Изобретение относится к области медицины и молекулярной биологии и может быть использовано для диагностики наследственного заболевания, а именно, SOPH-синдрома (SOPH) в гене NBAS.
SOPH-синдром, впервые описанный в 2010 году, считался распространенным только в якутской популяции, тем не менее, каждый год по литературным данным обнаруживаются новые случаи SOPH-подобных состояний по всему миру. Частота гетерозиготного носительства патогенной мутации составила 1300 случаев на 100000 чел. условно здоровых якутов, при этом в республиканском генетическом регистре наследственной и врожденной патологии Якутии насчитывается более 93 обнаруженных случаев SOPH, что составляет частоту более 18 пациентов на 100000 чел. якутской популяции (см. Zhozhikov L., Sukhomyasova A., Gurinova E. et al. Origins of SOPH syndrome: A study of 93 Yakut patients with review of C-terminal phenotype // Clinical Genetics. 2023. V. 103. № 6. P. 625–635. https://doi.org/10.1111/cge.14319).
Кроме того, выявлен эффект основателя данного варианта в Якутии, возраст которого составил 804±140 лет. Учитывая дату исследования и выборку, эти данные указывают на начало распространения мутации G5741 → A в якутской популяции в первой половине XII в. (1192-й год ±140 лет), который в истории Якутии соответствует расцвету кулун-атахской археологической культуры. Носители данной культуры были адаптированы к местным условиям и вели кочевой образ жизни на бассейне средней Лены (см. Fedorova S.A., Khusnutdinova E.K. Genetic Structure and Genetic History of the Sakha (Yakuts) Population // Russ J Genet. 2022. V. 58. № 12. P. 1409–1426. https://doi.org/10.1134/S1022795422120031).
Известно, что SOPH-синдром ассоциирован с гомозиготным вариантом c.5741G>A в гене NBAS (neuroblastoma amplified sequence), локус которого расположен на коротком плече второй хромосомы. Вариант приводит к замене гуанина на аденин в 45 экзоне, что приводит к замене аргинина на гистидин (p. R1914H) в структуре белка NBAS. Область, где имеет место данная мутация, локализована на той половине белка, связывающей белок NBAS с белками RINT1 и ZW10, входящих в состав комплекса Syntaxin 18, который, в свою очередь, играет роль в слиянии мембран органелл клетки и транспорте между эндоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи. Ген NBAS состоит из 52 экзонов и содержит 420 т.п.н. Нарушения в гене модулируют экспрессию 1444 генов человека, что соответствует почти 10 % всех экспрессируемых генов. Некоторые из них связаны с эмбриональным развитием и биосинтезом холестерина (см. Zhozhikov L.R., Vasilev F.F., Maksimova N.R. The Function of the NBAS Has Been Revealed: What about Its Multisystem Pathologies? // Russ J Genet. 2023. V. 59. № 4. P. 317–324. https://doi.org/10.1134/S1022795423040117).
В настоящий момент известны способы определения полиморфных вариантов и мутаций, например, анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), аллель-специфичная ПЦР, ПЦР с анализом кривых плавления с высоким разрешением (ПЦР-HRM, High Resolution Melt), прямое секвенирование, массовое параллельное секвенирование, гибридизация на олигонуклеотидных матрицах, ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекцией.
При этом способы прямого секвенирования, массового параллельного секвенирования характерны дороговизной, сложностью и ограниченностью в применении в клинической практике.
Метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ПЦР-ПДРФ проходит в два этапа: сначала выполняют саму ПЦР и образование амплификата, то есть копий необходимого в исследовании участка ДНК, затем с помощью специфической рестриктазы - обрезание искомого участка, ответственного за заболевание. После чего, анализируют количество бэндов на геле в целях последующей диагностики: наличие двух и более бэндов (количество зависит от дизайна исследования) указывает на обрезанный фрагмент, в то время как другой бэнд, как правило, тот, что длиннее - на его отсутствие.
По способу ПЦР с анализом кривых плавления с высоким разрешением (ПЦР-HRM, High Resolution Melt) сначала проводят амплификацию участка ДНК, а затем, когда количество копий амплификата достаточно высоко, постепенно и медленно увеличивают температуру с детекцией свечения. Свечение возникает в момент, когда две цепи ДНК отделяются друг от друга. Диагностика происходит на основе того, при какой температуре происходит это отделение. Если свечение происходит при относительно низкой температуре, это указывает на слабое сцепление между цепями. И наоборот, когда связи разрываются при высокой температуре, это указывает на прочное сцепление, что показывает комплементарную связь.
Недостатками известного способа являются низкая специфичность и необходимость в наличии определенных мутаций таких, как большие делеции и миссенс-варианты, что ограничивает диагностические возможности, особенно в случае наследственных заболеваний, такого как SOPH-синдром, при котором ПЦР-HRM не вызывает значительного смещения температуры отжига двух цепей ДНК.
Метод ПЦР в реальном времени с использованием флуоресцентных зондов основан на том же принципе, что и обычный ПЦР, но с детекцией свечения в реальном времени в процессе амплификации. Свечение возникает при диссоциации молекул зонда, состоящего из флуорофора и тушителя, соединенных с олигонуклеотидом. Каждый флуорофор имеет свою длину волны, что обеспечивает специфичность диагностики: один флуорофор соответствует одному зонду, и их присоединение к матрице зависит от комплементарности с ней. Данный метод был выбран соавторами для экспериментальных работ.
Известный метод предполагает разработку праймеров, то есть олигонуклеотидов определенной последовательности, соответствующей искомому участку, где находится мутация, а также разработку зондов для детекции двух аллелей - больной и здоровой. Для каждого из этих аллелей подбирают свой зонд, а к каждому зонду свой тушитель, после чего, определяют необходимый температурный режим для такого набора тест-системы, то есть температуру, при которой цепи ДНК будут диссоциировать и отжигаться снова, давая свечение и амплификацию. Кроме того, проводят подбор образцов ДНК для контрольных испытаний, включая ДНК больных носителей и здоровых людей.
При анализе уровня техники также были выявлены изобретения с применением методики ПЦР c флуоресцентной детекцией для диагностики носительства (определения генотипа) других наследственных и мультифакториальных заболеваний, например, см. RU №2304170 (кл. C12Q1/68, опубл. 10.08.2007), RU №2534817 (кл. C12N15/11, опубл. 10.12.2014), RU №2505608 (кл. C12Q1/68, G01N33/50, опубл. 27.01.2014), RU №2556808 (кл. C12Q1/68, опубл. 20.07.2015), RU №2518301 (кл. C12Q1/68, опубл. 10.06.2014), RU №2675324 (кл. G01N33/50, C12Q1/68, опубл. 18.12.2018), RU №2739943 (кл. C12Q1/68, опубл. 30.12.2020), RU №2445368 (кл. C12Q1/68, опубл. 20.03.2012), RU №2631824 (кл. C12Q1/68, опубл. 26.09.2017), RU №2451086 (кл. C12Q1/68, опубл. 20.05.2012). При этом прямых аналогов к способу диагностики SOPH методом ПЦР из уровня техники не выявлено.
Задачей заявляемого изобретения является разработка оптимального способа определения генотипа человека по мутации c.5741G>A в 45 экзоне гена NBAS, ответственного за развитие SOPH-синдрома.
Техническим результатом изобретения является упрощение способа и повышение точности определения мутации c.5741G>A в 45 экзоне гена NBAS, обеспечение высокой чувствительности и специфичности при низкой стоимости исследования, а также повышение доступности подобных исследований, поскольку заявленное решение может быть осуществлено на стандартном известном оборудовании.
Для решения поставленной задачи способ диагностики носительства мутантного гена NBAS с мутацией c.5741G>A, приводящего к развитию SOPH-синдрома с аутосомно-рецессивным типом наследования в якутской популяции, включает выделение ДНК и полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией с применением пары праймеров AATGCAGGGTTCTTTGGTCTCA (SEQ ID NO 1), TGAGCTTCGTCTTCTGAGTTTCTT (SEQ ID NO 2) и гидролизных зондов ROX-CTGTCTGTGGAAGCCCGT-BHQ2 (SEQ ID NO 3), R6G-GCTGTCTGTGGAAGCCCATA-BHQ1 (SEQ ID NO 4), где по наличию сигнала флуоресценции по каналу R6G диагностируют мутантный тип c.5741A в гене NBAS, по каналу ROX – дикий тип c.5741G в гене NBAS, по совместному свечению каналов ROX и R6G – носительство мутантного гена в гетерозиготном состоянии.
Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна».
Совокупность признаков изобретения обеспечивает решение заявленной технической задачи, а именно, получение молекулярно-генетического способа диагностики наследственного заболевания SOPH-синдром, включающего подбор специфичных оригинальных последовательностей олигонуклеотидов (праймеров), аллель-специфичных гидролизных зондов и оптимизацию условий проведения ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекцией.
Заявленное техническое решение иллюстрируется чертежом, где на фиг. 1 показаны результаты амплификации на 3 % агарозном геле, при этом длина фрагментов амплификации составляет 140 пар нуклеотидов (п.н.) (М – маркер pUC19/MspI; 1, 2 – больные SOPH, гомозиготы по мутации c.5741G>A в гене NBAS; 3, 4 – родители больных SOPH, гетерозиготные носители мутации c.5741G>A в гене NBAS; 5 – условно здоровый индивид, носитель аллели дикого типа (аллель c.5741G в гене NBAS); 0 – деионизованная вода); на фиг. 2 – пример интерпретации результатов, полученных с применением разработанных праймеров и зондов для ПЦР в режиме реального времени, в виде графика распределения генотипов по исследуемому локусу (образцы со свечением по зонду R6G более 800 ОЕФ и свечением менее 200 ОЕФ по зонду ROX – больные SOPH, гомозиготы по мутации c.5741G>A в гене NBAS; образцы с примерно одинаковым свечением по обоим зондам – гетерозиготные носители мутации c.5741G>A в гене NBAS; образцы со свечением по зонду R6G менее 200 ОЕФ и свечением более 600 ОЕФ по зонду ROX – условно здоровые индивиды, носители аллели дикого типа (аллель c.5741G в гене NBAS); образец без свечения – деионизованная вода).
В заявленном техническом решении, включающем выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови, проводят амплификацию в смеси Taq-полимеразы, обладающей 5'-экзонуклеазной активностью и двух пар последовательностей олигонуклеотидов (праймеров и гидролизных зондов), помеченных различными флуоресцентными красителями. Флуоресцентные красители ROX и R6G присоединены к нуклеотиду С на 5'-концах гидролизных зондов. Гасители флуоресценции BHQ2 и BHQ1 присоединены к 3'-концевому нуклеотиду T. В экспериментальной работе последовательности нуклеотидов гидролизных зондов были подобраны так, чтобы они гибридизовались с внутренним районом продукта амплификации в том участке, где расположена целевая мутация c.5741G>A в гене NBAS (см. таблицу). При этом зонд с парой флуоресцентный краситель/гаситель ROX/BHQ2 был комплементарен дикому типу (аллель c.5741G), а R6G/BHQ1 – мутантному (аллель c.5741A). В случае если зонд не гибридизуется в процессе амплификации, то происходит резонансный перенос энергии с возбужденного флуорофора на 5'-конце зонда, на расположенный на его 3'-конце гаситель, в результате чего свечение будет отсутствовать. В случае если зонд будет полностью комплементарен участку ДНК, то произойдет его гибридизация с формированием дуплекса. Данный дуплекс затем будет расщеплен Taq-полимеразой, вследствие чего произойдет удаление друг от друга молекул флуорофора и гасителя. В результате будет наблюдаться увеличение уровня флуоресценции красителя. Таким образом, измерение интенсивности флуоресценции на длинах волн, соответствующих флуорофорам R6G и ROX, позволит определить генотип исследуемого образца.
Заявленный способ осуществляется следующим образом.
Геномную ДНК выделяли из биологического материала. В качестве материала для исследования рекомендуется использовать венозную периферическую кровь. Выделение ДНК из биологического материала производили стандартным методом фенол-хлороформной экстракции или с использованием коммерческих наборов реагентов. Концентрация выделенных образцов ДНК измеряли спектрофотометрическим методом. Затем исследуемые образцы ДНК разводили деионизованной водой до концентрации 15 нг/мкл.
Перед проведением амплификации ПЦР-смесь, праймеры, зонды и образцы ДНК полностью размораживали, тщательно перемешивали на вортексе с последующим центрифугированием.
Реакцию амплификации проводили на программируемом термоциклере с оптической системой детекции флуоресценции в объеме 10 мкл реакционной смеси следующего состава: 1 мкл смеси прямого и обратного праймеров (10 пмоль/мкл каждого праймера), 0,5 мкл каждого зонда (10 пмоль/мкл), 5 мкл 2,5х ПЦР-буфера (KCl, Tris-HCl pH8,8, 6,25 мМ MgCl2, Taq ДНК-полимераза 5ед/мкл, 2,5 мМ dNTP), 2 мкл деионизованной воды, 1 мкл геномной ДНК в концентрации 15 нг/мкл. На фиг. 1 приведены результаты амплификации в агарозном геле.
Реакцию ПЦР в режиме реального времени проводили при следующих условиях: первоначальная денатурация 95°C в течение 5 минут, затем 40 циклов амплификации, каждый из которых состоял из стадии денатурации 95°C в течение 15 секунд и объединенной стадии отжига-элонгации 60°C в течение 50 секунд.
После прохождения ПЦР проводили анализ результатов с помощью программных средств термоциклера с возможностью проведения ПЦР в реальном времени («аллельная дискриминация»). При наличии сигнала флуоресценции по каналу R6G образец диагностировали как содержащий мутацию c.5741G>A в гене NBAS. Образец, положительный по флуорофору ROX, интерпретировали как норма (дикий тип). При наличии двух сигналов флуоресценции R6G и ROX результат интерпретировали как гетерозиготное состояние/носительство мутации c.5741G>A в гене NBAS (см. фиг. 2).
Разработанный способ диагностики наследственного заболевания был апробирован при тестировании образцов геномной ДНК 10 больных SOPH, 10 родственников больных SOPH и 10 условно здоровых индивидов, проживающих в Республике Саха (Якутия). Молекулярно-генетические исследования носительства мутации c.5741G>A в гене NBAS на данных образцах были исследованы четыре раза. Ранее диагностика больных SOPH и их родственников (носителей мутации c.5741G>A в гене NBAS) была проведена с помощью метода прямого секвенирования по Сэнгеру. Проведение молекулярного исследования с помощью разработанного метода показало, что все больные SOPH были гомозиготами по мутации c.5741G>A в гене NBAS, а их родственники (родители) являлись гетерозиготными носителями данного патогенного варианта. Все контроли были носителями аллели дикого типа (аллель c.5741G в гене NBAS).
Таким образом, заявленный способ диагностики SOPH-синдрома позволяет выставить точный диагноз, проводить пренатальную ДНК-диагностику и проспективное медико-генетическое консультирование, например, для вступающих в брак. Техническое решение характеризуется простотой в выполнении, точностью и доступностью для выполнения в условиях молекулярно-генетической лаборатории.
Перечень олигонуклеотидов подготовлен по Стандарту ST.26 посредством программного обеспечения WIPO Sequence «Рекомендуемый Стандарт представления перечней нуклеотидных и аминокислотных последовательностей с использованием языка XML (Расширяемого языка разметки)».
Таблица
Олигонуклеотидные праймеры и зонды для детекции мутации c.5741G>A в гене NBAS
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
Способ диагностики мукополисахаридоз-плюс синдрома | 2022 |
|
RU2798695C1 |
Способ одновременной диагностики наследственных заболеваний | 2015 |
|
RU2627115C2 |
Способ диагностики точечных мутаций в нативной ДНК с применением оксида графена | 2015 |
|
RU2614111C1 |
Набор для определения CCR5delta32 мутации в геноме человека | 2020 |
|
RU2748998C1 |
НАБОР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПРАЙМЕРОВ И АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ЗОНДОВ ДЛЯ ОДНОВРЕМЕННОЙ ГЕНОДИАГНОСТИКИ ДВУХ МУТАНТНЫХ АЛЛЕЛЕЙ, ВЫЗЫВАЮЩИХ CVM И BLAD У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА | 2015 |
|
RU2577990C1 |
Способ диагностики мутации 35delG (rs80338939) гена GJB2 | 2020 |
|
RU2739889C1 |
СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОЙ ГЕНОДИАГНОСТИКИ ДВУХ МУТАНТНЫХ АЛЛЕЛЕЙ, ВЫЗЫВАЮЩИХ CVM И BLAD У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, И ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ | 2015 |
|
RU2601151C2 |
Способ диагностики мутации 167delT (rs80338942) гена GJB2 | 2020 |
|
RU2739943C1 |
Способ диагностики мутации c.-23+1G>A (rs80338940) гена GJB2 | 2020 |
|
RU2746055C1 |
Количественный метод определения экспрессии аллелей GNAO1 здоровой формы и с мутацией c.607 G>A | 2021 |
|
RU2777663C1 |
Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики носительства мутантного гена NBAS с мутацией c.5741G>A, приводящей к развитию SOPH-синдрома с аутосомно-рецессивным типом наследования в якутской популяции. Выделяют ДНК. Проводят полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией. По наличию сигнала флуоресценции по каналу R6G диагностируют мутантный тип c.5741A в гене NBAS. По каналу ROX диагностируют дикий тип c.5741G в гене NBAS. По совместному свечению каналов ROX и R6G диагностируют носительство мутантного гена в гетерозиготном состоянии. Способ обеспечивает упрощение и повышение точности определения мутации c.5741G>A в 45 экзоне гена NBAS, высокую чувствительность и специфичность при низкой стоимости исследования за счет применения пары специфичных праймеров (SEQ ID NO 1 и 2) и гидролизных зондов (SEQ ID NO 3 и 4). 2 ил., 1 табл.
Способ диагностики носительства мутантного гена NBAS с мутацией c.5741G>A, приводящей к развитию SOPH-синдрома с аутосомно-рецессивным типом наследования в якутской популяции, включающий выделение ДНК и полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией с применением пары праймеров AATGCAGGGTTCTTTGGTCTCA (SEQ ID NO 1), TGAGCTTCGTCTTCTGAGTTTCTT (SEQ ID NO 2) и гидролизных зондов ROX-CTGTCTGTGGAAGCCCGT-BHQ2 (SEQ ID NO 3), R6G-GCTGTCTGTGGAAGCCCATA-BHQ1 (SEQ ID NO 4), где по наличию сигнала флуоресценции по каналу R6G диагностируют мутантный тип c.5741A в гене NBAS, по каналу ROX – дикий тип c.5741G в гене NBAS, по совместному свечению каналов ROX и R6G – носительство мутантного гена в гетерозиготном состоянии.
Способ одновременной диагностики наследственных заболеваний | 2015 |
|
RU2627115C2 |
САВВИНА М.Т | |||
и др | |||
Переносная печь для варки пищи и отопления в окопах, походных помещениях и т.п. | 1921 |
|
SU3A1 |
Медицинская генетика | |||
Станок для придания концам круглых радиаторных трубок шестигранного сечения | 1924 |
|
SU2019A1 |
MAKSIMOVA N | |||
et al | |||
Neuroblastoma amplified sequence gene is |
Авторы
Даты
2024-05-28—Публикация
2024-03-15—Подача