений после химиотерапии. Больному назначен курс химиотерапии по программе Hi-Dexa. На 7 сутки у больного появились на коже "синячки", кровоточивость десен. Состояние больного после проведенного лечения тяжелое. Больному назначена симптоматическая гемостатическая терапия.

Таким образом, предложенный высокочувствительный способ позволяет повысить достоверность прогнозирования геморрагических осложнений после химиотерапии у больных острыми лейкозами. Это даст возможность своевременно, до проведения химиотерапии, откорректировать план и тактику лечения данной категории больных и улучшить результаты их реабилитации.

Источники информации

1. Rousseau A., Morcos M., Amrouche L., Fois E., Casetta A., Rio В., Le Touraeaua A., Molina T., Rabbat A., Marie J.P., Audouin J. Lethal pulmonary hemorrhage caused by a fulminant Stenotrophomonas maltophilia respiratory infection in an acute myeloid leukemia patient // Leuk. Lymphoma. - 2004. - Vol.45, №6. - P.1293-1296.

2. Andre J.M., Galambrun C., Trzeciak M.C., Dargaud Y., Kaplan-Gouet C., Jallu V., Bertrand Y. Acquired Glanzmann's thrombasthenia associated with acute lymphoblastic leukemia // J. Pediatr. Hematol. Oncol. - 2005. - Vol.27, №10. - P.554-557.

3. Fozza С., Bellizzi S., Piseddu G., Porcu A., Dore F., Longinotti M. Acquired hemophilia in a patient affected by acute myeloid leukemia // Am. J. Hematol. - 2005. - Vol.79, №1. - P.81-82.

4. Leinoe Е.В., Hoffmann M.H., Kjaersgaard E., Nielsen J.D., Bergmann O.J., Klausen T.W., Johnsen H.E. Prediction of haemorrhage in the early stage of acute myeloid leukaemia by flow cytometric analysis of platelet function // Br. J. Haematol. - 2005. - Vol.128, №4. - P.526-532.

5. Mitra A.K., Del Core M.G., Agrawal D.K. Cells, cytokines and cellular immunity in the pathogenesis of fibroproliferative vasculopathies // Can. J. Physiol. Pharmacol. - 2005. - Vol.83, №8-9. - P.701-715.

6. Wilson K.E., Li Z., Kara M. et al. Beta 1 integrin - and proteoglycan-mediated stimulation of Т lymphoma cell adhesion and mitogen-activated protein kinase signaling by thrombospondin-1 and thrombospondin-1 peptides // J. Immunol. - 1999. - Vol.163, №7. - P.3621-3628.

7. Кузник Б.И., Васильев Н.В., Цыбиков Н.Н. Иммуногенез, гемостаз и неспецифическая резистентность организма. - М.: Медицина, 1989. - 320 с.

8. Ярилин А.А. Основы иммунологии. - M.: Медицина, 1999. - 608 с.

9. Грязева Н.И., Шурлыгина А.В., Вербицкая Л.В. и др. Изменение активности лактат- и сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов крови у самцов мышей с агрессивным и субмиссивным типами поведения / Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 2000. - Т.129, №1. - С.53-55.

10. Савченко А.А., Сунцова Л.Н. Высокочувствительное определение активности дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови человека биолюминесцентным методом // Лаб. дело. - 1989. - №11. - С.23-25.

11. Савченко А.А. Биолюминесцентное определение активности НАД- и НАДФ-зависимых глутаматдегидрогеназ лимфоцитов // Лаб.дело. - 1991. - №11. - С.22-25.

Изобретение относится к области медицины, а именно к гематологии и онкологии. Сущность способа: у больных острыми лейкозами до проведения химиотерапии с помощью биолюминесцентного метода определяют активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) и НАДФ-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДФГДГ). При сочетании активности Г6ФДГ в пределах от 10,02 до 66,51 мкЕ и НАДФГДГ в пределах от 84,27 до 257,39 мкЕ прогнозируют геморрагические осложнения, а при сочетании активности Г6ФДГ в пределах от 0,01 до 4,45 мкЕ и НАДФГДГ в пределах от 0,01 до 52,86 мкЕ прогнозируют отсутствие геморрагических осложнений. Использование способа позволяет повысить точность прогноза геморрагических осложнений после химиотерапии у больных острыми лейкозами, что дает возможность своевременно скорректировать тактику лечения.

Способ прогнозирования геморрагических осложнений после химиотерапии у больных острыми лейкозами путем исследования крови до проведения химиотерапии, отличающийся тем, что с помощью биолюминесцентного метода определяют активности ферментов лимфоцитов периферической крови больных: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) и НАДФ-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДФГДГ), а о возможности возникновения геморрагических осложнений у больных судят по сочетанию показателей активности этих дегидрогеназ: при сочетании активности Г6ФДГ в пределах от 10,02 до 66,51 мкЕ и НАДФГДГ в пределах от 84,27 до 257,39 мкЕ прогнозируют геморрагические осложнения, а при сочетании активности Г6ФДГ в пределах от 0,01 до 4,45 мкЕ и НАДФГДГ в пределах от 0,01 до 52,86 мкЕ прогнозируют отсутствие геморрагических осложнений.