ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО УЧЕТА ИЕРСИНИЙ И ЛИСТЕРИЙ В ОБЪЕКТАХ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ Российский патент 2001 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к биологическому контролю за инфицированностью почв и овощей.

Известно, что листерии и иерсинии относятся к возбудителям сапрозоонозов и способны обитать как в объекте окружающей среды, так и в теплокровном организме человека и животных. Для индикации возбудителей из материала от теплокровных животных и человека традиционно используются среды на основе мясных и рыбных гидролизатов. Для выделения иерсиний и листерий из объектов окружающей среды, т.е. внеорганизменной популяции бактерий, предпочтительно применять предлагаемые среды на основе растительного сырья, особенно овощей, т.к. известно, что именно овощи являются одним из основных факторов передачи этих возбудителей.

Известна питательная среда, которая является основой для культивирования иерсиний и листерий - среда Хоттингера (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под редакцией Биргера М.О., Москва, 1967, с. 53-54). Среду готовят из мяса, которое варят, затем к нему добавляют либо свежую перемолотую поджелудочную железу, либо сухой панкреатин, перемешивают, доводят до pH 7,8 - 8,0. Добавляют хлороформ и оставляют смесь для переваривания на 7-16 дней.

Недостатками этой среды являются:
- использование дорогостоящих пищевых продуктов;
- трудоемкость и длительность изготовления питательной среды;
- неполное выявление и учет внеорганизменных популяций из объектов окружающей среды, в частности смывов с овощей.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению является питательная среда СО (Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской биотехнологии. Тех. конф. 4.1. Махачкала, 1988, с. 108-109), применяемая для культивирования иерсиний, в частности Y. pestis. Питательная среда содержит автолизат селезенки, гидролизат белка пшеничных отрубей, натрий хлористый, натрий сернокислый, агар японский пластинчатый или корсаковский, воду дистиллированную.

Недостатком этой среды является неадаптированность к росту внеорганизменных популяций бактерий из смывов с овощей, хотя в качестве питательной основы здесь используют продукт растительного происхождения - отруби пшеничные, однако их применяют в виде гидролизата и в сочетании с продуктами животного происхождения - автолизата селезенки. В результате этого среда является трудоемкой, дорогостоящей и не приспособленной для роста внеорганизменных популяций бактерий, так как длительно существующие в окружающей среде патогенные бактерии могут подвергаться изменчивости, плохо формировать колонии на средах, содержащих продукты животного происхождения.

Задача, решаемая изобретением, - получение эффективной питательной среды для более полного выявления внеорганизменных популяций бактерий, в частности листерий и иерсиний, обсеменяющих овощи, за счет применения продуктов растительного происхождения, а также расширение сырьевой базы и удешевление среды.

Достигается это тем, что в качестве питательной основы используют продукты растительного происхождения - отвары отрубей ржаных, капусты и моркови, в качестве минеральных веществ - соли фосфатного буфера.

Компоненты среды взяты в следующем соотношения с содержанием сухих веществ, г/л:
отвар отрубей ржаных - 0,065 - 0,26
отвар моркови - 0,08 - 0,32
отвар капусты - 0,14 - 0,42
агар микробиологический - 10 - 15
буфер фосфатный рН 7,4 - до 1 л
Существенными признаками предложения следует считать качественный и количественный состав питательных сред, позволяющий получить среду для более полного выявления внеорганизменных популяций бактерий листерий и иерсиний. Выход за пределы заявленных значений компонентов приводит либо к перерасходу продукции, либо к снижению ростовых свойств среды.

Применение отваров отрубей ржаных, капусты и моркови обеспечивает питательной среде органическое, минеральное питание, определенный набор витаминов. Кроме того, морковь обладает антиоксидантными свойствами в отношении вредных метаболитов культивируемых бактерий.

Применение фосфатного буфера в данном количестве и составе позволяет получить бактериям необходимое минеральное питание, особенно фосфор, а также буфер фосфатный стабилизирует растительную среду, поддерживая значение pH постоянным 7,4.

Применение агара микробиологического обеспечивает плотную основу для формирования колоний.

Для приготовления 1 л питательной среды сначала готовят маточные отвары из отрубей ржаных, капусты и моркови. Для этого берут по 30 г моркови и капусты, измельчают. В отдельных емкостях по 30 г отрубей ржаных, моркови и капусты заливают 100 г кипяченой воды, кипятят в течение 3-5 мин, отвары фильтруют, стерилизуют текучим паром дважды при 100^oC по 30 мин. Отвары можно готовить впрок, хранить в холодильнике, использовать по мере необходимости. Готовят буфер фосфатный на основе стерильной воды pH 7,4. Для приготовления фосфатного буфера берут натрий фосфорнокислый двузамещенный - 8,7 г/л, калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,7 г/л, до 1 л - дистиллированная вода, устанавливают pH 7,4, стерилизуют 0,5 атм 30 мин.

Для приготовления 1 л питательной среды берут: 5-20 мл отвара отрубей ржаных, что соответствует 0,065 - 0,26 г сухого вещества, 5-20 мл отвара моркови, что соответствует 0,08 - 0,32 г сухого вещества, 10-30 мл отвара капусты, что соответствует 0,14 - 0,42 г сухого вещества:
- 5-20 мл отвара отрубей ржаных;
- 10-30 мл отвара капусты;
- 5-20 мл отвара моркови;
- 10-15 г агара микробиологического;
- до 1 л буфер фосфатный pH 7,4.

Пример 1.

Питательная среда для культивирования внеорганизменных популяций сапрозоонозов, в частности листерий и иерсиний из внешней среды, в частности, смывов с овощей, включает в себя следующие компоненты с содержанием сухих веществ, г/л:
отвар отрубей ржаных - 0,13
отвар моркови - 0,16
отвар капусты - 0,28
агар микробиологический - 10
буфер фосфатный pH 7,4 - до 1 л
Питательную среду готовят следующим образом. Стерильные отвары овощей берут в следующих соотношениях: 10 мл отвара отрубей ржаных, что соответствует 0,13 г сухого вещества, 10 мл отвара моркови, что соответствует 0,16 г сухого вещества, 20 мл отвара капусты, что соответствует 0,28 г сухого вещества, смешивают, добавляют 10 г агара микробиологического и доводят стерильным буфером фосфатным до 1 л (установл. pH 7,4). На приготовленную среду высевают листерии и иерсинии в физиологическом р-ре в количестве 10² КОЕ/мл.

Полученная питательная среда слегка опалесцирует, желтоватого цвета, не имеет запаха, pH среды 7,4.

За сутки культивирования количество колоний листерий составило 390 ± 49, иерсиний - 480 ± 64.

Пример 2.

Питательная среда для культивирования внеорганизменных популяций сапрозоонозов, в частности листерий и иерсиний, включает в себя следующие компоненты с содержанием сухих веществ, г/л:
отвар отрубей ржаных - 0,26
отвар моркови - 0,42
отвар капусты - 0,32
агар микробиологический - 15
буфер фосфатный pH 7,4 - до 1 л
Питательную среду готовят следующим образом. Стерильные отвары овощей берут в следующих соотношениях: 20 мл отвара отрубей, что соответствует 0,26 г сухого вещества, 30 мл отвара капусты, что соответствует 0,42 г сухого вещества, 20 мл отвара моркови, что соответствует 0,32 г сухого вещества, смешивают, добавляют 15 г агара и остальное фосфатный буфер до 1 л, устанавливают pH 7,4.

Полученная питательная среда слегка опалесцирует, желтоватого цвета, не имеет запаха, pH среды 7,4. За сутки культивирования количество листерий составляет 39 ± 9, иерсиний - 56 ± 10.

Пример 3.

Питательная среда для культивирования возбудителей сапрозоонозов, в частности листерий и иерсиний, включает в себя следующие компоненты с содержанием сухих веществ, г/л:
отвар отрубей ржаных - 0,065
отвар моркови - 0,08
отвар капусты - 0,14
агар микробиологический - 10
буфер фосфатный pH 7,4 - до 1 л
Питательную среду готовили следующим образом.

Стерильные отвары овощей берут в следующих соотношения - 5 мл отвара отрубей, что соответствует 0,065 г сухого вещества, 5 мл отвара моркови, что соответствует 0,08 г сухого вещества, 10 мл отвара капусты, что соответствует 0,14 г сухого вещества. Смешивают, добавляют 10 г агара и остальное - фосфатный буфер до 1 л, устанавливают pH 7,4.

Полученная питательная среда слегка опалесцирует, желтоватого цвета, не имеет запаха, pH среды 7,4. За сутки культивирования количество листерий составило 300 ± 29, иерсиний - 245 ± 38.

Данные по всем примерам представлены в таблице. В контроле питательной средой для культивирования листерий и иерсиний, в частности, служили среды Хоттингера и СО.

Приведенные примеры показывают преимущества предлагаемой среды перед известной, выраженные в возможности использования недорогих растительных продуктов в качестве питательной основы, при этом ростовые свойства среды в отношении листерий и иерсиний не уступают контрольным средам, а технология приготовления значительно проще. Это позволяет расширить сырьевую базу и удешевить получаемую питательную среду.

Кроме того, как видно из таблицы, предлагаемые пределы содержания являются оптимальными и обуславливают относительную сбалансированность среды по питательному составу, что способствует наиболее полному выявлению и более точному учету иерсиний и листерий из объектов внешней среды, в частности смывов с овощей.

Изобретение предназначено для биологического контроля за инфицированностью почв и овощей. Среда содержит питательную основу, минеральные соли и агар. В качестве питательной основы среда содержит продукты растительного происхождения - отвары отрубей ржаных, капусты и моркови. В качестве минеральных солей - соли фосфатного буфера с pH 7,4. Изобретение позволит более полно выявить листерий и иерсиний из объектов внешней среды. 1 табл.

Питательная среда для культивирования и количественного учета листерий и иерсиний в объектах внешней среды, содержащая питательную основу - продукт растительного происхождения, минеральные соли, агар, воду, отличающаяся тем, что в качестве продукта растительного происхождения используют отвары отрубей ржаных, капусты и моркови, в качестве источника минеральных солей - фосфатный буфер с рН = 7,4 при следующем соотношении компонентов с содержанием сухих веществ, г/л:
Отвар отрубей ржаных - 0,065 - 0,26
Отвар моркови - 0,08 - 0,32
Отвар капусты - 0,14 - 0,42
Агар микробиологический - 10 - 15
Буфер фосфатный рН 7,4 - До 1 л