СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ УЧЕТА САПРОФИТНЫХ ГЕТЕРОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ В МОРСКОЙ ВОДЕ Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/01 

Изобретение относятся к микробиологии и может быть использовано при мониторинговых эколого-микробиологических исследованиях контроля качества морской воды для определения численности и видового разнообразия сапрофитных гетеротрофов. По численности гетеротрофов и их видовому разнообразию можно судить о степени органического загрязнения среды (Медицинская микробиология. М., 1999, 1183 с. С.989).

Актуальность проблемы состоит в том, что в эколого-микробиологических исследованиях для корректного определения численности гетеротрофной морской микрофлоры необходимо использовать для посева морской воды среды, максимально приближенные по своему составу к тем условиям, в которых обитают искомые сапрофитные гетеротрофные микроорганизмы. Особенно это актуально для прибрежной полосы моря, испытывающей наибольшее загрязнение органическими веществами, в том числе и биогенного происхождения (продукты распада морских животных и растений). Прибрежная полоса моря является зоной выброса большого количества морских водорослей, которые засыпаются песком во время приливно-отливных течений и подвергаются процессу гниения, продукты которого попадают в морскую воду. Микроорганизмы прибрежной зоны моря в большинстве своем постоянно питаются остатками разложившихся морских растений и за счет этого способны поддерживать свою жизнедеятельность. Если использовать не оптимальную для условий роста микроорганизмов среду, то в этом случае часть их может не вырасти на среде и не сформировать полноценные колонии, т.е. перейти в разряд так называемых «некультивируемых» форм. Это может сказаться и на учете разных видов морских бактерий, т.е. при изучении видового разнообразия сапрофитных гетеротрофных бактерий в районе исследования.

Известен способ приготовления питательной среды для выявления сапрофитных гетеротрофов, обитающих в морской воде, на основе искусственной морской воды с добавлением пептона и дрожжевого экстракта (среда для культивирования морских микроорганизмов - СММ) (г/л): MgSO₄ - 1 г, пептон - 5, дрожжевой экстракт - 5, глюкоза - 0,2, СаСО₃ - 1 г, К₂НРО₄ - 0,2 г, искусственная морская вода - 500 мл, дистиллированная вода - 500 мл, агар-агар - 15 г., рН=7,8-8,1 (Youchimizu M., Kimura Т., Fish. Pathol. 1976. Vol.10, no.2. P.243). Для приготовления искусственной морской воды используют (г/л): NaCl - 27,5; MgCl₂ - 5; MgSO₄·7H₂O - 2; CaCl₂ - 0,5; KCl - 1, FeSO₄ - 0,001.

Недостатками этой среды является трудоемкость ее приготовления, многокомпонентность и неприспособленность для роста популяций многих видов бактерий. Среда является полностью искусственной и не воспроизводит условий обитания бактерий, близких к естественным. Поскольку численность сапрофитных гетеротрофов как эколого-трофической группы зависит от условий их среды обитания, то в условиях, отличающихся от естественной их среды обитания, бактерии могут подвергаться изменчивости, плохо формировать колонии на средах, и, следовательно, результаты количественного учета гетеротрофных бактерий могут быть искажены. Кроме того, на неадаптированных средах могут расти не все виды микроорганизмов.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению является способ приготовления питательной среды для количественного учета сапрофитных гетеротрофов на основе рыбного отвара (Под редакцией Ю.А.Израэля, А.В.Цыбань. Динамика экосистем Берингова и Чукотского морей. M., 2000, 358 с. С.94). При изготовлении питательной среды в качестве источника питания используют рыбный бульон, приготовленный на морской воде из районов исследований: 0,5 кг рыбы отваривают в 1 л воды, разбавляют отвар в 10 раз той же морской водой, фильтруют, разливают с помощью автоматического дозатора по пробиркам и стерилизуют в автоклаве при давлении 1 ат (1,0·10⁵ Па) 20 мин. Данный способ имеет ряд недостатков:

- отсутствие постоянного состава питательной среды, что не позволяет обеспечить воспроизводимость результатов количественного учета сапрофитных гетеротрофов при проведении сезонных или годовых мониторинговых исследований;

- относительно высокая стоимость.

При создании изобретения - способа приготовления питательной среды для учета сапрофитных гетеротрофных бактерий в морской воде - ставилась задача повышения эффективности питательной среды для выявления сапрофитных гетеротрофных бактерий, а также увеличения точности их учета при проведении экологических мониторинговых исследований.

Решение поставленной задачи обеспечивается предлагаемым способом приготовления питательной среды для количественного и качественного учета гетеротрофных сапрофитных бактерий в морской среде, в котором используется питательная основа из продукта растительного происхождения, а именно отвар бурой водоросли ламинарии японской (далее - ламинарии японской); в качестве источника минеральных веществ используется естественная морская вода, отобранная в районе выделения сапрофитных гетеротрофных бактерий, а для обеспечения плотной основы для формирования колоний используется агар при следующем соотношении компонентов с содержанием сухих веществ, г/л:

отвар ламинарии японской 0,31-1,24 агар микробиологический 10-15 морская вода до 1 л

Применение отвара ламинарии японской обеспечивает питательной среде органическое, минеральное питание растительного происхождения.

Заросли ламинарии японской встречаются вдоль всего побережья Японского моря, что обеспечивает постоянный источник сырья одного вида.

Применение морской воды, отобранной в районе выделения сапрофитных гетеротрофных бактерий, позволяет не только получать минеральное питание, необходимое морским бактериям, но и адаптированную среду для бактерий, т.к. их численность зависит от условий среды, в которой они обитают (рН, соленость, состав минеральных и органических веществ и т.д.). Предлагаемое содержание агара позволяет получать стабильные результаты для всех вариантов испытуемой среды.

Таким образом, техническими результатами заявляемого изобретения являются повышение эффективности питательной среды для выявления видового разнообразия сапрофитных гетеротрофных бактерий и увеличение точности их учета при проведении экологических мониторинговых исследований. Сведений об известности питательной среды указанного выше состава из уровня техники не выявлено.

Существенное отличие заявляемого способа состоит в использовании доступного и более дешевого исходного компонента, а именно бурой водоросли ламинарии японской.

Способ приготовления питательной среды осуществляют следующим образом. Предварительно готовят исходные компоненты: стерильный отвар ламинарии японской и стерильную морскую воду. Для этого 100 г ламинарии японской измельчают, добавляют 500 мл кипяченой воды и кипятят в течение 3-5 минут, после чего отвар фильтруют, дважды стерилизуют текучим паром при 100°С в течение 30 мин. Отвар можно готовить впрок, хранить в холодильнике и использовать по мере необходимости. Морскую воду, отобранную в районе выделения сапрофитных гетеротрофных бактерий, стерилизуют; для этого ее фильтруют через бактериальный фильтр («Millipore») с размером пор 0,45 мкм.

Для приготовления 1 л питательной среды берут: 15-60 мл стерильного отвара ламинарии японской, что соответствует 0,31-1,24 г сухого вещества, добавляют при комнатной температуре и при перемешивании 10-15 г агара микробиологического и доводят до 1 л стерильной морской водой.

Получают не имеющую запаха питательную среду, которая слегка опалесцирует и окрашена в желтоватый цвет.

С целью определения численности гетеротрофных бактерий и видового разнообразия колоний на приготовленные среды, показанные в качестве примеров, высевали 0,1 мл морской воды (одна средняя проба для всех испытаний), взятой в определенной точке Амурского залива (район Спортивной гавани г.Владивостока) в июле 2009 г. Из представленных в таблице данных видно, что наибольшее видовое разнообразие колоний при высокой численности гетеротрофов обнаружено на среде, содержащей 0,62 г/л ламинарии японской. Экспериментально установлено, что выход за пределы заявленных значений компонентов приводит либо к перерасходу исходных компонентов и снижению численности колоний (пример 2, таблица), либо к снижению численности и видового разнообразия бактерий (пример 5, таблица).

Таким образом, использование отвара ламинарии японской позволяет получить обладающую оптимальным эффективным составом питательную среду для более полного выявления культивируемых форм сапрофитных гетеротрофных бактерий в морской воде, что подтверждается данными таблицы.

Возможность осуществления изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Приготовление питательной среды для культивирования сапрофитных гетеротрофных бактерий из морской среды, содержащей следующие компоненты с содержанием сухих веществ, г/л:

отвар ламинарии японской 0,62 агар микробиологический 10 морская вода до 1 л.

Питательную среду готовили следующим образом. Стерильный отвар ламинарии брали в количестве 30 мл, что соответствует 0,62 г сухого вещества, добавляли 10 г агара микробиологического и доводили стерильной морской водой до 1 л. Получали не имеющую запаха питательную среду, которая слегка опалесцирует и окрашена в желтоватый цвет.

На приготовленную среду высевали 0,1 мл морской воды (одна средняя проба для всех испытаний), взятой в определенной точке Амурского залива (р-н Спортивной гавани г.Владивостока) в июле 2009 г. За сутки культивирования количество выросших колоний составило (34±8)×10⁹ КОЕ/мл (колониеобразующих единиц в мл), а количество разных видов колоний на чашке составило 14±2.

Пример 2. Приготовление питательной среды с содержанием ламинарии 2,48 г/л в пересчете на сухое вещество осуществляли по примеру 1; при этом объем стерильного отвара ламинарии составил 120 мл. Количество выросших за сутки колоний сапрофитных гетеротрофов составило (4±1)×10⁸ КОЕ/мл, а общее количество разных видов колоний на чашке составило 10±1 (таблица, пример 2).

Пример 3. Приготовление питательной среды с содержанием ламинарии 1,24 г/л в пересчете на сухое вещество осуществляли по примеру 1; при этом объем стерильного отвара ламинарии составил 60 мл. Количество выросших за сутки колоний сапрофитных гетеротрофов составило (11±3)×10⁸ КОЕ/мл, а общее количество разных видов колоний на чашке составило 12±1 (таблица, пример 3).

Пример 4. Приготовление питательной среды с содержанием ламинарии 0,31 г/л в пересчете на сухое вещество осуществляли по примеру 1; при этом объем стерильного отвара ламинарии составил 15 мл. Количество выросших за сутки колоний сапрофитных гетеротрофов составило (8±2)×10⁹ КОЕ/мл, а общее количество разных видов колоний на чашке 8±1 (таблица, пример 4).

Пример 5. Приготовление питательной среды с содержанием ламинарии 0,15 г/л в пересчете на сухое вещество осуществляли по примеру 1; при этом объем стерильного отвара ламинарии составил 7,26 мл. Количество выросших за сутки колоний сапрофитных гетеротрофов составило (5±1)×10⁸ КОЕ/мл, а общее количество разных видов колоний на чашке 10±1 (таблица, пример 5).

Экспериментальные данные, приведенные в таблице, подтверждают возможность осуществления заявляемого способа. В контроле питательной средой для культивирования сапрофитных гетеротрофов служили среды для культивирования морских микроорганизмов на рыбном отваре и на искусственной морской воде.

Таблица Влияние состава питательной среды на численность и видовое разнообразие колоний гетеротрофных бактерий, выросших на среде при посеве образца морской воды Среда Отвар ламинарии, г/л, в пересчете на сухое вещество Общая численность сапрофитных гетеротрофов (КОЕ/мл) Общее количество разных видов колоний пример 1 0,62 (34±8)×10⁹ 14±2 пример 2 2,48 (4±1)×10⁸ 10±1 пример 3 1.24 (11±3)×10⁸ 12±1 пример 4 0,31 (8±2)×10⁹ 8±1 пример 5 0,15 (5±1)×10⁸ 6±1 среда на рыбном отваре (прототип)   (24±4)×10⁹ 8±1 среда на искусственной морской воде   (43±2)×10⁸ 4±2

Приведенные примеры показывают преимущество предлагаемой среды перед известными, выраженное в возможности использования недорогого сырья в качестве питательной основы; при этом ростовые свойства среды в отношении гетеротрофов не уступают контрольным средам, а количество видов микроорганизмов, выросших на этой среде, превосходит по показателям известные среды.

Кроме того, как видно из таблицы, предлагаемые пределы содержания исходных компонентов среды являются оптимальными и обуславливают относительную сбалансированность среды по питательному составу, что способствует наиболее полному выявлению видов микроорганизмов и более точному учету численности гетеротрофов в морской среде.

Дополнительными преимуществами разработанного способа являются упрощение технологии приготовления питательной среды и ее удешевление, расширение сырьевой базы, а также улучшение ее ростовых свойств в отношении количественного и качественного роста колоний сапрофитных гетеротрофных морских бактерий, обитающих в прибрежных водах.

Способ прост в осуществлении, не требует использования специального оборудования и химических реактивов.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при мониторинговых эколого-микробиологических исследованиях качества морской воды. Смешивают питательную основу среды природного морского происхождения с агаром микробиологическим и стерильной морской водой, отобранной в районе выделения сапрофитных гетеротрофных бактерий. Предварительно готовят питательную основу - стерильный отвар морской водоросли ламинарии японской. Измельчают 100 г ламинарии японской, добавляют 500 мл кипяченой воды и кипятят в течение 3-5 мин. Отвар фильтруют и дважды стерилизуют текучим паром при 100°С в течение 30 минут. Для приготовления 1 л питательной среды исходные компоненты берут при следующем содержании сухих веществ, г/л: отвар ламинарии японской 0,31-1,24, агар микробиологический 10-15, морская вода до 1 л. Изобретение обеспечивает повышение эффективности питательной среды и упрощение способа ее получения. 1 табл.

Способ приготовления питательной среды для учета сапрофитных гетеротрофных бактерий в морской воде, включающий смешивание питательной основы среды морского природного происхождения с агаром микробиологическим и стерильной морской водой, отобранной в районе выделения сапрофитных гетеротрофных бактерий, отличающийся тем, что в качестве питательной основы среды природного происхождения используют стерильный отвар морской водоросли ламинарии японской, который предварительно готовят - измельчают 100 г ламинарии японской, добавляют 500 мл кипяченой воды и кипятят в течение 3-5 мин, после чего фильтруют отвар и дважды стерилизуют текучим паром при 100°С в течение 30 мин, при этом для приготовления 1 л питательной среды исходные компоненты берут при следующем содержании сухих веществ, г/л:
отвар ламинарии японской 0,31-1,24 агар микробиологический 10-15 морская вода до 1 л