ГЕН PARK2 И СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЕГО МУТАЦИЙ Российский патент 2011 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается мутаций гена PARK2 и подбора к нему праймеров, а также использования полимеразной цепной реакции. Основным типом мутаций в этом гене являются делеции или дупликации отдельных экзонов гена или групп экзонов.

Ген PARK2 связан с развитием болезни Паркинсона. В настоящее время считается, что гомозиготность или компаундная гетерозиготность по мутациям в гене паркина является причиной развития заболевания у почти 50% больных ювенильным аутосомно-рецессивным паркинсонизмом и 5-10% больных со спорадической болезнью Паркинсона с ранним (до 50 лет) началом развития заболевания.

Среди нейродегенеративных заболеваний болезнь Паркинсона занимает второе место по частоте встречаемости после болезни Альцгеймера. В большинстве популяций мира идиопатическим паркинсонизмом болеет не менее 2-4% всех лиц старше 65 лет и не менее 1% всех лиц старше 50 лет. В последнее время наблюдается рост числа больных идиопатическим паркинсонизмом и снижение возраста дебюта заболевания. Заболевание имеет неуклонно прогрессирующее течение и характеризуется классической тетрадой клинических симптомов - низкочастотным тремором в состоянии покоя, ригидностью скелетных мышц рук и лица (пластический гипертонус), пониженной двигательной активностью (брадикинезией) и нарушением координации движений после сна (постуральной неустойчивостью). Нейродегенеративные изменения наблюдаются в первую очередь в дофаминэргических нейронах компактной части черной субстанции, базальных ядрах, покрышке среднего мозга. На более поздних стадиях развития заболевания процессы дегенерации распространяются на кору больших полушарий.

Прямое определение мутаций гена PARK2 может быть основой для диагностики болезни Паркинсона, в том числе на доклинической стадии.

Задачей настоящего изобретения является определение мутаций в гене PARK2, вызывающих болезнь Паркинсона.

Техническим результатом, достигаемым при осуществлении изобретения, является определение вызывающих болезнь Паркинсона делеций и дупликаций отдельных экзонов или групп экзонов гена паркина (PARK2) с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени в варианте TaqMan.

Указанный технический результат достигается тем, что проводится одновременная амплификация в одной пробирке одного из экзонов гена паркина и гена-свидетеля, в качестве которого выбран, например, ген бета-глобина человека. Для проведения амплификации экзонов гена паркина (PARK2) используют праймеры и любой флуоресцентно меченый зонд, например, 5′-AAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGG-3′ или тот же зонд с гасителем флуоресценции, например, с RTQ1 и последовательности экзонов со второго по двенадцатый с фланкирующими фрагментами интронов. Для визуализации продуктов амплификации зонды к экзонам гена паркина (PARK2) метили с 5′ конца зонда флуоресцентным красителем ROX. Для тушения флуоресценции красителя в составе зонда использовался RTQ1, пришиваемый на 3′ конец зонда. Последовательности праймеров и зондов приведены в таблице 1 (последовательности 1-33).

В качестве гена-свидетеля используется ген бета-глобина человека, последовательности праймеров и зонда, для которого приведены ниже (последовательности 34-36). Зонд на ген бета-глобина метили пришитым к 5' олигонуклеотида красителем FAM, а для тушения флуоресценции использовали пришитый на 3' конец зонда RTQ1.

Последовательность 34 5'-GTGCACCTGACTCCTGAGGAGA-3'

Последовательность 35 5'-CCTTGATACCAACCTGCCCAG-3'

Последовательность 36 5' FAM - AAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGG-RTQ1-3'

Полимеразную цепную реакцию проводят в реакционной смеси объемом 20 мкл, содержащей 2,5 мМ MgCl₂, по 8 пкМоль каждого из праймеров и по 4 пкМоль каждого из зондов, 8 нг геномной ДНК человека, 1,25 единицы ДНК полимеразы Taq для горячего старта. Одновременная полимеразная цепная реакция на один из экзонов гена паркина и ген-свидетель проводится в четыре этапа. При этом первый этап состоит из прогрева реакционной смеси при температуре 50°С в течение 2 минут. Второй этап состоит из денатурации реакционной смеси при 95°С в течении 15 минут. Третий этап состоит из денатурации реакционной смеси при 95°С в течение 15 секунд. Четвертый этап состоит из инкубации реакционной смеси при 61°С в течение 45 секунд. Этапы три и четыре повторяются последовательно в течение 35 циклов.

Технический результат также достигается за счет того, что для определения величины порогового цикла (Ct) амплификации для одновременно амплифицируемых экзона гена паркина и гена-свидетеля используется метод двойной производной. Далее для определения числа копий исследуемого экзона гена паркина проводят сопоставление величин порогового цикла для экзонов гена паркина и одновременно амплифицируемого с ним гена-свидетеля при помощи определяемого по уравнению 1 коэффициента R:

R_{паркин/бета-глобин}=2^-(ΔCt),

где (ΔCt)=[Ct бета-глобина (контрольный образец ДНК) - Ct паркина (контрольный образец ДНК)] - [Ct бета-глобина (образец ДНК больного) - Ct паркина PARK2 (образец ДНК больного)].

Величина этого коэффициента у лиц с отсутствием делеций экзонов гена паркина варьирует по каждому экзону от 0,7 до 1,2. У лиц с гетерозиготной делецией определенного экзона гена паркина величина коэффициента R для данного экзона может варьировать от 0,6 до 0,4. При гомозиготной делеции определенного экзона величина коэффициента снижается до 0-0,2. При дупликации определенного экзона величина коэффициента R для данного экзона может варьировать от 1,3 до 1,8.

Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.

Пример 1

Для создания новой диагностической системы для выявления делеций и дупликации отдельных экзонов гена паркина PARK2 была создана панель праймеров и зондов (табл.1).

Она была тестирована на контрольной выборке лиц без клинических признаков болезни Паркинсона в возрасте более 60 лет и на группе больных с болезнью Паркинсона, ранее типированных на наличие делеций и дупликаций в гене паркина с использованием других методов. При этом были отработаны оптимальные условия ПНР в реальном времени:

- прогрев реакционной смеси при температуре 50°С в течение 2 минут;

- денатурация реакционной смеси при 95°С в течение 15 минут;

- денатурация реакционной смеси при 95°С в течение 15 секунд;

- инкубация реакционной смеси при 61°С в течение 45 секунд.

Два последних этапа повторяются последовательно в течение 35 циклов.

Результаты этого анализа приведены в таблице 2. Из полученных данных видно, что у здоровых лиц без признаков Паркинсонизма для всех проанализированных экзонов величина коэффициента R, отражающего соотношение числа копий экзонов гена пакрина и гена бета-глобина, варьирует по каждому экзону от 0,7 до 1,2. Такая же вариабельность коэффициента R наблюдается по всем проанализированным экзонам гена паркина у трех больных с болезнью Паркинсона, у которых ранее не было выявлено делеций или дупликаций экзонов гена паркина PARK2.

У лиц с гетерозиготной делецией определенного экзона гена паркина величина коэффициента R для данного экзона может варьировать от 0,6 до 0,4. Такие больные с делениями экзонов 2, 3, 4. 5, 6, 7 приведены в таблице 2.

Пример 2

С использованием разработанного метода анализа делеций и дупликаций экзонов гена паркина PARK2 был проведен анализ группы из 64 больных болезнью Паркинсона с ранним (до 50 лет) началом развития патологического процесса. При этом у 55 больных не было выявлено каких-либо делеций или дупликаций. Для всех проанализированных экзонов величина коэффициента R, отражающего соотношение числа копий экзонов гена пакрина и гена бета-глобина, у этих больных варьировала по каждому экзону от 0,7 до 1,2.

У 9 больных были выявлены различные мутации с изменением числа копий экзонов гена паркина PARK2. Данные по этим больным приведены в таблице 3 к примеру 2.

При этом обнаружены:

двое больных с гомозиготными делециями экзона 3 (больной №5) и экзона 4 (больной №2);

двое больных с гетерозиготностью по дупликации экзона 5 (больные №8 и №9);

один больной с гетерозиготной делецией экзона 3 (больной №6);

четверо больных с протяженными делециями, захватывающими от двух до пяти экзонов гена паркина PARK2 (больные №1, №3, №4, №7).

Полученные результаты указывают на то, что разработанный новый способ определения делеций и дупликаций экзонов гена паркина PARK2 позволяет детектировать вызывающие болезнь Паркинсона делеции и дупликации гена паркина и отличается высокой чувствительностью, простотой и быстротой проведения анализа.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ диагностики делеций и дупликаций экзонов гена PARK2, включающий одновременную амплификацию одного из экзонов гена паркина и гена-свидетеля в исследуемых образцах геномной ДНК человека при помощи полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием фланкирующих экзон внешних праймеров и расположенного между праймерами флуоресцентно меченого гибридизационного зонда, где полимеразную цепную реакцию проводят в четыре этапа в следующем режиме: прогрев реакционной смеси при температуре 50°С в течение 2 минут, денатурация реакционной смеси при 95°С в течение 15 минут, денатурация реакционной смеси при 95°С в течение 15 секунд, инкубация реакционной смеси при 61°С в течение 45 секунд, два последних этапа повторяются последовательно в течение 35 циклов, при этом отсутствие делеций, наличие гетерозиготной или гомозиготной делеций или наличие дупликаций экзона констатируется по величине коэффициента R, который рассчитывается по формуле R=2^-(ΔCt), где ΔCt=[Ct гена-свидетеля (контрольный образец ДНК) - Ct паркина (контрольный образец ДНК)] - [Ct гена-свидетеля (образец ДНК больного) - Ct паркина PARK2 (образец ДНК больного)]. Изобретение позволяет определять мутации в гене PARK2. 13 з.п. ф-лы, 5 табл.

1. Способ диагностики делеций и дупликаций экзонов гена PARK2, включающий одновременную амплификацию в одной пробирке одного из экзонов гена паркина и гена-свидетеля в исследуемых образцах геномной ДНК человека при помощи полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием фланкирующих экзон внешних праймеров и расположенного между праймерами флуоресцентно меченого гибридизационного зонда, где полимеразную цепную реакцию проводят в четыре этапа в следующем режиме:
- прогрев реакционной смеси при температуре 50°С в течение 2 мин;
- денатурация реакционной смеси при 95°С в течение 15 мин;
- денатурация реакционной смеси при 95°С в течение 15 с;
- инкубация реакционной смеси при 61°С в течение 45 с, причем два последних этапа повторяются последовательно в течение 35 циклов, при этом отсутствие делеций, наличие гетерозиготной или гомозиготной делеций или наличие дупликаций экзона констатируют по величине коэффициента R, который рассчитывают по формуле R=2^-(ΔCt), где ΔCt=[Ct гена-свидетеля (контрольный образец ДНК) - Ct паркина (контрольный образец ДНК)] - [Ct гена-свидетеля (образец ДНК больного) - Ct паркина PARK2 (образец ДНК больного)].

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для амплификации отдельных экзонов гена паркина используют праймеры, приведенные в таблице 1.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для идентификации полученных с использованием указанных в п.2 праймеров фрагментов ДНК гена паркина применяют следующие зонды, приведенные в таблице 1.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что для мечения зондов на отдельные экзоны гена паркина используют флуоресцентный краситель ROX и гаситель флуоресценции RTQ 1.

5. Способ по п,1, отличающийся тем, что в качестве гена свидетеля используется ген бета-глобина человека.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что для амплификации гена-свидетеля используют следующие праймеры:
последовательность 34 5'-GTGCACCTGACTCCTGAGGAGA-3'
последовательность 35 5'-CCTTGATACCAACCTGCCCAG-3'.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что для идентификации полученных с использованием указанных в п.6 праймеров фрагментов ДНК гена-свидетеля применяют следующий зонд:
последовательность 36 5'-AAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGG-3'.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что для мечения зонда на ген-свидетель используют флуоресцентный краситель FAM и гаситель флуоресценции RTQ1.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что полимеразную цепную реакцию проводят в реакционной смеси объемом 20 мкл, содержащей 2,5 мМ MgCl₂, по 8 пкмоль каждого из праймеров и по 4 пкмоль каждого из зондов, 8 нг геномной ДНК человека, 1,25 единицы ДНК полимеразы Taq для горячего старта.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что для определения порогового числа циклов амплификации используют метод двойной производной.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что у лиц с отсутствием делеций экзонов гена паркина величина коэффициента R может варьировать по каждому экзону от 0,7 до 1,2.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что у лиц с гетерозиготной делецией определенного экзона гена паркина величина коэффициента R для данного экзона может варьировать от 0,6 до 0,4.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что у лиц с гомозиготной делецией определенного экзона гена паркина величина коэффициента R для данного экзона может варьировать от 0 до 0,2.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что у лиц с гетерозиготной
дупликацией определенного экзона гена паркина величина коэффициента
R для данного экзона может варьировать от 1,3 до 1,8.