СПОСОБ ПОСЕВА ОБРАЗЦОВ ПОЧВ ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ Российский патент 2023 года по МПК G01N1/38 G01N1/28 C12Q1/24 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к биологии, а именно к микробиологии, и может быть использовано для посева образцов почв для микробиологического исследования и оценки видового разнообразия почвенной микробиоты культуромным методом.

Уровень техники

Известен способ посева образцов почв для микробиологического анализа, включающий учет общей численности сапрофитных микроорганизмов, диспергирование и десорбцию клеток с поверхности почвенных частиц; метод глубинного посева, при котором 1 см³ посевного материала вносят на дно чашки Петри; способ, включающий внесение точно измеренного объема посевного материала (0,02–0,1 мл) и последующее распределение материала по поверхности среды с помощью стерильного стеклянного шпателя Дригальского.

Известен способ посева образцов почв для микробиологического анализа, основанный на диспергировании и десорбции клеток с поверхности почвенных частиц. Затем готовят первое разведение 1:10, т.е. 10^-1 почвы на стерильной водопроводной воде, и почвенная суспензия охлаждается при температуре (5 - 7) °C в течение 20 - 30 мин, затем производят раститровку суспензии обычным способом. Из каждого разведения делают посев не менее двух объемов по 0,1 или 0,2 см³ на поверхность питательного агара, разлитого в стерильные чашки Петри, и равномерно шпателем растирают по всей поверхности чашки. (МУК 4.2.3695-21)

Недостатками данного метода являются гибель облигатно анаэробной и микроаэрофильной микрофлоры вследствие контакта материала с атмосферным кислородом, снижение видового разнообразия микроорганизмов вследствие подготовки проб в ходе нескольких этапов разведения, негативное влиянии растворов для разведения на ростовые свойства микроорганизмов.

Известен способ посева проб почв, в ходе которого по 1 см3 исследуемого материала из подготовленных разведений параллельно вносят в две чашки Петри для каждого разведения, слегка приоткрыв крышку чашки Петри и внеся посевной материал на дно чашки. Не позже чем через 15 мин после внесения материала его заливают 15 - 20 см³ предварительно расплавленной и охлажденной до температуры (45 +/- 1) °C агаризованной почвенной среды. Чашки с посевами, залитыми питательной средой, осторожно вращают для равномерного распределения посевного материала по питательной среде и оставляют на горизонтальной поверхности до ее полного застывания. (МУК 4.2.3695-21)

Недостатками данного метода являются трудоемкость проведения исследования, отсутствие возможности выделения чистых культур микроорганизмов для их идентификации.

Известен способ посева, при котором для получения исходного разведения образца 10 (или 1) г почвы помещают во флакон с 90 (или 100) мл стерильной воды. В первом случае в качестве исходного будет получено десятикратное разведение почвенного образца или 1:10, т.е. первое разведение. Во втором случае будет получено разведение почвы 1:100 или 1 : 10^–2 , т.е. второе разведение. Как правило, на практике чаще всего готовят сразу второе разведение, однако в случае заведомо известной низкой чис ленности микроорганизмов в почве, грунте (или каком-либо другом природном субстрате) готовят первое разведение.

Разведения готовят в стерильной водопроводной воде или физио-логическом растворе (0,85%-й раствор NaCl), используя постоянный коэффициент разведения (чаще всего 10). Разведения осуществляют в ряде стерильных пробирок, содержащих по 9 мл стерильной воды. Колбу с суспензией после встряхивания оставляют на 30 секунд для оседания крупных частиц.

Затем проводят ресуспензирование почвенных проб и последующий забор точно измеренного объема (0,02–0,1 мл) соответствующего разведения. Далее раскапывают на поверхность предварительно разлитой в чашки Петри агаризованной питательной среды. Стерильным стеклянным шпателем Дригальского без нажима плавными круговыми движениями каплю воды равномерно быстро и тщательно распределяют по поверхности среды, постепенно втирая ее в агаровую пластинку. Растирание продолжают до тех пор, пока шпатель не перестанет свободно скользить по поверхности среды и появится легкое трение, что свидетельствует о втирании всего объема жидкости в среду. Посев из каждого разведения проводят на 3–5 параллельных чашек Петри. (Терещенко Н.Н., Акимова Е.Е., Минаева О.М.Т35 Современные методы оценки микробиологических свойстви экологического статуса почвы : практикум. – Томск : Издательскийдом ТГУ, 2017. – 152 с.)

Недостатками данного метода являются гибель облигатно анаэробной и микроаэрофильной микрофлоры вследствие контакта материала с атмосферным кислородом, снижение видового разнообразия микроорганизмов вследствие подготовки проб в ходе нескольких этапов разведения, негативное влиянии растворов для разведения на ростовые свойства микроорганизмов. Данный способ принимается за прототип.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является улучшение качества выделения микроорганизмов из образцов почвы, при проведении микробиологического исследования путем посева 10 мкл взвеси, полученной путем суспензирования 1 грамма образца почвы в 9 мл жидкой тиогликолевой среды с 10% содержанием глицерина без дополнительных разведений.. Технический результат изобретения заключается в том, что заявленный способ посева материала позволяет повысить вероятность выделения микроорганизмов из различных групп по типу дыхания: аэробные, микроаэрофильные и облигатно анаэробные.

Это достигается тем, что в отличие от известных способов посева образцов почв с помощью растирания нанесенных объемов взвеси образцов полученных в результате последовательных водных разведений суспензий почвы на поверхности плотных питательных сред с помощью шпателя Дригальского, в предлагаемом способе производится посев 10 мкл взвеси, полученной путем суспензирования 1 грамма образца почвы в 9 мл жидкой тиогликолевой среды с 10% содержанием глицерина без дополнительных разведений.

Осуществление изобретения

Сущность предложенного способа заключается в следующем: 10 мкл взвеси, полученной путем суспензирования 1 грамма образца почвы в 9 мл жидкой тиогликолевой среды с 10% содержанием глицерина, наносят на поверхность плотных питательных сред с последующим растиранием нанесенной капли по всей поверхности плотной питательной среды с помощью стерильного шпателя Дригальского.

Предлагаемый способ позволяет получать более точные качественные и количественные характеристики состояния микробиоты почв при проведении микробиологического метода исследования.

Это может быть необходимо для проведения регулярного микробиологического мониторинга почв и выделения различных групп микроорганизмов.

В предложенном способе посева образцов почв для микробиологического исследования предусмотрены следующие отличия: внесение стандартизированного объема суспензии образца почвы в транспортной среде на плотные питательные среды без разведения, что позволяет сохранить жизнеспособность большего количества микроорганизмов, зависящих от внешних условий, в том числе микроаэрофильных и анаэробных микроорганизмов, а также микроорганизмов, жизнеспособность которых зависит от осмотического давления, также данный способ подходит для выделения микроорганизмов, имеющих медицинское, ветеринарное и сельскохозяйственное значение, в том числе для выделения патогенных микроорганизмов.

Предлагаемый нами способ был апробирован на 10 образцах почв собранных на территории Самарской области. В результате проведенного исследования были получены результаты, представленные в Таблице 1 и Таблице 2.

Таблица 1. Сравнение результатов видовой идентификации при посеве 10 мкл взвеси в сравнении с прототипом

Номер пробы Количество видов микроорганизмов предлагаемым способом, выросших в следующих условиях при посеве 10 мкл Количество видов микроорганизмов в соответствии с МУК 4.2.3695-21, выросших в следующих условиях Аэробные Микроаэрофильные Анаэробные Аэробные Микроаэрофильные Анаэробные 1 12 24 16 12 9 4 2 12 27 12 7 7 5 3 15 19 13 7 9 9 4 14 23 15 10 11 6 5 11 21 19 8 9 6 6 13 15 17 8 12 5 7 12 26 14 11 13 7 8 10 24 10 13 11 9 9 13 25 18 11 14 8 10 15 25 16 13 8 4

Таблица 2. Сравнение результатов видовой идентификации при посеве 25 мкл взвеси в сравнении с прототипом

Номер пробы Количество видов микроорганизмов предлагаемым способом, выросших в следующих условиях при посеве 25 мкл Количество видов микроорганизмов в соответствии с МУК 4.2.3695-21, выросших в следующих условиях Аэробные Микроаэрофильные Анаэробные Аэробные Микроаэрофильные Анаэробные 1 12 16 2 12 9 4 2 10 17 3 7 7 5 3 17 17 3 7 9 9 4 11 14 5 10 11 6 5 12 15 6 8 9 6 6 14 18 4 8 12 5 7 9 12 3 11 13 7 8 10 14 2 13 11 9 9 8 11 4 11 14 8 10 11 14 3 13 8 4

Меньшее количество видов микроорганизмов при посеве объема суспензии 25 мкл обусловлено более высокой концентрацией бактерий в образце, что влияет на взаимное антагонистическое воздействие штаммов при совместном культивировании.

Из представленной таблицы видно, что использование предлагаемого нами способа повышает вероятность выявления более широкого перечня микроорганизмов, растущих в микроаэрофильных и облигатно анаэробных условиях из образцов почв, что способствует улучшению качества проведения культуромных исследований для оценки микробиоты почв.

Таким образом, использование предлагаемого нами способа посева образцов почв для микробиологического исследования позволяет повысить вероятность выявления значительного числа микроорганизмов.

Изобретение относится к микробиологии. Раскрыт способ посева образцов почв для микробиологического исследования, в котором 10 мкл взвеси, полученной путем суспензирования одного грамма образца почвы в 9 мл жидкой тиогликолевой среды с 10%-ным содержанием глицерина без дополнительных разведений, наносят на поверхность плотных питательных сред с последующим растиранием нанесенной капли по всей поверхности плотной питательной среды с помощью стерильного шпателя Дригальского. Изобретение позволяет повысить вероятность выделения микроорганизмов из различных групп по типу дыхания: аэробные, микроаэрофильные и облигатно анаэробные. 2 табл.

Способ посева образцов почв для микробиологического исследования, отличающийся тем, что 10 мкл взвеси, полученной путем суспензирования одного грамма образца почвы в 9 мл жидкой тиогликолевой среды с 10%-ным содержанием глицерина без дополнительных разведений, наносят на поверхность плотных питательных сред с последующим растиранием нанесенной капли по всей поверхности плотной питательной среды с помощью стерильного шпателя Дригальского.