СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОЙ ГЕТЕРОГЕННОЙ ПОПУЛЯЦИИ КЛЕТОК КОЖИ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/48 C12N5/71 

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для получения и исследования жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи.

Наиболее близким к предлагаемому является способ разделения пулов 26S- и 20S-протеасом из цитоплазматической фракции клеток [Патент РФ №2427623, кл. C12N 1/00, С07K 14/00, C12Q 1/68, 2011], включающий гомогенизацию ткани в буфере, центрифугирование гомогената при 105000 g в течение 60-90 мин при 0-4°С с получением цитоплазматической фракции, инкубацию цитоплазматической фракции с 10 мМ фосфокреатина и 10 мкг/мл фосфокреатинкиназы в течение 25-45 мин при 35°C и разделение белков цитоплазматической фракции.

Известной причиной, препятствующей достижению технического результата, обеспечиваемого предлагаемым изобретением, является невозможность разделения клеток кожи с сохранением их жизнедеятельности.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является получение жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи.

При осуществлении изобретения поставленная задача решается за счет достижения технического результата, который заключается в разделении клеток кожи с сохранением их жизнедеятельности.

Указанный технический результат достигается способом получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи, включающим в себя забор биоптата кожи на глубину 2 мм, гомогенизацию ткани в 0,9% водном растворе хлорида натрия при температуре +23…+25°C, извлечение гомогената вначале отсасыванием стерильным шприцем, а затем трижды вымыванием рабочей камеры гомогенизатора 0,9% водным раствором хлорида натрия, фильтрование гомогената через инертную фильтровальную перегородку с диаметром пор 20 мкм, центрифугирование гомогената при 400 g в течение 5 минут при температуре +23…+25°C.

Забор биоптата кожи проводят на глубину 2 мм, для того чтобы практически не захватывать подкожно жировой слой, но забирать эпидермис и дерму. Это позволяет проводить исследование без проведения ферментной обработки, что снижает опасность действия фермента и благоприятно сказывается на жизнеспособности клеток кожи и исключает их возможную активацию.

Гомогенизацию ткани проводят в 0,9% водном растворе хлорида натрия при температуре +23…+25°C. 0,9% водный раствор хлорида натрия является наиболее близкой средой к условиям жизнедеятельности клетки кожи в живом организме. При использовании других веществ возможно их поступление через мембрану внутрь клетки и последующее ее разрушение или наоборот, диффузия раствора из клетки наружу с последующей ее гибелью. Температура +23…+25°C является оптимальной для данного способа.

Для того чтобы полностью извлечь все клетки кожи из рабочей камеры гомогенизатора проводят вначале отсасывание гомогената стерильным шприцем, а затем трижды вымывают 0,9% водным раствором хлорида натрия.

Фильтрование гомогената проводят через инертную фильтровальную перегородку с диаметром пор 20 мкм, чтобы отделить строму и пропустить все клетки кожи в раствор. Если диаметр пор будет меньше 20 мкм, то в фильтре задержатся некоторые крупные клетки кожи, например фибробласты или макрофаги. Если диаметр пор будет больше 20 мкм, то не отфильтруется строма, что негативно повлияет на результаты дальнейших исследований. В качестве инертного материала фильтровальной перегородки может использоваться, например, нейлон.

Центрифугирование гомогената проводят при 400 g в течение 5 минут при температуре +23…+25°C. При данных условиях центрифугирования осаждаются все нужные клетки кожи и удаляется надосад очная жидкость.

Пример осуществления предлагаемого способа приведен ниже.

Забор биоптата кожи размером 2×2×2 мм проводили с ягодичной области человека с помощью дракара DERMO-PUNCH (2 мм) (STERYLAB, Италия). Далее биоптат кожи и 1 мл 0,9% водного раствора хлорида натрия помещали в рабочую камеру автоматической системы для механической гомогенизации ткани Medimachine (Becton Dickinson, США). Гомогенизацию ткани проводили в течение 30 секунд при температуре +23…+25°C. Затем извлекали гомогенат стерильным шприцем и трижды вымывали рабочую камеру гомогенизатора 0,9% водным раствором хлорида натрия по 1 мл.

После чего фильтровали гомогенат через фильтр для клеток Falcon (Becton Dickinson, США) с нейлоновой сетчатой структурой и диаметром пор 20 мкм. Далее центрифугировали гомогенат для удаления надосадочной жидкости при 400 g в течение 5 минут при температуре +23…+25°C.

После этого определяли жизнеспособность клеток с помощью витального красителя 7-amino-actinomycin D RUO (7AAD) (Beckman Coulter, США), анализируя на проточном цитофлюориметре Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США). Идентификацию клеток выполняли путем регистрации двух параметров: объема и светорассеяния в боковом направлении (SSLin) и регистрацией флуорисценции (7-AAD).

На чертеже представлена гистограмма количества жизнеспособных клеток в образце в результате предлагаемого способа.

Известно, что популяция клеток кожи считается жизнеспособной, если в ней содержится не менее 85% живых клеток. На гистограмме слева от вертикальной линии (у значения 10°) зарегистрированы живые клетки кожи, а справа мертвые. Также наблюдается гетерогенность популяции, т.к. клетки имеют разный объем, причем размеры клеток не превышают 20 мкм. Полученные данные показали, что в результате применения предлагаемого способа количество жизнеспособных клеток кожи в рассмотренном образце составило 90,0%.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить жизнеспособную гетерогенную популяцию клеток кожи для дальнейших исследований по подбору и испытанию лекарственных препаратов при лечении кожных заболеваний in vitro, выделения и культивирования отдельных популяций клеток и разработки лекарственных препаратов нового поколения.

Изобретение относится к области фармацевтики и биологии и представляет собой способ получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи, включающий забор биоптата кожи на глубину 2 мм, гомогенизацию ткани в 0,9% водном растворе хлорида натрия при температуре +23…+25°C, извлечение гомогената, фильтрование гомогената через инертную фильтровальную перегородку с диаметром пор 20 мкм, центрифугирование гомогената при 400 g в течение 5 минут при температуре +23…+25°C. Изобретение обеспечивает разделение клеток кожи с сохранением их жизнедеятельности. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи, включающий забор биоптата кожи на глубину 2 мм, гомогенизацию ткани в 0,9%-ном водном растворе хлорида натрия при температуре 23-25°C, извлечение гомогената, фильтрование гомогената через инертную фильтровальную перегородку с диаметром пор 20 мкм, центрифугирование гомогената при 400 g в течение 5 мин при температуре 23-25°C.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что извлечение гомогената проводят вначале отсасыванием стерильным шприцем, а затем трижды вымывают рабочую камеру гомогенизатора 0,9%-ным водным раствором хлорида натрия.