ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛАКТОБАКТЕРИЙ Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 C12R1/225 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при изучении микрофлоры животных, а также бактериологической диагностике дисбактериоза кишечника.

Микрофлора закрытых полостей человека и животных представлена различными видами бактерий, выделение и идентификация которых является сложной, рутинной работой, и чтобы значительно сократить время исследований используются селективные среды.

Для выделения лактобактерий - основных представителей симбионтной микрофлоры предложен ряд питательных сред.

Известна питательная среда для выделения молочнокислых бактерий (Абросимова Н.А., Кушнарева М.В. Питательная среда для выделения молочно-кислых бактерий // Лабораторное дело, 1991, №3, С.78-79) в состав которой входят, г/л:

Сухая питательная среда   для контроля стерильности 33,0 Пептон 20,0 Агар КД 30,0 Глюкоза 18,0 Цитрат аммония 2,0 Калия дигидрофосфат 6,0 Ледяная уксусная кислота 1,32 Раствор солей 5,0 Вода дистиллированная до 1 л

Раствор солей состоит из, масс.%:

Сульфат магния 7-водный 11,5 Сульфат марганца 4-водный 2,86 Сульфат железа (2) 7-водный 0,68 Дистиллированная вода остальное

На данной среде хорошо растут различные молочнокислые бактерии, она обладает селективными свойствами, но ее недостатком является многокомпонентность и труднодоступность ряда ингредиентов.

Известна питательная среда для выделения лактобактерий (Пат. РФ №2202609), которая содержит, г/л:

Сернокислый марганец 0,049-0,05 Сернокислый магний 0,19-0,20 L-цистеин солянокислый 0,095-0,10 Калий фосфорнокислый 2-замещенный 1,95-2,0 Пептон 4,9-5,0 Глюкоза 19,8-20,0 Агар-агар 14,9-15,1 Стерильный мел 9,9-10,0 Гидролизат молозивной   казеино-сывороточной массы остальное

На данной среде хорошо растут лактобактерии, индикация колоний которых осуществляется по расплавлению мела под колонией. Однако эта среда не обладает селективными свойствами, и на ней могут расти любые бактерии, в.ч. кишечная палочка или энтерококки, которые также могут вырабатывать кислоты и обесцвечивать среду под колониями. Она не прозрачная, что затрудняет описание выросших колоний. Кроме того, не всем лабораториям доступен гидролизат молозивной казеино-сывороточной массы.

Известна среда для выделения лактобактерий (Пат. РФ №2213779), состав которой представлен в следующем виде, г/л:

Панкреатический гидролизат казеина сухой 15-30 Экстракт кормовых дрожжей сухой 3-7 Глюкоза 17-25 Цистеин 0,1-0,3 Железо сернокислое 7-водное 0,03-0,06 Магний сернокислый 7-водный 0,6-1,0 Цитрат аммония 1,5-3,5 Калий фосфорнокислый 1-замещенный 4,0-8,0 Натрий лимоннокислый 3-замещенный 6,0-8,5 Натрий уксуснокислый плавленый 7,0-8,0 Агар микробиологический 7-12,0 Поваренная соль 3,0-8,0 Кристалвиолет 0,002-0,0025 Полимиксин М сульфат 0,04-0,06 Вода дистиллированная остальное

Среда обладает выраженной селективностью, готовится без стерилизации. Однако она имеет фиолетовую окраску, что затрудняет исследование колоний в проходящем свете, ряд компонентов дорогостоящ и труднодоступен.

Известна простая, легко воспроизводимая питательная среда для выделения молочнокислых бактерий (Квасников Е.И., Нестеренко О.А. Молочнокислые бактерии и пути их использования. - М.: Наука, 1975. - С.60-61, прототип). Данная среда состоит из, масс.%:

Растительный отвар (капуста) 10,0 Пептон 1,0 Глюкоза 2,0 Этиловый спирт 8-16 Агар 2,0 Дистиллированная вода остальное

Недостатком данной среды является слабые ростовые и селективные свойства, в результате чего на ней в равной степени растут бактерии других родов, которые могут подавлять рост молочнокислых бактерий, особенно при их низкой концентрации в исследуемом материале.

Задачей предлагаемого изобретения является получение простой в приготовлении и экономичной питательной среды для выделения молочнокислых бактерий из фекалий животных.

Поставленная задача достигается тем, что предложена питательная среда для выделения лактобактерий, включающая капустный отвар, глюкозу, агар, отличающаяся тем, что в качестве дополнительных источников питания и селективности содержит молочную сыворотку, дрожжевой аутолизат и уксусную кислоту при следующем соотношении компонентов, масс.%:

Молочная сыворотка 9-10,0 Дрожжевой аутолизат 9-10,0 Глюкоза 1,9-2,0 Уксусная кислота 70% 0,14-0,16 Агар 1,8-2,0 Капустный отвар остальное

Молочную сыворотку получали в условиях лаборатории, для чего в 1 л подогретого до 60-70°C молока с жирностью 2,5% при постоянном помешивании добавляли 2,5-3 мл 70% уксусной кислоты (эссенции), после створаживания сгусток казеина отделяли, а сыворотку фильтровали через ватно-марлевый фильтр и использовали для приготовления среды. Неиспользованный остаток сыворотки можно сохранить, подвергнув его автоклавированию при 115°C в течение 20 мин.

Дрожжевой аутолизат получали по Н.И.Розанову (Микробиологическая диагностика заболеваний сельскохозяйственных животных. М., Гос., из-во с.-х. литературы, 1952. - С.91).

Капустный отвар готовили по Квасникову (Квасников Е.И., Нестеренко О.А. Молочнокислые бактерии и пути их использования. - М.: Наука, 1975. - С.65).

Взятые компоненты питательной среды смешивают в колбе и доводят до кипения и кипятят 2-3 мин до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы и автоклавируют 20 мин при 0,5 атм, после остывания среды до 45-50°С в нее вносят уксусную кислоту и разливают в чашки Петри. Готовая для использования среда прозрачная, светло-коричневого цвета, с приятным молочно-растительным с уксусным оттенком запахом, с pH 5,3-5,5.

Новизна заявленного предложения состоит в том, что разработана питательная среда, обладающая выраженными селективными свойствами по отношению к лактобактериям, на которой они дают хороший рост и формируют типичные для них колонии размером 1,5-2 мм. Селективные свойства среды обусловлены содержащейся в ее составе уксусной кислотой, к которой лактобактерии устойчивы, в то время как другие бактерии (стафилострептококки, энтеробактерии, псевдомонады, бациллы и др.) к этому веществу чувствительны.

Примеры конкретного получения питательной среды для выделения лактобактерии.

В качестве тест-штаммов использовали Lactobacillus plantarum, Escherichia coli и Staphylococcus aureus, выделенных из фекалий телят. Испытуемые культуры по отдельности выращивали на агаровых средах при температуре 37°C в течение 24 ч, после чего по оптическому стандарту мутности №10 готовили 1 млрд взвесь каждого тест-штамма. После этого методом десятикратных серийных разведений в физиологическом растворе довели концентрацию микроорганизмов до 1000 микробных клеток в 1 мл. Из этого разведения отбирали по 0,1 мл и вносили в 3 чашки Петри с питательной средой. Посевы инкубировали в анаэростате с использованием газогенерирующих пакетов «Анаэрогаз» в течение 24 ч при 37°C, после чего учитывали количество выросших колоний.

Пример 1. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, масс.%: молочная сыворотка 7,0; дрожжевой аутолизат 7,0; глюкоза 1,7; уксусная кислота 70% 0,10; агар 1,4; капустный отвар - остальное. При таком соотношении ингредиентов количество колоний лактобактерий составило в среднем 25, эшерихий 54 и стафилококков 33. Среда имеет мягкую консистенцию, что затрудняет работу с бактериологической петлей.

Пример 2. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, масс.%: молочная сыворотка 8,0; дрожжевой аутолизат 8,0; глюкоза 1,8; уксусная кислота 70% 0,12; агар 1,6; капустный отвар - остальное. При таком соотношении ингредиентов количество выросших колоний лактобактерий составило в среднем 43, эшерихий 24 и стафилококков 17. Среда также имеет мягкую консистенцию.

Пример 3. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, масс.%: молочная сыворотка 9,0; дрожжевой аутолизат 9,0; глюкоза 1,9; уксусная кислота 70% 0,14; агар 1,8; капустный отвар - остальное. При таком соотношении ингредиентов количество выросших колоний лактобактерий составило в среднем 56, эшерихий 0 и стафилококков 0. Среда имеет плотную консистенцию и не скарифицируется при работе бактериологической петлей.

Пример 4. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, масс.%: молочная сыворотка 10,0; дрожжевой аутолизат 10,0; глюкоза 2,0; уксусная кислота 70% 0,16; агар 2,0; капустный отвар - остальное. При таком соотношении ингредиентов количество выросших колоний лактобактерий составило в среднем 62, эшерихий 0 и стафилококков 0. Среда имеет плотную упругую консистенцию и не скарифицируется при работе бактериологической петлей.

Пример 5. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, масс.%: молочная сыворотка 11,0; дрожжевой аутолизат 11,0; глюкоза 2,1; уксусная кислота 70% 0,18; агар 2,2; капустный отвар - остальное. При таком соотношении ингредиентов количество выросших колоний лактобактерий составило в среднем 46, эшерихий 0 и стафилококков 0. Несмотря на хороший рост лактобактерий на данной среде, выросшие колонии более мелкие, чем на вариантах сред в примерах 3 и 4. Среда имеет плотную упругую консистенцию и не скарифицируется при работе бактериологической петлей.

Пример 6. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, масс.%: молочная сыворотка 12,0; дрожжевой аутолизат 12,0; глюкоза 2,2; уксусная кислота 70% 0,20; агар 2,4; капустный отвар - остальное. При таком соотношении ингредиентов количество выросших колоний лактобактерии составило в среднем 23, эшерихий 0 и стафилококков 0. На данном варианте среды рост лактобактерий более замедлен, а формирующиеся колонии значительно меньшего размера (0,5-0,7 мм), чем на вариантах сред в примерах 3 и 4, на которых тест-штамм лактобактрий формировал колонии размером 1-2 мм.

Пример 7. Исследовали фекалии от 30-дневного теленка. Для этого физиологическим раствором осуществили десятикратные разведения 1 г фекалий до значения 10^-9. Из пробирок с разведением 10^-3, 10^-5, 10^-7 и 10^-9 отобрали 0,1 мл суспензии и засеяли на питательную среду, содержащую, масс.%: молочная сыворотка 9,0; дрожжевой аутолизат 9,0; глюкоза 1,9; уксусная кислота 70% 0,14; агар 1,8; капустный отвар - остальное. Через 24 ч инкубации при температуре 37°C в условиях повышенного содержания CO₂ учитывали рост бактерий. Из разведения 10^-3 на среде выросло 265 колоний, которые по морфологии соответствовали колониям лактобактерий, при микроскопии это были грамположительные палочки. Колоний, характерных для энтеробактерий, стафилококков, бацилл, не было. Из разведения 10^-5 выросло 96 колоний, типичных для колоний лактобактерий, при микроскопии колоний установлено, что их образовывали грамположительные палочки. Колоний, характерных для энтеробактерий, стафилококков, бацилл, не было. Из разведения 10^-7 и 10^-9 бактериальный рост полностью отсутствовал. Следовательно, в фекалиях теленка количество лактобактерий было 9,6·10⁶ колониеобразующих единиц в 1 г.

Пример 8. Исследовали фекалии от 30-дневного теленка. Для этого физиологическим раствором осуществили десятикратные разведения 1 г фекалий до значения 10^-9. Из пробирок с разведением 10^-3, 10^-5, 10^-7 и 10^-9 отобрали 0,1 мл суспензии и засеяли на питательную среду, содержащую, масс.%: молочная сыворотка 10,0; дрожжевой аутолизат 10,0; глюкоза 2,0; уксусная кислота 70% 0,16; агар 2,0; капустный отвар - остальное. Через 24 ч инкубации при температуре 37°C в условиях повышенного содержания CO₂ учитывали рост бактерий. Из разведения 10^-3 на среде выросло 215 колоний, которые по морфологии соответствовали колониям лактобактерий, при микроскопии это были грамположительные палочки. Колоний, характерных для энтеробактерий, стафилококков, бацилл, не было. Из разведения 10^-5 выросло 63 колонии, типичных для колоний лактобактерий, при микроскопии колоний установлено, что их образовывали грамположительные палочки. Колоний, характерных для энтеробактерий, стафилококков, бацилл, не было.

Из разведения 10^-7 и 10^-9 бактериальный рост полностью отсутствовал. Следовательно, в фекалиях теленка количество лактобактерий было 6,3×10⁶ колониеобразующих единиц в 1 г.

Таким образом, полученные результаты позволяют определить оптимальные соотношения ингредиентов питательной среды для выделения лактобактерий, а именно - молочная сыворотка 9,0-10%; дрожжевой аутолизат 9,0-10%; глюкоза 1,9-2,0%; уксусная кислота 70% 0,14-0,16%; агар 1,8-2,0%; капустный отвар - остальное. Данная среда обеспечивает хороший рост лактобактерий при полном подавлении роста эшерихий, стафилококков и др. бактерий, а поэтому может использоваться в качестве селективной при выделении лактобактерий от животных.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при изучении микрофлоры животных, а также бактериологической диагностике дисбактериоза кишечника. Питательная среда содержит молочную сыворотку, дрожжевой аутолизат, глюкозу, уксусную кислоту 70%, агар и капустный отвар в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет повысить селективность питательной среды и упростить ее производство. 8 пр.

Питательная среда для выделения лактобактерий, включающая капустный отвар, глюкозу, агар, отличающаяся тем, что в качестве дополнительных источников питания и селективности содержит молочную сыворотку, дрожжевой аутолизат и уксусную кислоту при следующем соотношении компонентов, мас.%:
молочная сыворотка 9-10,0 дрожжевой аутолизат 9-10,0 глюкоза 1,9-2,0 уксусная кислота 70% 0,14-0,16 агар-агар 1,8-2,0 капустный отвар остальное