Способ диагностики мукополисахаридоз-плюс синдрома Российский патент 2023 года по МПК G01N33/58 C12Q1/6806 C12Q1/6827 C12Q1/686 C12Q1/6876 C12Q1/6883 

Изобретение относится к области медицины и молекулярной биологии и может быть использовано для диагностики наследственного заболевания, а именно, мукополисахаридоз-плюс синдром (МПСПС).

Мукополисахаридозы (МПС) - это группа наследственных болезней обмена веществ, относящихся к лизосомным болезням накопления и связанных с дефицитом ферментов, ответственных за расщепление гликозаминогликанов (ГАГ) (см. Sun, M. Lysosomal storage disease overview / M. Sun // Ann Transl Med. - 2018. - Vol. 6, N 24. - P.476). Ранее в Республике Саха (Якутия) (Российская Федерация) была выявлена группа детей с МПС-подобным фенотипом. Все они были из якутских семей. Особенностями данных детей было наличие частых респираторных заболеваний, ранняя младенческая смертность, наличие ГАГ в моче, но при этом отсутствие снижения активности лизосомальных ферментов.

Проведенное научное исследование позволило выявить новое, не описанное ранее заболевание из группы наследственных болезней обмена с аутосомно-рецессивным типом наследования - МПСПС. Впервые были описаны клинические проявления нового тяжелого наследственного заболевания, приводящего к смертности в раннем детском возрасте (см. Gurinova, E.E., Maksimova, N.R., Sukhomyasova, A.L. Clinical Description of a Rare Autosomal Recessive Syndrome in the Yakut Children / E.E. Gurinova, N.R. Maksimova, A.L. Sukhomyasova // YMJ. - 2014. - Vol. 2. - P. 14-18). У детей с МПСПС наблюдаются грубые черты лица, скелетные аномалии, поражение сердца, контрактура суставов, отставание в психомоторном развитии. Заболевание названо как «плюс» в виду того, что помимо клинической картины МПС, у больных МПСПС наблюдаются дополнительные нарушения со стороны почек и гемопоэтической системы. К текущему времени лечение отсутствует. Прогноз неблагоприятный, большинство пациентов МПСПС умерло от кардиореспираторной недостаточности. Средняя продолжительность жизни пациентов с МПСПС составляет всего 20 месяцев (см. Vasilev, F., Sukhomyasova, A., Otomo, T. Mucopolysaccharidosis-Plus Syndrome / F. Vasilev, A. Sukhomyasova, T. Otomo // Int J Mol Sci. - 2020. - Vol. 21, N 2. - P. 421). В результате проведенного полноэкзомного секвенирования была установлена единственная молекулярно-генетическая причина заболевания - мутация c.1492C>T (p.R498W, rs767748011) в гене VPS33A (vacuolar protein sorting 33A) (см. Mutation in VPS33A affects metabolism of glycosaminoglycans: a new type of mucopolysaccharidosis with severe systemic symptoms / H. Kondo, N. Maksimova, T. Otomo et al. // Hum Mol Genet. - 2017. - Vol. 26. - P. 173-183). Заболевание было включено в международную базу данных наследственных заболеваний OMIM (#617303) в 2017 году.

Белок Vps33p впервые был описан у дрожжей Saccharomyces cerevisiae (см. Morphological classification of the yeast vacuolar protein sorting mutants: Evidence for a prevacuolar compartment in class E vps mutants / C.K. Raymond, I. Howald-Stevenson, C.A. Vater et al. // Mol Biol Cell. - 1992. - Vol. 3. - P. 1389-1402). Было показано, что Vps33p у дрожжей участвует в вакуолярном биогенезе и транспорте белков из аппарата Гольджи в вакуоли (см. Class C Vps protein complex regulates vacuolar SNARE pairing and is required for vesicle docking/fusion / T.K. Sato, P. Rehling, M.R. Peterson et al. // Mol Cell. - 2000. -Vol. 6. - P. 66-71). У многоклеточных белок VPS33 имеет два гомолога: VPS33A и VPS33B, они идентичны между собой на 30% (см. Comparative evolutionary analysis of VPS33 homologues: Genetic and functional insights / P. Gissen, C.A. Johnson, D. Gentle et al. // Hum Mol Genet. - 2005. - Vol. 14. - P. 1261-1270). Функцией белка VPS33A является Rab-опосредованное связывание и последующее слияние ранних эндосом посредством комплекса CORVET (class C core vacuole/endosome tethering) и поздних эндосом с лизосомами через комплексы HOPS (homotypic fusion and protein sorting complex) (см. Marks, M.S., Heijnen H.F., Raposo, G. Lysosome-related organelles: Unusual compartments become mainstream / M.S. Marks, H.F. Heijnen, G. Raposo // Curr Opin Cell Biol. - 2013. - Vol. 25. - P. 495-505). Белок VPS33A является основной субъединицей данных комплексов. Оба комплекса представляют собой гетерогексамеры и состоят из четырех общих субъединиц: VPS33A, VPS11, VPS16, VPS18. Они взаимодействуют с Rab ГТФазами (гуанозинтрифосфатазы) через субъединицы VPS3/VPS8 и VPS39/VPS41 (см. Balderhaar, H.J., Ungermann, C. CORVET and HOPS tethering complexes-coordinators of endosome and lysosome fusion / H.J. Balderhaar, C. Ungermann // J Cell Sci. - 2013. - Vol. 126. - P. 1307-1316). VPS33A также связывается с синтаксином 17 (STX17) и способствует опосредованному SNARE слиянию аутофагосомы с лизосомой (см. The HOPS complex mediates autophagosome-lysosome fusion through interaction with syntaxin 17 / P. Jiang, T. Nishimura, Y. Sakamaki et al. // Mol Biol Cell. - 2014. - Vol. 25. - P. 1327-1337). Белок VPS33A состоит из 596 аминокислот и имеет молекулярную массу 67,6 кДа. Ген VPS33A кодирует белок VPS33A, состоящий из четырех доменов: 1, 2, 3a и 3b (см. Baker, R.W., Jeffrey, P.D., Hughson, F.M. Crystal Structures of the Sec1/Munc18 (SM) Protein Vps33, Alone and Bound to the Homotypic Fusion and Vacuolar Protein Sorting (HOPS) Subunit Vps16 / R.W. Baker, P.D. Jeffrey, F.M. Hughson // PLoS ONE. - 2013. - Vol. 8. - P. e67409). В настоящее время мутация c.1492C>T в гене VPS33A является единственной причиной, ответственной за развитие МПСПС. Клиническая картина заболевания МПСПС была выявлена только у гомозиготных носителей аллеля c.1492T. В якутской популяции была выявлена экстремально высокая частота данного патогенного варианта (1:81). Предсказательное значение уровня заболеваемости в якутской популяции составило 1:12,000 новорожденных (см. Vasilev, F., Sukhomyasova, A., Otomo, T. Mucopolysaccharidosis-Plus Syndrome / F. Vasilev, A. Sukhomyasova, T. Otomo // Int J Mol Sci. - 2020. - Vol. 21, N 2. - P. 421).

В настоящий момент существует несколько основных способов определения полиморфных вариантов и мутаций: анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), аллель-специфичная ПЦР, ПЦР с анализом кривых плавления с высоким разрешением (ПЦР-HRM, High Resolution Melt), прямое секвенирование, массовое параллельное секвенирование, гибридизация на олигонуклеотидных матрицах, ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекцией.

Методы аллель-специфичной ПЦР и ПЦР-ПДРФ являются классическими, обладают такими достоинствами, как простота и экономичность. Недостатками данных методов являются времязатратность, низкая специфичность, высокий уровень ложноположительных результатов ввиду сопутствующего риска перекрестной контаминации исследуемых образцов.

Метод ПЦР-HRM основан на проведении амплификации фрагментов ДНК с последующим анализом их кривых плавления с высоким разрешением. Метод экспрессный, дешевый и несложный в исполнении. Недостатком ПЦР-HRM является сравнительно невысокая достоверность результатов исследования из-за возможного влияния полиморфизмов и других мутаций, локализованных в исследуемом локусе, на кривую плавления. Кроме того, не все мутации одинаково эффективны для определения методом ПЦР-HRM, мутации типа C/T и G/A детектируются лучше за счет разницы в водородных связах.

Методы прямого секвенирования и массового параллельного секвенирования являются широко распространенными и позволяют получить полную информацию о последовательности ДНК. При этом недостатками известных методов являются трудоемкость, времязатратность, использование дорогостоящего оборудования и расходных материалов, наличие высококвалифицированного персонала. А решение, основанное на гибридизации, используется в высокопроизводительных платформах на основе биологических микрочипов с аллель-специфичными зондами. Известное решение также требует наличия дорогостоящего оборудования и расходных материалов, достаточно сложно в интерпретации.

Метод ПЦР в реальном времени является самым простым и недорогим решением, и позволяет количественно определять ампликоны непосредственно в процессе ПЦР. Известный метод в течение последних пяти лет успешно применяется в крупнейших диагностических и научно-исследовательских центрах развитых стран мира, благодаря простоте выполнения, высокой надежности получаемых результатов, экономии производственных площадей, уменьшению количества персонала и востребованности количественного определения ДНК/РНК.

Метод ПЦР в реальном времени с использованием аллель-специфичных гидролизных олигонуклеотидных зондов (технология «TaqMan») является признанным стандартом при исследовании ДНК. Технология диагностики основана на использовании линейных олигонуклеотидов (зондов) с флуорофором и гасителем на концах: свечение флуорофора, прикрепившегося к нужному участку ДНК, будет отсутствовать до тех пор, пока ДНК-полимераза не дойдет до места крепления гибридизационного зонда, после чего зонд расщепиться и даст свечение. Расщепление зонда происходит за счет 5`-нуклеазной активности ДНК-полимеразы. Гашение флуоресценции основано на явлении резонансного переноса флуоресцентной энергии (FRET, resonance energy transfer). Методика позволяет добиться высоких показателей чувствительности и специфичности, является универсальной, ее можно применить для диагностики любых полиморфизмов или мутаций.

При анализе уровня техники также были выявлены изобретения с применением методики ПЦР c флуоресцентной детекцией для диагностики носительства (определения генотипа) других наследственных и мультифакториальных заболеваний, например, см. RU №2304170 (кл. C12Q1/68, опубл. 10.08.2007), RU №2534817 (кл. C12N15/11, опубл. 10.12.2014), RU №2505608 (кл. C12Q1/68, G01N33/50, опубл. 27.01.2014), RU №2556808 (кл. C12Q1/68, опубл. 20.07.2015), RU №2518301 (кл. C12Q1/68, опубл. 10.06.2014), RU №2675324 (кл. G01N33/50, C12Q1/68, опубл. 18.12.2018), RU №2739943 (кл. C12Q1/68, опубл. 30.12.2020), RU №2445368 (кл. C12Q1/68, опубл. 20.03.2012), RU №2631824 (кл. C12Q1/68, опубл. 26.09.2017), RU №2451086 (кл. C12Q1/68, опубл. 20.05.2012). При этом прямых аналогов к способу диагностики МПСПС методом ПЦР из уровня техники не выявлено.

Задачей заявляемого изобретения является разработка оптимального способа определения генотипа человека по мутации c.1492C>T в 12 экзоне гена VPS33A, ответственного за развитие мукополисахаридоз-плюс синдрома.

Техническим результатом изобретения является упрощение способа и повышение точности определения мутации c.1492C>T в 12 экзоне гена VPS33A, обеспечение высокой чувствительности и специфичности при низкой стоимости исследования, а также повышение доступности подобных исследований, поскольку заявленное решение может быть осуществлено на стандартном известном оборудовании.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе, включающем выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови, проводится амплификация в смеси Taq-полимеразы, обладающей 5'-экзонуклеазной активностью и двух пар последовательностей олигонуклеотидов (праймеров и гидролизных зондов), помеченных различными флуоресцентными красителями. Флуоресцентные красители ROX и FAM присоединены к нуклеотиду С на 5'-концах гидролизных зондов. Гасители флуоресценции BHQ2 и RTQ1 были присоединены к 3'-концевому нуклеотиду A. Последовательности нуклеотидов гидролизных зондов были подобраны так, чтобы они гибридизовались с внутренним районом продукта амплификации в том участке, где расположена целевая мутация c.1492C>T в гене VPS33A (см. таблицу). Зонд с парой флуоресцентный краситель/гаситель ROX/BHQ2 был комплементарен дикому типу (аллель c.1492C), а FAM/RTQ1 - мутантному (аллель c.1492T). В случае если зонд не гибридизуется в процессе амплификации, то происходит резонансный перенос энергии с возбужденного флуорофора на 5'-конце зонда, на расположенный на его 3'-конце гаситель, в результате чего свечение будет отсутствовать. В случае если зонд будет полностью комплементарен участку ДНК, то произойдет его гибридизация с формированием дуплекса. Данный дуплекс затем будет расщеплен Taq-полимеразой, вследствие чего произойдет удаление друг от друга молекул флуорофора и гасителя. В результате будет наблюдаться увеличение уровня флуоресценции красителя. Измерение интенсивности флуоресценции на длинах волн, соответствующих флуорофорам FAM и ROX, позволит определить генотип исследуемого образца.

Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна». Совокупность признаков изобретения обеспечивает решение заявленной технической задачи, а именно, получение молекулярно-генетического способа диагностики наследственного заболевания мукополисахаридоз-плюс синдром, включающего подбор специфичных оригинальных последовательностей олигонуклеотидов (праймеров), аллель-специфичных гидролизных зондов и оптимизацию условий проведения ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекцией. Краткое описание фигур:

Заявленное техническое решение иллюстрируется чертежом, где на фигуре 1 показаны результаты амплификации на 3% агарозном геле, при этом длина фрагментов амплификации составляет 266 пар нуклеотидов (п.н.) (М - маркер pUC19/MspI; 1, 5 - больные МПСПС, гомозиготы по мутации c.1492C>T в гене VPS33A; 2, 6 - родители больных МПСПС, гетерозиготные носители мутации c.1492C>T в гене VPS33A; 3, 7 - условно здоровые индивиды, носители аллели дикого типа (аллель c.1492C в гене VPS33A); 4, 8 - деионизованная вода); на фигуре 2 - пример интерпретации результатов, полученных с применением разработанных праймеров и зондов для ПЦР в режиме реального времени, в виде графика распределения генотипов по исследуемому локусу (кружок - больные МПСПС, гомозиготы по мутации c.1492C>T в гене VPS33A; треугольники - гетерозиготные носители мутации c.1492C>T в гене VPS33A; квадраты - условно здоровые индивиды, носители аллели дикого типа (аллель c.1492C в гене VPS33A); ромбы - деионизованная вода).

Заявленный способ осуществляется следующим образом.

Геномную ДНК выделяют из биологического материала. В качестве материала для исследования рекомендуется использовать венозную периферическую кровь. Выделение ДНК из биологического материала производится стандартным методом фенол-хлороформной экстракции или с использованием коммерческих наборов реагентов. Концентрация выделенных образцов ДНК измеряется спектрофотометрическим методом. Затем исследуемые образцы ДНК разводятся деионизованной водой до концентрации 30 нг/мкл.

Перед проведением амплификации ПЦР-смесь, праймеры, зонды и образцы ДНК полностью размораживаются, тщательно перемешиваются на вортексе с последующим центрифугированием.

Реакцию амплификации проводят на программируемом термоциклере с оптической системой детекции флуоресценции в объеме 15 мкл реакционной смеси следующего состава: 1 мкл смеси прямого и обратного праймеров (10 пмоль/мкл каждого праймера), 1 мкл каждого зонда (10 пмоль/мкл), 6 мкл 2,5х ПЦР-буфера (KCl, Tris-HCl pH8,8, 6,25 мМ MgCl₂, Taq ДНК-полимераза 5ед/мкл, 2,5 мМ dNTP), 5 мкл деионизованной воды, 1 мкл геномной ДНК в концентрации 30 нг/мкл. На фигуре 1 приведены результаты амплификации в агарозном геле. Реакцию ПЦР в режиме реального времени проводят в следующих условиях: первоначальная денатурация 95°C в течение 5 минут, затем 40 циклов амплификации, каждый из которых состоял из стадии денатурации 95°C в течение 15 секунд и объединенной стадии отжига-элонгации 60°C в течение 50 секунд.

После прохождения ПЦР следует провести анализ результатов с помощью программных средств термоциклера с возможностью проведения ПЦР в реальном времени («Аллельная дискриминация»). При наличии сигнала флуоресценции по каналу FAM образец будет диагностирован как содержащий мутацию c.1492C>T в гене VPS33A. Образец, положительный по флуорофору ROX, интерпретируется как норма (дикий тип). При наличии двух сигналов флуоресценции FAM и ROX результат следует интерпретировать как гетерозиготное состояние/носительство мутации c.1492C>T в гене VPS33A (см. фигуру 2).

Разработанный способ диагностики наследственного заболевания был апробирован при тестировании образцов геномной ДНК 15 больных МПСПС, 15 родственников больных МПСПС и 15 условно здоровых индивидов, проживающих в Республике Саха (Якутия). Молекулярно-генетические исследования носительства мутации c.1492C>T в гене VPS33A на данных образцах были исследованы четыре раза. Ранее диагностика больных МПСПС и их родственников (носителей мутации c.1492C>T в гене VPS33A) была проведена с помощью метода прямого секвенирования по Сэнгеру. Проведение молекулярного исследования с помощью разработанного метода показало, что все больные МПСПС были гомозиготами по мутации c.1492C>T в гене VPS33A, а их родственники (родители) являлись гетерозиготными носителями данного патогенного варианта. Все контроли были носителями аллели дикого типа (аллель c.1492C в гене VPS33A).

Таким образом, заявленный способ диагностики мукополисахаридоз-плюс синдрома позволяет выставить точный диагноз, проводить пренатальную ДНК-диагностику и проспективное медико-генетическое консультирование для вступающих в брак. Техническое решение простое в выполнении, точное и доступное для выполнения в условиях молекулярно-генетической лаборатории.

Таблица
Олигонуклеотидные праймеры и зонды для детекции мутации c.1492C>T в гене VPS33A Праймер / Зонд Последовательность (5’-3’) Праймер (прямой) CCAAAAGGCCACAGTCAGGT Праймер (обратный) TCTGTAGATGCTGGACTGGGA Зонд (дикий тип) ROX-CTCAGTGTGCGGCTGGCCCA-BHQ2 Зонд (мутантный тип) FAM-CTCAGTGTGTGGCTGGCCCA-RTQ1

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики носительства мутантного гена VPS33A с мутацией c.1492C>T, приводящей к развитию мукополисахаридоз-плюс синдрома с аутосомно-рецессивным типом наследования в якутской популяции. Осуществляют выделение ДНК. Проводят полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией с применением пары праймеров и гидролизных зондов. По наличию сигнала флуоресценции по каналу FAM диагностируют мутантный тип c.1492T в гене VPS33A, по каналу ROX – дикий тип c.1492C, по каналам ROX и FAM – носительство мутантного гена в гетерозиготном состоянии. Способ обеспечивает повышение точности определения мутации c.1492C>T в 12 экзоне гена VPS33A, высокую чувствительность и специфичность при низкой стоимости исследования, а также повышение доступности подобных исследований за счет использования двух пар праймеров и гидролизных зондов, помеченных флуоресцентными красителями ROX и FAM. 2 ил., 1 табл.

Способ диагностики носительства мутантного гена VPS33A с мутацией c.1492C>T, приводящей к развитию мукополисахаридоз-плюс синдрома с аутосомно-рецессивным типом наследования в якутской популяции, включающий выделение ДНК и полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией с применением пары праймеров CCAAAAGGCCACAGTCAGGT; TCTGTAGATGCTGGACTGGGA и гидролизных зондов ROX-CTCAGTGTGCGGCTGGCCCA-BHQ2; FAM-CTCAGTGTGTGGCTGGCCCA-RTQ1, где по наличию сигнала флуоресценции по каналу FAM диагностируют мутантный тип c.1492T в гене VPS33A, по каналу ROX – дикий тип c.1492C в гене VPS33A, по каналам ROX и FAM – носительство мутантного гена в гетерозиготном состоянии.