СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 17-ОКСОСТЕРОИДОВ Российский патент 1997 года по МПК C12P33/16 

Изобретение касается способа получения 17-оксостероидов ферментативным окислением 17 β -гидроксистероидов.

Способы ферментативного получения 17-оксостероидов известны давно. Уже в 1938 г. Ферцелоне и Момоли описали способ получения 4-андростен-3,17-диона путем ферментации 5-андростен-3b, 17b-диола (Ber, 71, 1938, 152 155). Этот способ дает высокие выходы целевого продукта, если подобраны соответствующие микроорганизмы (пат. Греции 87.068, реф. С.А. 54, 1960, 2441). Имеется также много публикаций, в которых описано, что можно получать 17-оксостероиды (как 4-андростен-3,17-дион, 1,4-андростадиен-3,17-дион или 3-гидрокси-1,3,5 (10)-экстратриен-17-он) с получением высоких выходов путем ферментативного отщепления боковых цепей субстрата, которые в 17b-положении несут углеводородную цепь.

О способах, с помощью которых можно окислять 17b-гидроксистероиды с хорошим выходом микробиологически до 17-оксистероидов без дополнительного превращения стероида, известно очень мало. В М. Велч и С. Нейсгем описали способ, который должен позволить экстрадиол превратить в эстрон с выходом 95% но этот способ нельзя воспроизвести, так как применяемые этими авторами микроорганизмы не доступны общественности (Compt. Rend. Soc. Biol. 142, 1948, 1074).

Но существует значительная потребность в создании такого рода ферментативного способа, так как химические способы окисления являются действительно дорогостоящими. Дополнительно эти химические способы обладают тем недостатком, что они проводятся с помощью реагентов, таких как пиридин и триокись серы, переносимость окружающей средой которых является проблематичной.

Было обнаружено, что 17-оксостероиды можно получить неожиданно с высокими выходами из 17b-гидроксистероидов, если применять для ферментации 17b-стероидов бактериальные культуры специальных микобактерий spec. NRRL B-3805, микобактерии spec. NRRL B-3683, микобактерии phlei NRRL B-8154 или микобактерии fortuitum NRRL B-8153.

Способ согласно изобретению проводят при таких же условиях ферментации, которые применяют в случае известных микробиологических превращений с культурами бактерий.

В применяемых обычно для бактериальных культур условиях выращивают погруженную культуру в подходящей питательной среде при аэрации. Затем к культуре добавляю субстрат (в подходящем растворителе или в эмульгируемой форме) и ферментируют до тех пор, пока не будет достигнуто максимальное превращение субстрата.

Подходящими растворителями для субстрата являются метанол, этанол, гликоль-монометиловый эфир, диметилформамид или диметилсульфоксид. Эмульгирование субстрата может быть вызвано тем, что субстрат вдувают в микронизированной форме или в смешивающем с водой растворителе (как метанол, этанол, ацетон, монометиловый эфир гликоля, метилформамид или диметилсульфоксид) растворяют при сильном перемешивании (предпочтительно в дистиллированной воде), который получают с помощью обычных эмульгаторов. Подходящими эмульгаторами являются неионогенные эмульгаторы, как например аддукты окиси этилена или эфиры жирных кислот полигликолей. В качестве подходящих эмульгаторов следует назвать торговые смачивающие средства, например, такие тегин, твин и шпан.

Оптимальные концентрации субстратов, время добавления субстрата и продолжительность ферментации зависят от типа переменяемого субстрата и микроорганизмов и условий ферментации. Эти величины могут быть определены, как это вообще требуется в случае микробиологических превращений стероидов, в отдельных случаях с помощью предварительных опытов, известных специалистам. Для проведения способа согласно изобретению в качестве субстрата применяют предпочтительно 17b-гидроксистероиды общей формулы I

в которой R₁ означает атом водорода или метильную группу и St символизирует остаток производного эстран-17β-ола, содержащий до 5 не кумулированных двойных связей, замещенный в положении 3 фенольной гидроксильной группой, низшей алкоксильной группой, низшей 1-алкокси-алкильной группой, 2-тетрагидро-пиранилокси-группой, или низшей алкилендиоксигруппой, а также в случае необходимости замещенной в положении 5, 10 эпоксигруппой и в положении 19 в случае необходимости метильной группой.

Под низшей алкокси-группой следует понимать предпочтительно группы, которые несут до 4 C-атомов. Подходящими алкоксигруппами являются например метокси- или трет-бутокси-группы. Под низшими 1-алкокси-алкокси-группами следует понимать предпочтительно низшая алкокси-метокси-группа с алкокси-группой, имеющей до 4 C-атомов. В качестве примеров следует назвать 1-метокси-метокси-группу. Под низшей алкилендиокси-группой следует понимать предпочтительно группировку, имеющую 2 6 C-атомов как например этилендиоксигруппу, или 2,2-диметил-пропилендиокси-группу.

Субстраты, пригодные например для проведения способа согласно изобретению, это например производные эстран-17b-ола общей формулы 1a

в которой R₁ имеет вышеуказанные значения, R₂ означает атом водорода или алкильную группу, содержащую до 4 C-атомов и символизирует часть формулы
Образующиеся из этих субстратов производные эстран-17-она, предпочтительно полученные из них отщеплением эфира 3-гидроксисоединения являются известными по фармакологическому действию и могут быть кроме того восстановлены известным методом из соответствующих 17α-гидроксисоединений или переведены в соответствующие 17b-гидрокси-17a-этинильные соединения.

Подходящими субстратами являются, кроме того, производные эстрана общей формулы 1b

в которой символизирует простую связь или двойную связь, R₁ имеет вышеуказанные значения, R₃ представляет собой алькильную группу максимально с 4 C-атомами.

Полученные из этих соединений 17-оксостероиды могут служить например, для получения фармакологически эффективного 17-α-этинил-17b- гидрокси-4-эстрен-3-она или их 18-метилгомологов.

Следует упомянуть также субстраты общей формулы 1c

в которой R₁ имеет вышауказанные значения, R₄ атом водорода или метильная группа, R₅ и R₆ вместе символизируют низшую алкилдиокси-группу, или R₅ атом водорода и R₆ низшая алкоксильная группа, низшая 1-алкоксиалкокси-группа или 2-тетрагидропиранильная группа.

Полученные из этих соединения 17-оксостероиды могут быть переработаны дальше равным образом как и соединения из производных эстран-17β-ола общей формулы 1c; но с другой стороны, они могут служить для получения производных прегнана, как действительно известно специалистам.

И наконец, следует упомянуть также производные эстран-17b-ола общей формулы Id

в которой R₁ имеет вышеназванные значения, R⁹ атом водорода, а также R₇ и R₈ вместе означают низшую алкилендиокси-группу или R₇ и R₈ означают два атома водорода или вместе углерод углеродную связь и R₈ представляет собой низшую алкокси-группу, низшую алкокси-алкокси-группу или 2-тетрагидропиранилокси-группу.

Полученные из этих соединений кетоны согласно способу, описанному в европейской заявке на патент EP-А 0129499, могут быть переведены в антигестагенно действующие стероиды.

Пример 1.

а) Колбу Эрленмейера объемом 500 мл, содержащую 100 мл питательной среды из 1% дрожжевого экстракта, 0,45% NaHPO₄ • 2H₂O, 0,34% KH₂PO₄, 0,2% твина 80 с pH 6,7 засевают суспензией микобактерий spec. NRRL В-3683 культуры и встряхивают 72 ч при 30^oC со скоростью 180 вращений в минуту.

б) 50 колб Эрленмейера объемом 100 мл смотря по обстоятельствам с 20 мл стерильной питательной среды, содержащей 0,5% Cornsteep Liguor, 0,05% моногидрата глюкозы, 0,2% дрожжевого экстракта с pH 7,0 заполняли соответственно 1 мл микробактерий spec. погруженной культуры и 24 ч инкубировали на роторной качалке с 220 об./мин при 30^oC.

Затем к каждой культуре добавляют 0,02 г в 0,2 мл диметилформамида растворенный и стерилизованный 3,3-(2,2-диметилтриметилендиокси)-5,10 α-эпокси-5a-эфир-9-(11)-ен-17b-ол и ферментируют дополнительно 48 ч при 30^oC.

b)Объединенные культуры экстрагируют метилизобутилкетоном и экстракт концентрируют в роторном испарителе максимально при 50^oC в вакууме. Непосредственно после этиого проводят очистку путем хроматографирования через силикагель.

Таким образом получают 0,85 г 3,3-(2,2-диметилтриметилендиокси)-5,10a-эпокси-5a-эстер-9(11-ен-17b-она, который по HPLC идентичен с подлиной пробой.

Пример 2.

а) Получение выращиваемой культуры осуществляют как указано в примере 1а).

б) 50 колб Эрленмейера объемом 100 мл смотря по обстоятельствам с 20 мл стерильной питательной среды, содержащей 2,5% Consteep Eiguor, 0,25 соевой муки, 0,3% (Nh₄)₂ HPO₄, 0,25% твина 80 с pH 6,5 засевают соответственно с 1 мл разводимой культурой микобактерии spec. и 24ч инкубируют на роторной качалке с 220 оборотами в минуту при 30^oC.

Затем к каждой культуре добавляют 0,002 г в 0,2 мл диметилформамида растворенного и стерилизованного a-эквилола и ферментируют последующие 72 ч при 30^oC.

в) Выделение продукта осуществляют как описано в пункте 1в).

Получают таким образом 0,095 г эквилина, который по HPLC идентичен с подлинной пробой.

Использование: биотехнология, химия стероидов. Сущность изобретения: предложен способ получения 17-оксостероидов ферментативным окислением 17-гидроксистероидов, характеризующийся тем, что для ферментации применяют бактериальную культуру Mycobacterium Spec. NRRL B-3683. В качестве исходных используют3,3-/2,2-диметилтриметилендиокси/-5,10-α-эпокси-5-a-эфир-9-/11/-ен-17-b-ол или a-эквилол. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ получения 17-оксостероидов окислением 17 -β- гидроксистероидов с помощью микроорганизмов, отличающийся тем, что используют культуру Мycobacterium sp NRRL B -3683. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве исходного 17-β-гидроксистероида используют 3,3-(2,2-диметилтриметилендиокси) -5,10 α - эпокси-5 -α--эфир-9-(11)-ен-17-b-ол или a -эквилол.