ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ БАКТЕРИЙ Российский патент 2009 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Предлагаемое изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для выделения биолюминесцентных бактерий из морской воды.

Известны питательные среды для выращивания штамма люминесцентных бактерий Photobacterium leiognathi (1). Люминесцентные бактерии Photobacterium leiognathi выращивали:

в среде Егоровой: NaCl 30,0 г; КН₂РО₄ 1,0 г; MgSO₄ 0,5 г; пептон 10,0 г; рыбная вытяжка 0,5 л; агар-агар 18,0 г; водопроводная вода 0,5 л; рН 7,4 (устанавливают 40%-ным NaOH);

в полусинтетической среде (г на 1 л дистиллированной воды): NaCl 30,0; КН₂РО₄ 1,0; Na₂HPO₄·12H₂O 10,0; MgSO₄·7H₂O 0,2; (NH₄)₂HPO₄ 0,5; пептон Chemapol 5,0 (пептон Difco 10,0); глицерин 3 мл; агар-агар 20,0; РН 7,0;

в минимальной среде (г на л дистиллированной воды): NaCl 30,0; КН₂РО₄ 1,0; Na₂HPO₄·12H₂O 10,0; MgSO₄·7H₂O 0,2; (NH₄)₂HPO₄ 0,5; глицерин 3 мл или глюкоза 4 г; рН 7,0.

Недостатком известных питательных сред является сложность их состава и относительно высокая стоимость.

Известна питательная среда для культивирования светящихся бактерий (2), включающая NaCl 30,0 г; пептон 20,0 г; глицерин 2,0 г; агар 20,0 г; водопроводную воду до 1 л; рН 7,2-7,4.

Недостатком известной питательной среды является относительная дороговизна составляющих компонентов (пептон, глицерин). При этом производительность выделения биолюминесцентных бактерий из морской воды с использованием данной среды невысока.

Наиболее близкой к предложенной среде является, выбранная в качестве прототипа, питательная среда для культивирования биолюминесцентных бактерий (3), содержащая следующие компоненты: пептон - 5 г, агар-агар - 15 г, вода морская - до 1 л, рН среды 7,2.

Эту питательную среду готовят в основном из искусственной морской воды, и выход выращенных на ней биолюминесцентных бактерий невысок. При этом один из компонентов этой среды пептон относительно дорогой.

Задачей предлагаемого изобретения является повышение выхода биолюминесцентных бактерий.

Указанная задача достигается тем, что в питательной среде для выращивания биолюминесцентных бактерий, содержащей морскую воду, питательную основу, согласно изобретению используют морскую воду, отобранную в районе выделения биолюминесцентных бактерий, а в качестве питательной основы выбирают сухой питательный агар, при следующих соотношениях компонентов в г/л:

сухой питательный агар - 34,0-36,0 морская вода до 1 л рН 7,2-7,4

В предложенной питательной среде, благодаря использованию морской воды, отобранной в районе предполагаемого выделения биолюминесцентных бактерий, и, соответственно, имеющей компоненты, оптимальные для роста этих бактерий, достигается выделение их максимального количества. При этом предлагаемая среда недорогая и очень простая по приготовлению и составу.

В результате проведенного анализа уровня техники не обнаружен аналог, характеризующийся признаками, тождественными всем существенным признакам заявленного изобретения, а определение прототипа из выявленных аналогов позволило выявить совокупность существенных по отношению к техническому результату отличительных признаков.

Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию "новизна".

При дополнительном поиске других решений, относящихся к питательным средам, указанных отличительных признаков не обнаружено, таким образом, заявленное изобретение соответствует условию "изобретательский уровень".

Пример 1. Готовили контрольную питательную среду следующего состава (в г):

пептон - 5,0

агар-агар - 15,0

вода морская - до 1 л.

Для изготовления использовалась искусственная морская вода.

Питательную среду стерилизовали при 111°С в течение 20 мин; рН среды после стерилизации 7,2.

Проводили концентрирование бактерий из воды Черного и Азовского морей методом мембранных фильтров и выращивали их в чашках Петри на приготовленной питательной среде при комнатной температуре в течение 24 часов. Присутствие колоний биолюминесцентных бактерий определяли, визуально анализируя наличие биолюминесценции, и производили их подсчет. Полученные данные приведены в таблице 1.

Пример 2. Готовили питательную среду на основе воды, отобранной в районе Черного моря, где предполагалось проводить выделение бактерий. Для питательной основы использовали сухой питательный агар (4) (ФС 42 - 188 ВС-88) производства ФГУП «НПО «МИКРОГЕН» МЗ РФ.

В питательный агар добавляли морскую воду до 1 л, отобранную в районе Черного моря, где предполагалось проводить выделение бактерий. Затем кипятили 1-2 мин до полного расплавления агара. Профильтровали через ватно-марлевый фильтр, разлили в стерильные емкости. Приготовленную питательную среду стерилизовали при температуре 121°С в течение 15 мин; рН среды после стерилизации 7,3. В чашки Петри среду разлили слоем 3-0,1575 дюйма. Готовая среда в чашках Петри прозрачная, желтого цвета. Проводили концентрирование бактерий из воды Черного моря методом мембранных фильтров и выращивали их в чашках Петри на приготовленной питательной среде при комнатной температуре в течение 24 часов. Присутствие колоний биолюминесцентных бактерий определяли, визуально анализируя наличие биолюминесценции, и производили их подсчет. Полученные данные приведены в таблице 1.

Пример 3. Проводили концентрирование бактерий из воды Азовского моря методом мембранных фильтров и выращивали их в чашках Петри на питательной среде, приготовленной в примере 2, при комнатной температуре в течение 24 часов. Присутствие колоний биолюминесцентных бактерий определяли, визуально анализируя наличие биолюминесценции, и производили их подсчет. Полученные данные приведены в таблице 1.

Пример 4. Готовили питательную среду из сухого питательного агара (4) (ФС 42-188 ВС-88) производства ФГУП «НПО «МИКРОГЕН» МЗ РФ. В нее добавляли морскую воду до 1 л. Приготовление проводили, как в примере 2, но на основе воды, отобранной в районе Азовского моря, где предполагалось проводить выделение бактерий.

Проводили концентрирование бактерий из этого района Азовского моря методом мембранных фильтров и выращивали их в чашках Петри на приготовленной питательной среде при комнатной температуре в течение 24 часов. Присутствие колоний биолюминесцентных бактерий определяли, визуально анализируя наличие биолюминесценции, и производили их подсчет.

Полученные данные приведены в таблице 1.

Пример 5. Проводили концентрирование бактерий из воды Черного моря методом мембранных фильтров и выращивали их в чашках Петри на питательной среде, приготовленной в примере 4, при комнатной температуре в течение 24 часов. Присутствие колоний биолюминесцентных бактерий определяли, визуально анализируя наличие биолюминесценции, и производили их подсчет. Полученные данные приведены в таблице 1.

Таблица 1 Пример Питательная среда Выход колоний биолюминесцентных бактерий, выделенных из морской среды Черного моря Азовского моря 1 Контрольная 4-5 2-3 2 На основе воды Черного моря 9-12   3 -′′-   2-3 4 На основе воды Азовского моря   7-10 5 -′′- 2-3  

В таблице 1 показано, что на контрольной среде количество колоний биолюминесцентных бактерий, выросших после фильтрации воды из Черного и Азовского морей, составило 4-5 и 2-3 соответственно. На среде (пример 2), приготовленной на основе воды из Черного моря, выросло 9-12 колоний биолюминесцентных бактерий, выделенных из Черного моря, и 2-3 колонии, выделенные из Азовского моря (пример 3). На среде, приготовленной на основе воды, отобранной в Азовском море, выросло 7-10 колоний биолюминесцентных бактерий, выделенных из Азовского моря (пример 4), и 2-3 колонии, выделенные из Черного моря (пример 5).

Таким образом, количество биолюминесцентных бактерий, выросших на средах, приготовленных на основе морской воды, отобранной в местах, где проводилось их выделение, в 2,7-3,5 раза превышает их количество, выросшее в известной питательной среде. Особенно это важно для морей, например Азовского моря, для солености которых характерна существенная временная и пространственная изменчивость.

Исследования показали, что приготовление питательной среды на морской воде, отобранной в районе выделения биолюминесцентных бактерий, способствует созданию оптимальных условий для развития аборигенных биолюминесцентных бактерий, повышению их выживаемости и соответственно увеличению количества выделенных колоний бактерий.

Источники информации

1. Авт. свид. № 1484829, МКИ С12N 1/20.

2. Кн. «Методы водной микробиологии». Изд-во «Наука», Ленинград, 1965, стр.297-298.

3. Морской экологичный журнал, Т.3, № 3, 2004, с.49-53, Иваницына В.А, Бухтияров А.Е. «Таксономический состав гетеротрофных бактерий Одесского побережья, устойчивых к тяжелым металлам», прототип.

4. Справочник по микробиологическим питательным средам. Под редакцией Меджидова М.М. Дагестанское книжное издательство, Махачкала, 1989, с.15.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выделения биолюминесцентных бактерий, из морской воды. Питательная среда содержит морскую воду, отобранную в районе выделения биолюминесцентных бактерий, и сухой питательный агар. рН среды 7,2-7,4. Изобретение позволяет повысить выход биолюминесцентных бактерий. 1 табл.

Питательная среда для выращивания биолюминесцентных бактерий, включающая морскую воду, питательную основу, отличающаяся тем, что используют морскую воду, отобранную в районе выделения биолюминесцентных бактерий, а в качестве питательной основы выбирают сухой питательный агар при следующих соотношениях компонентов, г/л:
сухой питательный агар 34,0-36,0 морская вода до 1 л рН 7,2-7,4