СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТЕРОИДНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ВОССТАНОВЛЕНИЕМ ОКСОСТЕРОИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ИЛИ ОКИСЛЕНИЕМ ГИДРОКСИСТЕРОИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГИДРОКСИСТЕРОИДНОЙ ДЕГИДРОГЕНАЗЫ Российский патент 2011 года по МПК C12P33/02 C12N9/04 

Настоящее изобретение относится к способу энантиоселективного ферментативного восстановления соединений, которые имеют стероидную структуру (ABCD), включая один или несколько гетероатомов, одну или несколько двойных связей и/или ароматическое звено в циклической структуре, и содержат по меньшей мере одну оксо-группу в положении 3, 7, 11, 12 или 17 стероидной циклической системы или в α-положении какого-либо углеродного остатка на стероидном скелете (= оксостероидное соединение), причем оксостероидное соединение восстанавливается гидроксистероидной дегидрогеназой в присутствии кофактора NADH или NADPH.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу окисления соединений, которые имеют стероидную структуру (ABCD), включая один или несколько гетероатомов, одну или несколько двойных связей и/или одно ароматическое звено в циклической структуре, и содержат по меньшей мере одну гидрокси-группу в положении 3, 7, 11, 12 или 17 стероидной циклической системы или в α-положении какого-либо углеродного остатка на стероидном скелете (= гидроксистероидное соединение), причем гидроксистероидное соединение окисляется гидроксистероидной дегидрогеназой в присутствии кофактора NAD или NADP.

Стероиды представляют собой соединения, имеющие циклическую систему холестерина и различающиеся числом двойных связей, видом, числом и положением функциональных групп, числом метильных групп, алкильной боковой цепью и конфигурацией связей. Стероидные соединения встречаются как в животных организмах, так и в грибах и растениях и имеют разнообразную биологическую активность, например, как мужские и женские половые гормоны, как гормоны надпочечников, как витамины, как желчные кислоты, как стероидные сапогенины, как действующие на сердце вещества и как жабьи яды.

Далее под оксостероидными соединениями понимаются стероиды определенного в начале вида, то есть такие, которые содержат по меньшей мере одну кетогруппу, причем она может находиться на циклической системе или же на имеющейся на стероидном скелете боковой цепи.

Под гидроксистероидными соединениями далее понимаются стероиды определенного в начале вида, то есть такие, которые содержат по меньшей мере одну гидрокси-группу, причем она может находиться на циклической системе или же на имеющейся на стероидном скелете боковой цепи.

Благодаря многостороннему физиологическому действию стероидов понятно, что стероидные соединения и производные применяются также в большом числе как терапевтические средства и лекарственные средства в медицине.

Так, например, производные гестагена и эстрогена широко применяются во всем мире как контрацептивы; андрогены (тестостерон) применяются в лечении, например, рака предстательной железы как анаболики и антиандрогены. Глюкокортикоиды (кортизон, кортизол, преднизолон и преднизон) и их производные благодаря их противовоспалительному, противоаллергическому и иммунодепрессивному действию широко используются в терапевтическом лечении кожных заболеваний, ревматических заболеваний, аллергических реакций, заболеваний почек, желудочно-кишечных заболеваний и многих других нарушений.

Мировой рынок биологически активных стероидных соединений огромен. В производстве различных производных стероидов разного действия большую роль играют биотрансформации. При этом, в частности, важны реакции, которые катализируются гидроксилазами и дегидрогеназами. При этом особую роль играют дельта-1-дегидрирование, 11-бета-восстановление, 20-бета-восстановление, 17-бета-восстановление, стереоселективное восстановление в положении 3 и 7, а также окисление гидрокси-групп, в частности, в положениях 3, 7, 12 и 17.

В промышленности биовосстановление на стероидах до сих пор проводилось исключительно с целыми, невредимыми клетками и при концентрациях субстрата намного ниже 10 г/л. Это объясняется, во-первых, тем, что ответственные за биотрансформации ферменты до сих пор не были охарактеризованы или не могли быть экспрессированы, а, во-вторых, также тем, что не предлагалось никакого удовлетворительного технологического решения, которое, с одной стороны, решало бы проблему низкой растворимости стероидов в водной среде, а с другой стороны - проблему регенерации кофакторов NADH и NADPH в достаточной степени.

Окисление на стероидах до настоящего времени в промышленности осуществлялось химически.

Опыты по энантиоселективному восстановлению стероидов изолированными ферментами были описаны с 1975 по 1988 в основном G.Carrea (Eur. J. Biochemistry 44, 1974, p.401-405; Biotechnology and Bioengineering, Vol. 17, 1975, p.1101-1108; Enzyme Microb. Technol. Vol. 6, July, 1984, p.307-311; Biotechnology and Bioengineering, Vol. 26, 1984, p.560-563; J. Org. Chem. 51, 1986, p.2902-2906; J. Org. Chem. 58, 1993, p.499-501; J. Org. Chem., 53, 1988, p.88-92; Enzyme Microb. Technol., Vol. 10, June, p.333-339; Archives of Biochemistry and Biophysics, 159, 1973, p.7-10).

При этом использовались различные гидроксистероидные дегидрогеназы (HSHD), причем регенерация кофактора NADH достигалась в основном путем сочетания с ферментами лактатдегидрогеназа, формиатдегидрогеназа или же спиртовая дегидрогеназа из дрожжей. Регенерация NADP проводилась с помощью глюкозадегидрогеназы. Для решения проблемы растворимости проводились также опыты в двухфазной системе с этилацетатом и бутилацетатом в качестве органической фазы. При этом с изолированными ферментами в двухфазной системе также работали в диапазоне концентраций в основном намного ниже 10 г/л, причем достигаемые "total turn over numbers" (TTN = моли восстановленного оксостероидного соединения на моль использованного кофактора) также лежали намного ниже 1000, из-за чего эти способы не давали существенного экономического преимущества по сравнению со способами с цельными клетками.

Кроме того, имеются работы, в которых превращение гидрокси-групп из 7-альфа в 7-бета проводилось путем сочетания окисления и восстановления. Это достигалось сочетанием 7α HSDH и 7β HSDH (Pedrini et al., Steroid 71 (2006), p. 189-198). И в этом способе работали в диапазоне концентраций намного ниже 10 г/л, и получаемые "total turn over numbers" (TTN = моли восстановленного оксостероидного соединения на моль используемого кофактора) были ниже 100, из-за чего эти способы также не имеют экономического значения.

Изобретение имеет целью устранение этих недостатков и трудностей и ставит задачу разработать способ, который позволяет энантиоселективное восстановление или окисление оксостероидных соединений или гидроксистероидных соединений с высокими выходами, в диапазоне высоких концентраций и с высокими TTN кофакторов и тем самым экономически выгодным образом.

Эта задача решена способом указанного в начале вида тем, что:

a) оксостероидное соединение находится в реакционной смеси в концентрации ≥50 г/л,

b) окисленный кофактор NAD или NADP, образуемый гидроксистероидной гидрогеназой, непрерывно регенерируется через окисление вторичного спирта общей формулы R_XR_YCHOH, причем R_X, R_Y независимо друг от друга означают водород, разветвленный или неразветвленный C₁-C₈-алкил и С_общ≥3, или через окисление C₄-C₆-циклоалканола, и

c) для окисления вторичного спирта общей формулы R_XR_YCHOH или циклоалканола используется дополнительная оксидоредуктаза/спиртовая дегидрогеназа.

Кроме того, вышеуказанная задача в соответствии со способом указанного в начале вида решается тем, что:

a) гидроксистероидное соединение находится в реакционной смеси в концентрации ≥50 г/л,

b) восстановленный кофактор NADH или NADPH, образуемый гидроксистероидной гидрогеназой, непрерывно регенерируется через восстановление кетосоединения общей формулы R_XR_YCO, причем R_X, R_Y независимо друг от друга означают водород, разветвленный или неразветвленный C₁-C₈-алкил и С_общ≥3, или через восстановление C₄-C₆-циклоалканона, и

c) для восстановления кетосоединения общей формулы R_XR_YCO или циклоалканона используется дополнительная оксидоредуктаза/спиртовая дегидрогеназа.

Настоящее изобретение представляет собой существенное улучшение реакции энантиоселективного ферментативного восстановления и окисления на стероидном скелете по сравнению с уровнем техники. Настоящее изобретение делает возможным восстановление или окисление оксостероидных соединений до соответствующих гидрокси- или оксостероидов свободными ферментами в диапазонах концентраций, которые намного превышают описанные в уровне техники.

В способе согласно изобретению в качестве кофактора применяется NADH или NADPH. Под термином "NADP" понимается никотинамид-аденин-динуклеотид-фосфат, под "NADPH" восстановленный никотинамид-аденин-динуклеотид-фосфат. Термин "NAD" означает никотинамид-аденин-динуклеотид, термин "NADH" - восстановленный никотинамид-аденин-динуклеотид.

Согласно одной предпочтительной форме реализации способ по изобретению отличается тем, что в качестве оксостероидного соединения используется соединение общей формулы I

в которой означают:

R₁ - водород, метильная группа, гидрокси-группа или оксо-группа,

R₂ - водород, метильная группа, гидрокси-группа или оксо-группа,

R₃ - водород, гидрокси-группа, оксо-группа или метильная группа,

R₄ - водород или гидрокси-группа,

R₅ - водород, остаток -COR₁₀, причем R₁₀ представляет собой незамещенную или замещенную гидрокси-группой C₁-C₄-алкильную группу или замещенную или незамещенную C₁-C₄-карбоксиалкильную группу,

или R₄ и R₅ вместе означают оксо-группу,

R₆ - водород, метильная группа, гидрокси-группа или оксо-группа,

R₇ - водород, метильная группа, гидрокси-группа или оксо-группа,

R₈ - водород, метильная группа или галогенид, и

R₉ - водород, метильная группа, гидрокси-группа, оксо-группа или галогенид,

причем по меньшей мере одно из R₁, R₂, R₄+R₅, R₆, R₈ или R₉ означает оксо-группу или R₅ является остатком -COR₁₀, а структурный элемент

означает бензольное кольцо или C₆-кольцо с 0, 1 или 2 двойными связями C-C.

Согласно одной предпочтительной форме реализации способ по изобретению отличается тем, что в качестве гидроксистероидного соединения используется соединение общей формулы I

в которой означают:

R₁ - водород, метильная группа, гидрокси-группа или оксо-группа,

R₂ - водород, метильная группа, оксо-группа или гидрокси-группа,

R₃ - водород, гидрокси-группа, оксо-группа или метильная группа,

R₄ - водород или гидрокси-группа,

R₅ - водород, остаток -COR₁₀, причем R₁₀ представляет собой незамещенную или замещенную гидрокси-группой C₁-C₄-алкильную группу или замещенную или незамещенную C₁-C₄-карбоксиалкильную группу,

или R₄ и R₅ вместе означают оксо-группу,

R₆ - водород, метильная группа, оксо-группа или гидрокси-группа,

R₇ - водород, метильная группа, оксо-группа или гидрокси-группа,

R₈ - водород, метильная группа или галогенид, и

R₉ - водород, метильная группа, гидрокси-группа, оксо-группа или галогенид,

причем по меньшей мере одно из R₁, R₂, R₄, R₆, R₇, R₈ или R₉ означает гидрокси-группу, а структурный элемент

означает бензольное кольцо или C₆-кольцо с 0, 1 или 2 двойными связями C-C.

Предпочтительно, в качестве вторичного спирта общей формулы R_XR_YCHOH используется 2-пропанол, 2-бутанол, 2-пентанол, 4-метил-2-пентанол, 2-гексанол, 2-гептанол, 5-метил-2-гексанол или 2-октанол, а в качестве циклического спирта - циклогексанол.

Предпочтительно, в качестве кетона общей формулы R_XR_YCO используется ацетон, 2-бутанон, 2-пентанон, 4-метил-2-пентанон, 2-гексанон, 2-гептанон, 5-метил-2-гексанон или 2-октанон, а в качестве циклоалканона - циклогексанон.

В дальнейшем для кетона общей формулы R_XR_YCO, соответственно C₄-C₆-циклоалканона и вторичного спирта общей формулы R_XR_YCHOH или C₄-C₆-циклоалканола используется обобщенное обозначение косубстрат.

Предпочтительно, способ по изобретению осуществляется в водно-органической двухфазной системе. При этом целесообразно, чтобы используемый для образования коферментов косубстрат не смешивался с водой и тем самым образовывал органическую фазу водно-органической двухфазной системы.

Согласно следующей форме реализации в способе дополнительно используется органический растворитель, который не участвует в регенерации кофактора, такой как, например, диэтиловый эфир, трет-бутилметиловый эфир, диизопропиловый эфир, дибутиловый эфир, этилацетат, бутилацетат, гептан, гексан или циклогексан.

Далее, предпочтительно, чтобы TTN в способе по изобретению составляло ≥10³.

Кроме того, предпочтительно, чтобы по меньшей мере 50% используемого оксостероидного соединения или гидроксистероидного соединения окислялось в течение 2-96 часов до соответствующего гидроксистероидного соединения или восстанавливалось до оксостероидного соединения.

Предпочтительные формы реализации способа по изобретению отличаются тем, что в качестве оксостероидного соединения используются, например, кетолитохолевая кислота (формула II), дексаметазон (формула III), 4-андростен-3,17-дион (формула IV), 1,4-андростадиен-3,17-дион (формула V), эстрон (формула VI), прегненолон (формула VII) и кортизон (формула VIII).

Предпочтительные формы реализации способа по изобретению отличаются, кроме того, тем, что в качестве гидроксистероидного соединения используются, например, различные производные желчной кислоты, такие как холевая кислота, хенодеоксохолевая кислота, 12-оксохолевая кислота, 3-гидрокси-12-оксохолевая кислота, кетолитохолевая кислота, литохолевая кислота или же гидрокортизон.

Под гидроксистероидными дегидрогеназами понимаются обычно такие ферменты, которые способны катализировать восстановление кетогрупп до гидрокси-групп или окисление гидрокси-групп в соответствующие кетогруппы на стероидном скелете. При этом окисление или восстановление может происходить на циклической системе самого стероида (например, 7-α гидроксистероидные дегидрогеназы) или же на углеродных остатках стероидного скелета (например, 20-β гидроксистероидные дегидрогеназы).

Гидроксистероидными дегидрогеназами, подходящими для восстановления оксостероидных соединений, являются, например, 3-α гидроксистероидная дегидрогеназа (HSDH), 3β HSDH, 12α HSDH, 20β HSDH, 7α HSDH, 7β HSDH, 17β HSDH и 11β HSDH.

Подходящая 3-α гидроксистероидная дегидрогеназа может быть получена, например, из Pseudomonas testosteroni (J. Biol. Chem. 276 (13), 9961-9970 (2001)) и может применяться для окисления 3-α-гидроксистероидов или для восстановления 3-кетостероидов, например 3-кетожелчных кислот, прогестерона, 4-андростен-3,17-диона, 5-α-андростан-3,17-диона и т.д.

Подходящие ферменты с активностью к 3-β гидроксистероидной дегидрогеназе могут быть получены, например, из Clostridium innocuum (Applied and Environmental Microbiology, June 1989, p.1656-1659) или из Pseudomonas testosteroni, и их можно использовать для окисления 3-β-гидроксистероидов или для восстановления 3-кетостероидов, например 3-кетожелчных кислот, прогестерона, 4-андростен-3,17-диона, 5-α-андростан-3,17-диона и т.д.

Например, 12α HSDH может быть получена из клостридий (Eur. J. Biochem. 196 (1991) 439-450), ее можно использовать для окисления 12α-гидроксистероидов (например, холевой кислоты) или для восстановления 12-кетостероидов, например 12-кетожелчных кислот (12-кетохенодеоксихолевая кислота, дегидрохолевая кислота). Описаны также ферменты из клостридий с активностью к 12-β гидроксистероидной дегидрогеназе (Biochim. Biophys. Acta 1988 Oct. 14; 962(3): 362-370).

Ферменты с активностью к 20-β гидроксистероидной дегидрогеназе могут быть получены, например, из организмов группы Streptomyces (The Journal of Biological Chemistry, 1977, Vol. 252 № 1, Jan 10, 205-211) и могут применяться для восстановления кортизона и производных кортизола (кортизон, кортизол, кортексолон, прогестерон) до соответствующих 20-β-гидроксистероидов (например, 20-β-гидроксипрогестерон).

Соответствующие ферменты с активностью к 20-α гидроксистероидной дегидрогеназе могут быть получены, например, из клостридий, в частности из Clostridium scindens (Journal of Bacteriology, June 1989, p.2925-2932), и из Tetrahymena pyriformis (Biochem J. (1994) 297, 195-200).

Подходящие 7-α гидроксистероидные дегидрогеназы могут быть получены, кроме того, из организмов кишечной флоры, например из клостридий (Clostridium absonum, Clostridium sordellii) (Journal of Bacteriology, Aug. 1994, p.4865-4874), из Escherichia coli (Journal of Bacteriology Apr., 1991, p.2173-2179), из Bacteroides fragilis (Current Microbiology, Vol. 47 (2003), 475-484), Brucella, Eubacterium, они могут применяться для окисления 7-α-гидроксистероидов (хенолитохолевая кислота) или для восстановления 7-кетостероидов, например 7-кетожелчных кислот (кетолитохолевая кислота).

Описаны также соответствующие ферменты с активностью к 7-β гидроксистероидной дегидрогеназе из клостридий, из микроорганизмов семейства Ruminococcen (J. Biochemistry 102, 1987, p.613-619) или пептострептококков (Biochimica and Biophysica Acta 1004, 1989, p.230-238), из Eubacterium aerofaciens (Applied and Environmental Microbiology, May 1982, p.1057-1063) и из Xanthomonas maltophila (Pedrini et al., Steroids 71 (2006), p. 189-198). С помощью 7-β HSDH можно получить, например, урсодезоксихолевую кислоту из кетолитохолевой кислоты.

Известны 17-β гидроксистероидные дегидрогеназы из грибов, как Cylindrocarpon radicola (J. Biochemistry 103, 1988, 1039-1044) и Cochliobolus lunatus (J. Steroid Biochem. Molec. Biol. Vol. 59, 1996, № 2, p.205-214), из бактерий семейства Streptomyces (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem, Bd. 356, 1975, 1843-1852), Pseudomonas (The Journal of Biological Chemistry, Vol.252, № 11, June 10, 1977, p.3775-3783) и Alcaligenes (The Journal of Biological Chemistry, Vol.260, № 25, Nov 5, 1985, p.13648-13655).

17-β-гидроксистероидные дегидрогеназы могут применяться, например, для окисления 17-β-гидроксистероидов или для восстановления 17-кетостероидов, например 4-андростен-3,17-диона, андростерона, эстрона.

Описан соответствующий фермент с активностью к 17-α гидроксистероидной дегидрогеназе из Eubacterium sp. (Journal of Lipid Research, Vol.35, 1994, p.922-929).

Известны 11-β гидроксистероидные дегидрогеназы из высших млекопитающих, которые могут применяться, например, для окисления кортизола в кортизон.

Однако в качестве гидроксистероидной дегидрогеназы могут применяться также любые другие оксидоредуктазы, которые катализируют окисление или восстановление на стероидном скелете.

Дегидрогеназами вторичных спиртов, подходящими для регенерации NADH или NAD, например, при использовании 17-β гидроксистероидных дегидрогеназ из Pseudomonas testosteroni, 3-β гидроксистероидных дегидрогеназ из Clostridium innocuum или 7-α гидроксистероидной дегидрогеназы из Bacteroides fragilis, являются, например, вышеописанные дегидрогеназы, которые выделяют из дрожжей рода Candida и Pichia, такие как, например, карбонилредуктаза из Candida parapsilosis (CPCR) (US 5523223 и US 5763236; Enzyme Microb. Technol. 1993 Nov; 15(11):950-8), Pichia capsulata (DE 10327454.4), Pichia farinosa (A 1261/2005, кл. C12N), Pichia finlandica (EP 1179595 Al), Candida nemodendra (A 1261/2005, кл. C12N), Pichia trehalophila (A 1261/2005, кл. C12N), Rhodotorula mucilaginosa (A 1261/2005, кл. C12N), Lodderomyces elongisporus (A 1261/2005, кл. C12N) и Pichia stipidis (A 1261/2005, кл. C12N).

Кроме того, регенерация NADH может осуществляться также вторичными спиртовыми дегидрогеназами/оксидоредуктазами, какие описаны и выделены из бактерий класса Actinobacteria, например, из Rhodococcus erythropolis (US 5523223), Norcardia fusca (Biosci. Biotechnol. Biochem., 63 (10) (1999), p. 1721-1729; Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003 Sep; 62(4):380-6, Epub 2003 Apr 26), Rhodococcus ruber (J. Org. Chem. 2003 Jan 24; 8(2):402-6) или Microbacterium spec. (A 1261/2005, кл. C12N).

Вторичными спиртовыми дегидрогеназами/оксидоредуктазами, подходящими для регенерации NADPH или NADP, например, при использовании 12-α гидроксистероидных дегидрогеназ из Clostridium paraputrificum, 17-α гидроксистероидных дегидрогеназ из Eubacterium sp. или 7-α гидроксистероидных дегидрогеназ из Clostridium sordelli, являются, например, такие, какие описаны и выделены из организмов отряда лактобацилл (Lactobacillus kefir (US 5200335), Lactobacillus brevis (DE 19610984 Al; Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 2000 Dec; 56 Pt 12:1696-8), Lactobacillus minor (DE 10119274), Leuconostoc carnosum (A 1261/2005, кл. C12N)), или такие, какие описаны из Thermoanerobium brockii, Thermoanerobium ethanolicus или Clostridium beijerinckii.

Оба фермента: гидроксистероидная дегидрогеназа и оксидоредуктаза/спиртовая дегидрогеназа - предпочтительно используются рекомбинатно сверхэкспрессированными в Escherichia coli. В способе по изобретению оба фермента: гидроксистероидная дегидрогеназа и спиртовая дегидрогеназа/оксидоредуктаза - могут применяться полностью очищенными, частично очищенными или находящимися в клетках. При этом используемые клетки могут присутствовать как естественные, как клетки с нарушенной проницаемостью мембраны или растворенными.

На 1 кг реагирующего оксостероидного соединения или гидроксистероидного соединения используется от 50000 до 10 млн ед. гидроксистероидной дегидрогеназы и от 50000 до 10 млн ед. спиртовой дегидрогеназы (с открытой верхней границей).

При этом единице ферментов 1 ед. соответствует такое количество ферментов в гидроксистероидной дегидрогеназе, которое необходимо, чтобы реагировал 1 мкмоль оксостероидного соединения в минуту (мин), или такое количество ферментов в спиртовой дегидрогеназе, которое необходимо для окисления 1 мкмоль вторичного спирта в минуту (мин).

Аналогично, на каждый кг реагирующего оксостероидного соединения или гидроксистероидного соединения может использоваться примерно от 10 г до 500 г влажной биомассы E.coli, содержащей гидроксистероидную дегидрогеназу, и от 10 г до 500 г влажной биомассы E.coli, содержащей спиртовую дегидрогеназу/оксидоредуктазу (верхняя граница открыта).

Регенерация NAD(P)H осуществляется в описанном способе в сочетании с ферментами.

В способе по изобретению реакция превращения оксостероидного соединения или гидроксистероидного соединения протекает предпочтительно в двухфазной системе, содержащей вторичный спирт или кетосоединение для регенерации кофактора, гидроксистероидную дегидрогеназу, спиртовую дегидрогеназу, воду, кофактор и оксостероидное соединение или гидроксистероидное соединение. Кроме того, могут содержаться также дополнительные органические растворители, которые не участвуют в регенерации кофактора, то есть ни один из которых не содержит окисляемых спиртовой дегидрогеназой гидрокси-групп или восстанавливаемых кетогрупп.

При этом доля не смешиваемых с водой органических компонентов двухфазной системы может составлять от 10 до 90%, предпочтительно от 20 до 80%, в расчете на полный объем реакционной смеси. Содержание воды может составлять от 90 до 10%, предпочтительно от 80 до 20%, от полного объема реакционной смеси.

К воде можно добавлять буфер, например калийфосфатный, Tris/HCl, глициновый или триэтаноламиновый буфер со значением pH от 5 до 10, предпочтительно от 6 до 9. Дополнительно буфер может содержать ионы для стабилизации или активирования обоих ферментов, например ионы магния или ионы цинка.

Кроме того, в способе по изобретению могут использоваться дополнительные добавки для стабилизации ферментов гидроксистероидная дегидрогеназа и спиртовая дегидрогеназа, такие как, например, глицерин, сорбитол, 1,4-DL-дитиотреит (DTT) или диметилсульфоксид (ДМСО).

Концентрация кофактора NAD(P)H в расчете на водную фазу составляет от 0,001 мМ до 10 мМ, в частности от 0,01 мМ до 1,0 мМ. Температура в зависимости от конкретных свойств использующихся ферментов может составлять от 10°C до 70°C, предпочтительно от 20°C до 35°C.

При этом достигаемое в способе по изобретению TTN (total turn over number = моли восстановленного оксостероидного соединения на моль используемого кофактора) может находиться в интервале от 10² до 10⁵, как правило, предпочтительно TTN ≥10³.

Восстанавливаемые оксостероидные соединения или гидроксистероидные соединения, как правило, плохо растворяются в воде. Субстрат во время реакции может находиться полностью, а также частично растворенным. Если субстрат в реакционной смеси растворим не полностью, то часть субстрата находится в твердой форме и, таким образом, может образовывать третью твердую фазу. Реакционная смесь может также во время превращения периодически образовывать эмульсию.

Восстанавливаемое оксостероидное соединение или окисляемое гидроксистероидное соединение в способе по изобретению используется в количествах ≥50 г/л в расчете на полный объем реакционной смеси. Предпочтительно используется от 50 г/л до 400 г/л оксостероидного соединения/гидроксистероидного соединения, особенно предпочтительно от 50 г/л до 200 г/л.

Предпочтительными дополнительными органическими растворителями, которые не участвуют в регенерации кофактора, являются, например, этилацетат, бутилацетат, трет-бутилметиловый эфир, диизопропиловый эфир, гептан, гексан, толуол, дихлорметан или циклогексан или их смеси разного состава.

Регенерация NAD(P)H достигается окислением вторичных спиртов общей формулы R_XR_YCHOH или C₄-C₆-циклоалканолов. При этом в качестве продуктов реакции образуются кетоны общей формулы R_XR_YC=O или C₄-C₆-циклоалканоны. Предпочтительными вторичными спиртами являются при этом алифатические вторичные спирты, такие как, например, изопропанол, 2-бутанол, 2-пентанол, 2-гексанол, 2-гептанол, 2-октанол, 4-метил-2-пентанол, 5 метил-2-гексанол, и циклические вторичные спирты, такие как циклогексанол, циклопентанол. В принципе допустимо также применение диолов, таких как, например, 1,4-циклогександиол.

Регенерация NAD(P) достигается восстановлением кетосоединений общей формулы R_XR_YC=O или C₄-C₆-циклоалканонов. При этом как продукты реакции образуются вторичные спирты общей формулы R_XR_YCHOH или C₄-C₆-циклоалканолы. Предпочтительными кетосоединениями при этом являются кетоны, такие как, например, ацетон, 2-бутанон, 2-пентанон, 2-гексанон, 2-гептанон, 2-октанон, 4-метил-2-пентанон, 5-метил-2-гексанон и циклические кетоны, такие как циклогексанон, циклопентанон. В принципе допустимо также применение дионов, например 1,4-циклогександиона.

Способ по изобретению проводится, например, в реакционном сосуде из стекла или металла. Для этого компоненты помещают в реакционный сосуд по отдельности и перемешивают в атмосфере, например, азота или воздуха. В зависимости от используемого оксостероидного соединения продолжительность реакции составляет от 1 часа до 96 часов, в частности от 2 часов до 48 часов. За это время по меньшей мере 50% оксостероидного соединения восстановится до соответствующего гидроксистероида или гидроксистероид окислится до оксостероидного соединения.

Далее настоящее изобретение подробнее поясняется на примерах.

Примеры

1. Восстановление андростен-3,17-диона до 17-β-гидрокси-4-андростен-3-она (тестостерон)

A) Двухфазная система с 4-метил-2-пентанолом для регенерации кофермента

Для синтеза 17β-гидрокси-4-андростен-3-она (тестостерона) к 0,5 мл буфера (100 мМ триэтаноламина, pH 7, 1 мМ MgCl₂, 10% глицерина), содержащего 0,1 мг NAD, 30 единиц рекомбинантной 17-β-гидроксистероидной дегидрогеназы из Pseudomonas testosteroni (J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 44 (2), 133-139 (1993), Pubmed P19871) и 50 единиц рекомбинантной спиртовой дегидрогеназы из Pichia capsulata (DE-A 10327454), добавляют 100 мг андростен-3,17-диона, растворенного в 0,4 мл 4-метил-2-пентанола. Смесь выдерживают 24 ч при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Концентрация андростен-3,17-диона во всем реакционном объеме составляет около 100 г/л.

По окончании реакции реакционную смесь можно переработать, например, экстрагируя реакционную смесь органическим растворителем и затем удаляя растворитель перегонкой.

Через 24 часа около 94% использованного андростен-3,17-диона превращается в 17-β-гидрокси-4-андростен-3-он (тестостерон).

За превращением андростен-3,17-диона в 17-β-гидрокси-4-андростен-3-он (тестостерон) наблюдали с помощью газовой хроматографии. Для этого применялся газовый хроматограф GC-17A фирмы Shimadzu с хиральной разделительной колонкой Lipodex E, 12m (Machery-Nagel, Düren, Германия), пламенно-ионизационный газоанализатор и гелий в качестве газа-носителя.

B) Двухфазная система с бутилацетатом и 2-пропанолом для регенерации кофермента

Для синтеза 17-β-гидрокси-4-андростен-3-она (тестостерона) к 0,5 мл буфера (100 мМ триэтаноламина, pH 7, 1 мМ MgCl₂, 10% глицерина), содержащего 0,1 мг NAD, 30 единиц рекомбинантной 17-β-гидроксистероидной дегидрогеназы из Pseudomonas testosteroni (J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 44 (2), 133-139 (1993), Pubmed P19871) и 50 единиц рекомбинантной спиртовой дегидрогеназы из Pichia capsulata (DE-A 10327454), добавляют 100 мг андростен-3,17-диона, растворенного в 0,3 мл бутилацетата и 0,1 мл 2-пропанола. Смесь выдерживают 24 часа при комнатной температуре и при постоянном перемешивании. Концентрация андростен-3,17-диона во всем реакционном объеме составляет около 100 г/л.

По окончании реакции реакционную смесь можно переработать, например, экстрагируя реакционную смесь органическим растворителем и затем удаляя растворитель перегонкой.

Через 24 часа около 90-95% использованного андростен-3,17-диона превращается в 17-β-гидрокси-4-андростен-3-он (тестостерон).

2. Восстановление кетолитохолевой кислоты до хенолитохолевой кислоты

A) Регенерация коферментов посредством ADH из Thermoanerobium brockii/двухфазная система

Для синтеза 3α-7α-дигидрокси-5-β-холановой кислоты (хенодеоксихолевой кислоты) к 0,2 мл буфера (100 мМ калийфосфатного буфера, pH 8,5, 1 мМ MgCl₂, 10% глицерина), содержащего 0,1 мг NADP, 10 единиц рекомбинантной 7-α-гидроксистероидной дегидрогеназы из Clostridiem scindens (Pubmed AAB61151) и 10 единиц рекомбинантной спиртовой дегидрогеназы из Thermoanerobium brockii, добавляют 100 мг 3α-гидрокси-7-оксо-5-β-холановой кислоты (кетолитохолевой кислоты) в 0,5 мл метилпентанола. Смесь выдерживают 24 часа при комнатной температуре и при постоянном перемешивании. Концентрация кетолитохолевой кислоты во всем реакционном объеме составляет около 100 г/л.

Через 24 часа примерно 90-98% использованной кетолитохолевой кислоты превращается в хенодеоксихолевую кислоту.

За превращением кетолитохолевой кислоты в хенодеоксихолевую кислоту наблюдают с помощью ВЭЖХ. Для этого применяется разделительная колонка EC125/4 Nucleodur 100-5 C18ec (Machery-Nagel, Düren, Германия) изократического разделения со смесью MeOH/вода (80:20).

B) Регенерация кофермента посредством ADH из лактобацилл (DE 10119274)/двухфазная система

Для синтеза 3α-7α-дигидрокси-5-β-холановой кислоты (хенодеоксихолевой кислоты) к, например, 0,3 мл буфера (100 мМ триэтаноламинового буфера, pH 7, 1 мМ MgCl₂, 10% глицерина), содержащего 0,1 мг NADP, 10 единиц рекомбинантной 7-α-гидроксистероидной дегидрогеназы из Clostridium scindens (Pubmed AAB61151) и 10 единиц рекомбинантной спиртовой дегидрогеназы из лактобацилл (DE 10119274), добавляют 100 мг 3α-гидрокси-7-оксо-5-β-холановой кислоты (кетолитохолевой кислоты) в 0,5 мл октанола. Смесь выдерживают 24 часа при комнатной температуре и при постоянном перемешивании. Концентрация кетолитохолевой кислоты во всем реакционном объеме составляет около 100 г/л.

Через 24 часа примерно 70-80% использованной кетолитохолевой кислоты превращается в хенодеоксихолевую кислоту.

3. Восстановление 1,4-андростадиен-3,17-диона в 17-β-гидрокси-1,4-андростадиен-3-он

Для синтеза 17-β-гидрокси-1,4-андростадиен-3-она к 0,5 мл буфера (100 мМ триэтаноламина, pH 7, 1 мМ MgCl₂, 10% глицерина), содержащего 0,1 мг NAD, 30 единиц рекомбинантной 17-β-гидроксистероидной дегидрогеназы из Pseudomonas testosteroni (J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 44 (2), 133-139 (1993), Pubmed P19871) и 5 единиц рекомбинантной спиртовой дегидрогеназы из Pichia capsulata (DE-A 10327454), добавляют 100 мг 1,4-андростадиен-3,17-диона, растворенного в 0,4 мл 4-метил-2-пентанола. Смесь выдерживают 24 часа при комнатной температуре и при постоянном перемешивании. Концентрация 1,4-андростадиен-3,17-диона во всем реакционном объеме составляет около 100 г/л.

По окончании реакции реакционную смесь можно переработать, например, экстрагируя реакционную смесь органическим растворителем и затем удаляя растворитель перегонкой.

Через 24 часа примерно 90-98% использованного андростен-3,17-диона превращается в 17-β-гидрокси-1,4-андростадиен-3-он.

За превращением 1,4-андростадиен-3,17-диона в 17-β-гидрокси-1,4-андростадиен-3-он наблюдают с помощью газовой хроматографии. Для этого применяется газовый хроматограф Autosystem XL от Perkin Elmer, оборудованный масс-спектрометром с FS-капиллярной колонкой Optima-5-MS (Machery-Nagel, Düren, Германия), и гелий в качестве газа-носителя.

4. Окисление хенолитохолевой кислоты до кетолитохолевой кислоты

A) Регенерация кофермента посредством ADH из Thermoanerobium brockii/двухфазная система

Для синтеза 3α-гидрокси-7-оксо-5-β-холановой кислоты (кетолитохолевой кислоты) к 0,4 мл буфера (100 мМ калийфосфатного буфера, pH 8,5, 1 мМ MgCl₂, 10% глицерина), содержащего 0,1 мг NADP, 10 мг влажной биомассы E.coli, содержащей сверхэкспрессированную 7-α-гидроксистероидную дегидрогеназу из Clostridiem scindens (Pubmed AAB61151), и 5 мг влажной биомассы E.coli, содержащей сверхэкспрессированную спиртовую дегидрогеназу из Thermoanerobium brockii, добавляют 100 мг 3α-7α-дигидрокси-5-β-холановой кислоты (хенодеоксихолевой кислоты) в 0,5 мл метилизобутилкетона. Смесь выдерживают 24 часа при комнатной температуре и при постоянном перемешивании. Концентрация кетолитохолевой кислоты во всем реакционном объеме составляет около 100 г/л.

Через 24 часа более 80% использованной хенодеоксихолевой кислоты превратилось в кетолитохолевую кислоту.

За реакцией кетолитохолевой кислоты в хенодеоксихолевую кислоту наблюдают с помощью тонкослойной хроматографии.

B) Регенерация кофермента посредством ADH из лактобацилл (DE 10119274)/двухфазная система

Для синтеза 3α-гидрокси-7-оксо-5-β-холановой кислоты (кетолитохолевой кислоты) к 0,15 мл буфера (100 мМ калийфосфатный буфер, pH 7,5, 1 мМ MgCl₂, 10% глицерина), содержащему 0,1 мг NADP, 10 мг влажной биомассы E.coli, содержащей сверхэкспессированную 7-α-гидроксистероидную дегидрогеназу из Clostridiem scindens (Pubmed AAB61151), и 5 мг влажной биомассы E.coli, содержащей сверхэкспрессированную спиртовую дегидрогеназу из лактобацилл (DE 10119274), добавляют 100 мг 3α-7α-дигидрокси-5-β-холановой кислоты (хенодеоксихолевой кислоты) в 0,7 мл метилизобутилкетона. Смесь выдерживают 24 часа при комнатной температуре и при постоянном перемешивании. Концентрация кетолитохолевой кислоты во всем реакционном объеме составляет около 100 г/л.

Через 24 часа более 90% использованной хенодеоксихолевой кислоты превращается в кетолитохолевую кислоту.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ энантиоселективного ферментативного восстановления оксостероидных соединений общей формулы I и формулы II, представленных в описании изобретения. Оксостероидное соединение в реакционной смеси в концентрации ≥50 г/л восстанавливают гидроксистероидной дегидрогеназой в присутствии кофактора NADH или NADPH. Окисленный кофактор NAD или NADP, образуемый гидроксистероидной дегидрогеназой, непрерывно восстанавливается через окисление вторичного спирта или через окисление С₄-С₆-циклоалканола. Для окисления вторичного спирта или циклоалканола используется дополнительная оксидоредуктаза/спиртовая дегидрогеназа. Также предложен способ энантиоселективного ферментативного окисления гидроксистероидных соединений общей формулы I или гидроксистероидных соединений, являющихся производными желчной кислоты. Гидроксистероидное соединение в реакционной смеси в концентрации ≥50 г/л окисляют гидроксистероидной дегидрогеназой в присутствии кофактора NAD или NADP. Восстановленный кофактор NADH или NADPH, образуемый гидроксистероидной дегидрогеназой, непрерывно регенерируется через восстановление кетосоединения или через восстановление С₄-С₆-циклоалканона. Для восстановления кетосоединения или циклоалканона используется дополнительная оксидоредуктаза/спиртовая дегидрогеназа. Изобретения позволяют окислять/восстанавливать исходные гидроксистероидные/оксостероидные соединения с выходом более 90% и с высоким TTN кофакторов ≥10³. 2 н. и 16 з.п. ф-лы.

1. Способ энантиоселективного ферментативного восстановления оксостероидных соединений общей формулы I

где
R₁ водород, метильная группа, гидроксигруппа или оксогруппа,
R₂ водород, метильная группа, гидроксигруппа или оксогруппа,
R₃ водород, гидроксигруппа, оксогруппа или метильная группа,
R₄ водород или гидроксигруппа,
R₅ водород, остаток -COR₁₀, где R₁₀ представляет собой незамещенную или замещенную гидроксигруппой С1-С4-алкильную группу, или замещенную или незамещенную С1-С4-карбоксиалкильную группу,
или R₄ и R₅ вместе означают оксогруппу,
R₆ водород, метильная группа, гидроксигруппа или оксогруппа,
R₇ водород, метильная группа, гидроксигруппа или оксогруппа,
R₈ водород, метильная группа или галогенид, и
R₉ водород, метильная группа, гидроксигруппа, оксогруппа или галогенид,
причем по меньшей мере один из R₁, R₂, R₄+R₅, R₆, R₈ или R₉ означает оксогруппу, или R₅ является остатком -COR₁₀, а структурный элемент

означает бензольное кольцо или С6-кольцо с 0, 1 или 2 двойными связями С-С, или формулы II (кетолитохолевая кислота)

причем оксостероидное соединение восстанавливают гидроксистероидной дегидрогеназой в присутствии кофактора NADH или NADPH, отличающийся тем, что
a) оксостероидное соединение присутствует в реакционной смеси в концентрации ≥50 г/л,
b) окисленный кофактор NAD или NADP, образуемый гидроксистероидной дегидрогеназой, непрерывно регенерируется через окисление вторичного спирта общей формулы R_XR_YCHOH, где R_X, R_Y независимо друг от друга означают разветвленный или неразветвленный C₁-C₈-алкил и С_общ≥3, или через окисление С₄-С₆-циклоалканола, и
c) для окисления вторичного спирта общей формулы R_XR_YCHOH или циклоалканола используется дополнительная оксидоредуктаза/спиртовая дегидрогеназа.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве вторичного спирта общей формулы R_XR_YCHOH используют 2-пропанол, 2-бутанол, 2-пентанол, 4-метил-2-пентанол, 2-гексанол, 2-гептанол, 5-метил-2-гексанол или 2-октанол, а в качестве циклического спирта - циклогексанол.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что его осуществляют в водно-органической двухфазной системе.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что дополнительно применяется органический растворитель, как, например, диэтиловый эфир, третбутилметиловый эфир, диизопропиловый эфир, дибутиловый эфир, этилацетат, бутилацетат, гептан, гексан или циклогексан.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что TTN (total turn over number = моли восстановленного оксостероидного соединения на моль используемого кофактора) составляет ≥10³.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в пределах 2-96 ч по меньшей мере 50% используемого оксостероидного соединения восстанавливается до гидроксистероидного соединения.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве оксостероидного соединения используют дексаметазон (формула III)

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве оксостероидного соединения используют 4-андростен-3,17-дион (формула IV)

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве оксостероидного соединения используют 1,4-андростадиен-3,17-дион (формула V)

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве оксостероидного соединения используют эстрон (формула VI)

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве оксостероидного соединения используют прегненолон (формула VII)

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве оксостероидного соединения используют кортизон (формула VIII)

13. Способ энантиоселективного ферментативного окисления гидроксистероидных соединений общей формулы I

где
R₁ водород, метильная группа, гидроксигруппа или оксогруппа,
R₂ водород, метильная группа, оксогруппа или гидроксигруппа,
R₃ водород, гидроксигруппа, оксогруппа или метильная группа,
R₄ водород или гидроксигруппа,
R₅ водород, остаток -COR₁₀, причем R₁₀ означает незамещенную или
замещенную гидроксигруппой С1-С4-алкильную группу или замещенную или незамещенную С1-С4-карбоксиалкильную группу,
или R₄ и R₅ вместе означают оксогруппу,
R₆ водород, метильная группа, оксогруппа или гидроксигруппа,
R₇ водород, метильная группа, оксогруппа или гидроксигруппа,
R₈ водород, метильная группа или галогенид, и
R₉ водород, метильная группа, гидроксигруппа, оксогруппа или галогенид,
причем по меньшей мере одно из R₁, R₂, R₄, R₆, R₇, R₈ или R₉ означает гидроксигруппу, а структурный элемент

означает бензольное кольцо или С6-кольцо с 0, 1 или 2 двойными связями С-С,
или гидроксистероидных соединений, являющихся производными желчной кислоты, как холевая кислота, хенодезоксихолевая кислота, 12-оксохолевая кислота, 3-гидрокси-12-оксохолевая кислота, кетолитохолевая кислота,
причем гидроксистероидное соединение окисляют гидроксистероидной дегидрогеназой в присутствии кофактора NAD или NADP, отличающийся тем, что
a) гидроксистероидное соединение присутствует в реакционной смеси в концентрации ≥50 г/л,
b) восстановленный кофактор NADH или NADPH, образуемый гидроксистероидной дегидрогеназой, непрерывно регенерируется через восстановление кетосоединения общей формулы R_XR_YCO, где R_X, R_Y независимо друг от друга означают разветвленный или неразветвленный С₁-С₈-алкил, и С_общ≥3, или через восстановление С₄-С₆-циклоалканона, и
с) для восстановления кетосоединения общей формулы R_XR_YCO или циклоалканона используется дополнительная оксидоредуктаза/спиртовая дегидрогеназа.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что в качестве кетона общей формулы R_XR_YCO применяется ацетон, 2-бутанон, 2-пентанон, 4-метил-2-пентанон, 2-гексанон, 2-гептанон, 5-метил-2-гексанон или 2-октанон, а в качестве циклоалканона используется циклогексанон.

15. Способ по пп.13 или 14, отличающийся тем, что его осуществляют в водно-органической двухфазной системе.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что дополнительно применяется органический растворитель, как, например, диэтиловый эфир, третбутилметиловый эфир, диизопропиловый эфир, дибутиловый эфир, этилацетат, бутилацетат, гептан, гексан или циклогексан.

17. Способ по п.13, отличающийся тем, что TTN (total turn over number = моли окисленного гидроксистероидного соединения на моль используемого кофактора) составляет ≥10³.

18. Способ по п.13, отличающийся тем, что в пределах 2-96 ч по меньшей мере 50% используемого гидроксистероидного соединения окисляется в оксостероидное соединение.