СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ ПУЛОВ 26S- И 20S-ПРОТЕАСОМ ИЗ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ФРАКЦИИ КЛЕТОК Российский патент 2011 года по МПК C12N1/00 C07K14/00 C12Q1/68 

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано в исследованиях при разработке лекарственных препаратов нового поколения для лечения онкологических, нейродегенеративных , вирусных и других заболеваний.

Важную роль в поддержании функциональной активности клеток играют протеасомы. Протеасомы - это мультисубъединичные мультипротеиназные белковые комплексы. Все многообразие этих форм можно свести к двум основным пулам - 26S-

и 20S-протеасом. 26S-протеасомы состоят из протеолитической субчастицы 20S- и одной или двух регуляторных 19S-субчастиц. Протеасомы осуществляют строго контролируемый протеолиз и процессинг регуляторных белков и играют ключевую роль в основных клеточных процессах: продвижении клетки по фазам клеточного цикла, дифференцировке, апоптозе, проведении сигнала, иммунном ответе. Все органы и ткани млекопитающих содержат множественные формы протеасом, различающиеся структурой, спецификой гидролиза белков и, следовательно, физиологической ролью. Протеасомы присутствуют также в клетках злокачественных опухолей.

В настоящее время для лечения онкологических заболеваний используют противоопухолевое лекарство - бортезомиб (bortezomib, Velcade®), действующее на протеасомы. Бортезомиб вводят в кровоток пациентов и применяют в комплексе с другими противоопухолевыми средствами. Вместе с тем, действуя на тотальный пул протеасом всех органов, бортезомиб вызывает побочные эффекты: утомляемость, слабость, желудочно-кишечные нарушения, периферическую нейропатию и существенное ухудшение общего состояния пациентов.

Известно возрастание уровня 198-активатора 26S-протеасом в гепатоклеточной карциноме. Злокачественные опухоли, в т.ч. опухоли печени, характеризуются усиленным обменом белка, который требует, в свою очередь, увеличенного содержания протеолитических ферментов, в частности 26S-протеасом [Астахова Т.М., Делоне Г.В., Люпина Ю.В., Абрамова Е.Б., Урываева И.В., Шарова Н.П. Изменение пула протеасом в процессе злокачественной трансформации клеток печени мыши. // Acta naturae, 2010 г., №3, стр.91-96//]. Результаты исследований указывают на перспективность использования 19S-активатора 26S-протеасом, избыточно экспрессирующегося в злокачественных новообразованиях в качестве мишени для разработки новых противоопухолевых лекарств.

Для снижения побочных эффектов при разработке лекарственных препаратов нового поколения необходимо изучение действия лекарственных средств дифференцирование на 26S-протеасомы и 20S-протеасомы.

Известен способ получения протеасом в кристаллическом виде [патент WO 9842829, МПК C12N 9/60], в котором используют следующие этапы очистки: хроматография на колонке с гидроксиапатитом, гельфильтрация, FPLS-системой. Затем протеасомы кристаллизуют. При этом частично разрушается структура 26S-протеасомы.

Известен способ очистки протеасомы [патент US 6294363, МПК C07K 14/39]. Этот метод основан на иммобилизации пептидов с последовательностью аминокислот, гомологичного убиквинтину, к колоночному носителю (сорбенту) и связывании 26S-протеасом с такими колонками. Однако этим методом выделяют только 26S-протеасомы, а очистка 20S-протеасомы не предусмотрена.

Известен способ приготовления препарата протеасомы [JP 1309686, МПК C07K 14/39], в котором описано выделение субъединиц протеасомы только в неактивной форме.

Известен способ очистки протеасом [JP 4077498, МПК C12NK 15/09], в котором использовали гель-фильтрацию и колоночную хроматографию на гидроксиапатите и сорбенте с иммобилизированным гепарином. Все эти процедуры приводят к частичному разрушению 26S-протеасом и поэтому непригодны для аналитических исследований.

Известен способ выделения только 26S-протеасомы [JP 5292964, МПК A61K 38/46], в котором использовали гель-фильтрацию. Этот метод приводит к частичному разрушению 26S-протеасом и не позволяет получить фракцию 26S-протеасом, свободную от примеси 20S-протеасом.

Известен также способ выделения 26S-протеасомы [JP 6022759, МПК A61B 10/00], в котором использовали ультрацентрифугирование. Но для аналитических исследований этот метод применять нельзя, так как значительная часть 26S-протеасом остается в смеси с 20S-протеасомами.

Известно выделение протеасом из печени (нелимфоидный орган) и селезенки (лимфоидный орган) белых крыс породы Wistar разных возрастов постнатального развития, печени, селезенки и легких здоровых мышей линии Balb/c и развившейся семидневной асцитной карциномы Krebs-II, привитой мышам линии Balb/c [Астахова Т.М. Изменение пула протеасом в постнатальном развитии и в злокачественно трансформированных клетках грызунов. // Автореферат диссертации, канд. биол. наук, Москва, 2007//]. Пулы 26S- и 20S-протеасом разделяли методом двухэтапного фракционирования осветленных гомогенатов органов разным количеством сульфата аммония. При добавлении сульфата аммония, взятого в количестве до 0-40% от насыщения, осаждались, преимущественно 26S-протеасомы, а при 40-70% от насыщения осаждались 20S-протеасомы. Однако при этом получают пулы с большим количеством балластных белков, что затрудняет дальнейшие исследования.

На стадии очистки протеасом в процессе их разделения происходит разрушение

26S-протеасом на 20S- и 19S-субчастицы, что искажает результаты исследований.

При разработке метода разделения пулов 26S- и 20S-протеасом исходили из известного факта, что формы 26S и 20S осаждаются при разном количестве сульфата аммония. При 0-40% от насыщения осаждаются, преимущественно, 26S-протеасомы, при 40-70% - 20S-протеасомы [Ganoth et al., 1988; Eytan et al., 1989; Ben-Shahar et al., 1999]. После фракционирования сульфатом аммония ранее проводили дальнейшую очистку как пула 26S-, так и пула 20S-протеасом различными методами. В процессе этой очистки 26S-протеасомы в большей или меньшей степени разрушались.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является разработка способа разделения 26S- и 20S-протеасом в нативном виде и в тех количествах, в которых они существуют в живых клетках, при котором структура 26S-протеасом сохранялась бы максимально неповрежденной.

Для решения поставленной задачи способ разделения пулов 26S- и 20S-протеасом из цитоплазматической фракции клеток включает гомогенизацию ткани в буфере, содержащем 30 мМ трис-HCl, pH 7.5, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол, 10%-ный глицерин, 5 мМ MgCl₂, 2 мМ АТФ, 10 мМ Na₂S₂O₅, 0.5 мкг/мл лейпептин, 1 мкг/мл пепстатин и 1 мкг/мл апротинин в соотношении 1:3 при 0-4°C, центрифугирование гомогената при 105000 g в течение 60-90 мин при 0-4°C с получением цитоплазматической фракции, инкубацию цитоплазматической фракции с 10 мМ фосфокреатина и 10 мкг/мл фосфокреатинкиназы в течение 25-45 мин при 35°C и разделение белков цитоплазматической фракции сульфатом аммония в три этапа, на первом этапе добавляют сульфат аммония до 38% от насыщения и центрифугируют для отделения осадка, содержащего пул 26S-протеасом, на втором этапе к надосадочной жидкости добавляют сульфат аммония до 42% от насыщения и центрифугируют для отделения осадка, содержащего баластные белки, на третьем этапе к надосадочной жидкости добавляют сульфат аммония до 70% от насыщения и центрифугируют для отделения осадка, содержащего пул 20S-протеасом, причем центрифугирование для отделения осадков проводят при 10000 g в течение 30 мин при 0-4°C, при этом осадок, содержащий пул 26S-протеасом, растворяют в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl, pH 7.5, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол, 50%-ный глицерин, 5 мМ MgCl₂, 2 мМ АТФ, 10 мМ Na₂S₂O₅, 0.5 мкг/мл лейпептин, 1 мкг/мл пепстатин, 1 мкг/мл апротинин, а осадок, содержащий пул 20S-протеасом, растворяют в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl, pH 7.5, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол, 50%-ный глицерин, 10 мМ Na₂S₂O₅, 0.5 мкг/мл лейпептин, 1 мкг/мл пепстатин, 1 мкг/мл апротинин.

В частном варианте инкубацию раствора, содержащего пул 268-протеасом, проводят с 10 мМ фосфокреатина и 10 мкг/мл фосфокреатинкиназы в течение 25-45 мин при 35°C для восстановления структуры 26S-протеасомы.

В другом частном варианте сульфат аммония добавляют порциями в течение 20 мин на магнитной мешалке и далее перемешивают в течение 20 мин.

Для решения последующих задач разделение пулов 26S- и 20S-протеасом ведут с использованием сульфата аммония в качестве единственного приема разделения пулов протеасом.

Разделение белков цитоплазматической фракции сульфатом аммония проводят в три этапа. На первом этапе добавляют сульфат аммония до 38% от насыщения, что позволяет при выделении пула 26S-протеасом без его потери избавиться от части примесного белка, мешающего дальнейшим исследованиям. На втором этапе разделения добавляют сульфат аммония до 42% от насыщения. Добавление сульфата аммония от 38% до 42% от насыщения позволяет отделить мешающие проведению исследований балластные примесные белки, имеющие молекулярную массу в диапазоне молекулярных масс субъединиц протеасом. На третьем этапе добавляют сульфат аммония до 70% от насыщения. Добавление сульфата аммония от 42% до 70% от насыщения позволяет получить пул 20S-протеасом без его потери, свободный от белков, мешающих дальнейшим исследованиям.

Центрифугорование гомогената с получением цитоплазматической фракции ведут в течение 60-90 мин, так как за это время из гомогената осаждаются ядра и микросомальная фракция. Процесс центрифугорования ведут при 0-4°C, так, как при этих температурах снижена активность присутствующих ферментов.

Инкубацию цитоплазматической фракции и раствора, содержащего пул 26S-протеасом, ведут в течение 25-45 мин. Это время является оптимальным для восстановления структуры 26S-протеасомы при 35°C.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Пример.

Ткань печени крысы промывали в стандартном фосфатном солевом буфере, обсушивали на фильтровальной бумаге, взвешивали, отделяли 100 мг и гомогенизировали в гомогенизаторе стекло-стекло (Braun Melsungen) в 300 мкл буфера, содержащего 30 мМ трис-HCl (pH 7.5), 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол, 10%-ный глицерин, 5 мМ MgCl₂, 2 мМ АТФ, 10 мМ Na₂S₂O₃, 0.5 мкг/мл лейпептин, 1 мкг/мл пепстатин и 1 мкг/м апротинин при 4°C.

Полученный гомогенат центрифугировали при 105000 g в течение 60 мин при 4°C и собрали 250 мкл надосадочной жидкости (цитоплазматической фракции). При данных условиях центрифугирования ДНК и микросомальные структуры остаются в осадке.

Цитоплазматическую фракцию инкубировали с 10 мМ фосфокреатина и 10 мкг/мл фосфокреатинкиназы в течение 45 мин при 35°C для поддержания структуры 26S-протеасом.

Проводили разделение фракционирование белков цитоплазматической фракции с помощью сульфата аммония в три этапа. При этом фракцию (пул) 26S-протеасом получали при использовании сульфата аммония в диапазоне 0-38% от насыщения, а фракцию (пул) 20S-протеасом - при использовании сульфата аммония в диапазоне 42-70% от насыщения.

Этап 1. Получали фракцию 26S-протеасом с помощью сульфата аммония, взятого до 38% от насыщения: к 250 мкл осветленного гомогената добавляли 57,1 мг сухого сульфата аммония порциями в течение 20 мин на магнитной мешалке в ледяной бане. После полного растворения сульфата аммония препарат оставляли на магнитной мешалке еще на 20 мин для формирования нерастворимой в этих условиях фракции белков и затем центрифугировали при 10000 g в течение 30 мин при 4°C. Осадок, содержащий пул 26S-протеасом, растворяли в 300 мкл буфера (20 мМ трис-HCl, pH 7.5, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол, 50%-ный глицерин, 5 мМ MgCl₂, 2 мМ АТФ, 10 мМ Na₂S₂O₅, 0.5 мкг/мл лейпептина, 1 мкг/мл пепстатина, 1 мкг/мл апротинина), проводили инкубацию с 10 мМ фосфокреатина и 10 мкг/мл фосфокреатинкиназы в течение 45 мин при 35°C для восстановления структуры 26S-протеасом и хранили при -20°C в течение 4-5 месяцев.

Этап 2. К надосадачной жидкости добавляли сульфат аммония до 42% от насыщения: к 230 мкл надосадачной жидкости добавляли 9,9 мг сухого сульфата аммония и формировали осадок так же, как на этапе 1, и затем центрифугировали при 10000 g в течение 30 мин при 4°C. Получили осадок, содержащий балластные белки, и надосадачную жидкость (220 мкл). Осадок содержит балластный белок, который затрудняет дальнейшие исследования, например, при проведении электрофореза этот белок образует «шмир». Поэтому его исключали из дальнейшей работы. Итак, данный этап является важным для проведения последующих аналитических исследований протеасом.

Этап 3. Получали фракцию 20S-протеасом с помощью сульфата аммония в диапазоне 42-70% от насыщения: к 220 мкл надосадочной жидкости, полученной на втором этапе, добавляли 41 мг сухого сульфата аммония и формировали осадок так же, как на этапе 1, и затем центрифугировали при 10000 g в течение 30 мин при 4°C. Получили осадок и надосадачную жидкость. Осадок, содержащий пул 20S-протеасом, растворяли в 300 мкл буфера (20 мМ трис-HCl (pH 7.5), 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол, 50%-ный глицерин, 10 мМ Na₂S₂O₅, 0.5 мкг/мл лейпептина, 1 мкг/мл пепстатина, 1 мкг/мл апротинина) и хранили при -20°C в течение 6-7 месяцев. Надосадачную жидкость третьего этапа исключали из работы, так как он не содержал протеасом.

Далее проводили доказательство того, что фракция, полученная из осадка на первом этапе, содержит пул 26S-протеасом, а фракция, полученная из осадка на третьем этапе, содержит пул 20S-протеасом. Доказательство вели: 1) вестерн-блоттингом с использованием антител к субъединицам α1, 2, 3, 5, 6, 7, входящим в состав обоих пулов протеасом, и с использованием антител к субъединице Rpt6, входящей в состав 19S-субчастицы 26S-протеасом; 2) ингибиторным анализом химотрипсинподобной активности пулов 26S- и 20S-протеасом.

Предложенное изобретение позволит получать пулы 26S- и 20S-протеасом в нативном виде и в тех количествах, в которых они существуют в клетках, сохранить структуру 26S-протеасом в стабильном состоянии в течение 4-5 месяцев, а структуру 20S-протеасом - в течение 6-7 месяцев, а также позволит проводить аналитические исследования действия различных соединений, в том числе лекарственных, на цитоплазматические 26S- и 20S-протеасомы в разных клетках и органах in vivo и in vitro, что представляет ценность для фундаментальной науки и со временем может найти применение в практической медицине.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в исследованиях при разработке лекарственных препаратов нового поколения для лечения онкологических, нейродегенеративных и вирусных заболеваний. Проводят гомогенизацию ткани в буфере и центрифугирование при 105000 g в течение 60-90 мин при 0-4°С с получением цитоплазматической фракции, которую затем инкубируют с 10 мМ фосфокреатина и 10 мкг/мл фосфокреатинкиназы в течение 25-45 мин при 35°С. Белки цитоплазматической фракции разделяют сульфатом аммония в три этапа, на первом этапе добавляют сульфат аммония до 38% от насыщения и центрифугируют для отделения осадка, содержащего пул 26S-протеасом, на втором этапе к надосадочной жидкости добавляют сульфат аммония до 42% от насыщения и центрифугируют для отделения осадка, содержащего балластные белки, на третьем этапе к надосадочной жидкости добавляют сульфат аммония до 70% от насыщения и центрифугируют для отделения осадка, содержащего пул 20S-протеасом. Сульфат аммония добавляют порциями в течение 20 мин на магнитной мешалке и далее перемешивают в течение 20 мин. Изобретение позволяет разделить 26S- и 20S-протеасомы в нативном виде и выделить их в тех количествах, в которых они существуют в живых клетках, с сохранением максимально неповрежденной структуры 26S-протеасомы. 2 з.п. ф-лы.

1. Способ разделения пулов 26S- и 20S-протеасом из цитоплазматической фракции клеток, включающий гомогенизацию ткани в буфере, содержащем 30 мМ трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол, 10%-ный глицерин, 5 мМ MgCl₂, 2 мМ АТФ, 10 мМ Na₂S₂O₅, 0,5 мкг/мл лейпептин, 1 мкг/мл пепстатин и 1 мкг/мл апротинин в соотношении 1:3 при 0-4°С, центрифугирование гомогената при 105000 g в течение 60-90 мин при 0-4°С с получением цитоплазматической фракции, инкубацию цитоплазматической фракции с 10 мМ фосфокреатина и 10 мкг/мл фосфокреатинкиназы в течение 25-45 мин при 35°С и разделение белков цитоплазматической фракции сульфатом аммония в три этапа, на первом этапе добавляют сульфат аммония до 38% от насыщения и центрифугируют для отделения осадка, содержащего пул 26S-протеасом, на втором этапе к надосадочной жидкости добавляют сульфат аммония до 42% от насыщения и центрифугируют для отделения осадка, содержащего балластные белки, на третьем этапе к надосадочной жидкости добавляют сульфат аммония до 70% от насыщения и центрифугируют для отделения осадка, содержащего пул 20S-протеасом, причем центрифугирование для отделения осадков проводят при 10000 g в течение 30 мин при 0-4°С, при этом осадок, содержащий пул 26S-протеасом, растворяют в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол, 50%-ный глицерин, 5 мМ MgCl₂, 2 мМ АТФ, 10 мМ Na₂S₂O₅, 0,5 мкг/мл лейпептин, 1 мкг/мл пепстатин, 1 мкг/мл апротинин, а осадок, содержащий пул 20S-протеасом, растворяют в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол, 50%-ный глицерин, 10 мМ Na₂S₂O₅, 0,5 мкг/мл лейпептин, 1 мкг/мл пепстатин, 1 мкг/мл апротинин.

2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что инкубацию раствора, содержащего пул 26S-протеасом, проводят с 10 мМ фосфокреатина и 10 мкг/мл фосфокреатинкиназы в течение 25-45 мин при 35°С для восстановления структуры 26S-протеасомы.

3. Способ по п.1, характеризующийся тем, что сульфат аммония добавляют порциями в течение 20 мин на магнитной мешалке и далее перемешивают в течение 20 мин.