СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ НАРУШЕНИЙ ФУНКЦИИ ЯИЧНИКОВ МИКРОЭЛЕМЕНТОЗНОЙ ЭТИОЛОГИИ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, и может быть использовано для диагностики нарушений функции яичников, в частности нарушений менструального цикла (НМЦ) микроэлементозного генеза.

Согласно многочисленным исследованиям в этиологии НМЦ большую роль играют негативные факторы окружающей среды. Ксенобиотики отрицательно влияют особенно на развитие детского организма. Многие из них накапливаются в биосубстратах (Б.А.Ревич, 1998, В.А.Попова и др., 2003). В определенных пределах организм может адаптироваться к ним за счет напряжения метаболических процессов, однако при пролонгированном воздействии происходит нарушение регуляторных механизмов, срыв адаптации (Н.А.Агаджанян и др., 2006, Д.Оберлис и др., 2008).

Полифункциональные изменения в организме, индуцируемые повышенным или пониженным содержанием химических элементов (ХЭ) или их дисбалансом, называют, по предложению А.П.Авцына и др.(1991), микроэлементозами (МЭ). Они чаще всего имеют техногенное происхождение, негативно сказываются на развитии эмбриона, в результате чего возникают врожденные пороки и др. аномалии, а также на функции организма в целом.

ХЭ, находящиеся в организме, могут взаимодействовать между собой по типу синергизма или антагонизма, при физиологических концентрациях антагонистов их биологические эффекты сбалансированы и патологических проявлений не происходит. Поступление в организм различных ксенобиотиков, в т.ч. тяжелых металлов (в частности свинца), который является антагонистом некоторых эссенциальных ХЭ, нарушает баланс между физиологическими эффектами химических элементов. Это сопровождается патофизиологическими реакциями и, в дальнейшем, заболеваниями (А.В.Скальный, 2004). По данным этого автора около 2/3 населения РФ находится в группе риска по гипоэлементозам.

К экологически обусловленным процессам относятся нарушения функций яичников, проявляющиеся в виде НМЦ. В их патогенезе, в ряде случаев, лежат МЭы, индуцируемые ксеноагрессией (А.И.Никитин, 2005). Диагностика НМЦ и установление их этиологии является одной из актуальных проблем современной репродуктологии. Их ранняя диагностика способствует более успешной восстановительной терапии нарушенной функции яичников вследствие нейро-эндокринно-иммунологических девиаций системного характера.

Известны способы диагностики НМЦ с помощью тестов функциональной диагностики (базальная температура и др.), изучения секреции гипофизарно-гонадных гормонов в динамике менструального цикла в крови (В.П.Сметник, 1998). В этих же целях применяют комбинированное изучение показателей УЗИ и уровня гормонов в крови после применения индуктора овуляции - кломифена (Т.А.Назаренко и др., 2005).

Недостатком данных способов является то, что информацию можно получить лишь в динамическом исследовании (диагностика длительная). Кроме того, получение материала возможно только инвазивным путем. Для реализации методов больной необходимо неоднократно посещать диагностические центры.

Известен способ диагностики нарушений функций яичников у женщин из групп производственно-экологического риска путем измерения импеданса слизистой полости рта в течение месяца, начиная с первого дня менструации, и при отличии между величинами импеданса, измеренными на 5-7 и 15-17 дни, менее 20% диагностируют НМЦ (патент РФ № 2202277, 2002 г.). Однако этот способ, несмотря на свою информативность, отличается длительным характером выполнения, кроме того, на точность диагностики влияют возможные хронически текущие воспалительные изменения в полости рта. Метод не позволяет судить об этиологии НМЦ и выбрать адекватно обоснованную тактику лечения. Данный способ принят нами за прототип.

Задачей настоящего изобретения является создание более доступного и более точного способа диагностики нарушений функций яичников микроэлементозной этиологии, косвенно позволяющего определить группу риска девушек, проживающих в экологически неблагоприятных регионах, по возникновению НМЦ.

Поставленная задача решается тем, что у девушек, проживающих в экологически неблагоприятных районах, определяют в моче уровень аминоливулиновой кислоты (АЛК), и если он превышает значение 53,2 мкМ/сут, то дополнительно проводят отбор проб волос, в которых методом рентгенофлуоресцентного анализа определяют концентрации таких химических элементов, как медь, цинк, селен, марганец, свинец. Рассчитывают соотношения концентраций пар ХЭ-антагонистов Pb/Zn, Se/Pb, Pb /Cu. При обнаружении отклонений перечисленных показателей не менее чем в 2 раза от нормативов диагностируют у данной пациентки НМЦ микроэлементозной этиологии.

Способ обеспечивает раннее выявление признаков НМЦ микроэлементозного генеза и исключает необходимость проведения специфических инвазивных дорогостоящих лабораторных исследований репродуктивной системы.

Его разработка базируется на собственных и литературных данных (А.П.Авцин и др., 1991, Д.Оберлис и др., 2008) о роли химических элементов в регуляции нейроэндокринных процессов и их нарушений. В течение последних десятилетий растет интерес к раскрытию значимости для процессов роста и развития ХЭ, которых в организме известно около 80. Адекватное поступление их в организм по трофологическим путям ассоциируется с оптимальной продолжительностью жизни, снижением онкологической заболеваемости, рождением физиологически полноценного потомства (Е.В.Ших и др., 2007).

Физиологическое развитие половой системы у мужчин и женщин, которое, как известно, во многом зависит от климатогеографических и геохимических особенностей, обусловлено определенным содержанием в организме эссенциальных ХЭ. К ним, в первую очередь, относится пул ХЭ, таких как медь, цинк, селен, марганец (Д.Оберлис и др., 2008). Как указывают названные авторы, недостаток физиологического влияния указанных химических элементов в силу дефицита или преобладания действия их антагонистов обусловливает дисфункции половых желез.

Так, в частности, медь, которая входит в состав важнейших ферментов, присутствует в системе антиоксидантной защиты организма. Она повышает устойчивость организма к внешним воздействиям. При ее недостатке, наряду с угнетением кроветворения, ухудшением сердечно-сосудистой системы, происходит задержка полового развития у девочек, может возникнуть НМЦ. Если это имеет место у взрослых женщин, то возникает снижение полового влечения, бесплодие эндокринного генеза (А.В.Скальный и др., 2004).

Дефицит другого репротропного ХЭ - марганца часто возникает на фоне психоэмоциональных перестроек. Они провоцируют усиленный «расход» данного ХЭ, участвующего в обмене нейромедиаторов в ЦНС. Как указывают Д.Оберлис и др. (2008), его дефицит проявляется также замедлением роста, женским бесплодием, мужской импотенцией, нарушениями метаболизма липидов. Экспериментальным путем выявлено 3 степени дефицита марганца в аспекте репротропных эффектов у женских особей. При 1-2 степенях выявляют различные нарушения эмбриогенеза, при 3 возникает НМЦ, ановуляция, в итоге - бесплодие. Вследствие дисфункции яичников развивается ранний климакс.

Эссенциальным ХЭ, в значительной мере, обеспечивающим физиологическое течение репродуктивных процессов, половое созревание, является селен. Он участвует в адаптационных механизмах, является основным компонентом фермента глутатионпероксидазы, который защищает организм от ксенобиотиков, в частности тяжелых металлов, являясь их антагонистом. При его недостатке страдают эмбриогенез, обменные процессы, возникают «поломки» в регуляторных механизмах, приводящие к мужской и женской стерильности (Н.А.Голубкина и др., 2002).

Цинк принимает участие в процессах деления и дифференцировки клеток, функционировании многих ферментов и гормонов, в том числе полового гормона - дигидрокортикостерона. Он обладает детоксицирующим действием и способствует удалению и нейтрализации ксенобиотиков, является антагонистом свинца, кадмия, блокируя их патогенное влияние на ЦНС, эндокринную систему, кровь. Снижение уровня ХЭ приводит к угнетению роста особи, индуцирует нанизм, анемию, бесплодие (А.П.Авцын и др., 1991).

Антагонистом перечисленных химических элементов является свинец. Это самый распространенный техногенный загрязнитель среды. Он блокирует физиологические эффекты железа в аспекте его гемоглобинобразующей функции (А.П.Авцын и др., 1991). Установлено его прямое угнетающее действие на ЦНС, кроветворную систему, процесс оплодотворения, спермо- и фолликулогенез.

Приведенный краткий анализ МЭ показывает актуальность проблемы для раскрытия этиопатогенеза многих экологически обусловленных заболеваний, в т.ч. патологии репродукции. Между тем в отечественной литературе существует относительный дефицит информации о нормативах биологически допустимых уровней ХЭ, с учетом их региональных геохимических, возрастных, гендерных, сезонных и др. особенностей. Сведения о концентрации химических элементов в волосах имеют большей частью эколого-физиологический характер. Они дают оценку степени гигиенического состояния того или иного региона, состояния здоровья населения, особенно детского. Используются в диагностике онкологических процессов (Г.А.Маметкаримов, 2000, Т.В.Юдина и др., 2003, В.А.Семикопенко, патент № 2230491, 2002 г.).

Учитывая актуальность ранней диагностики МЭов для своевременного выявления нарушений половых процессов, в разработке заявляемого способа нами были применены методы определения ХЭ у девушек, проживающих в экологически неблагоприятных районах. В основу разрабатываемого способа диагностики легло определение концентраций «репротропных» химических элементов, отличающихся высокой гомеостатической емкостью, соотношения пар функциональных антагонистов и сопоставления неорганического показателя (свинца) с уровнем его биохимического элементспецифического индикатора - аминолевулиновой кислоты (АЛК). Этот анализ является ведущим биохимическим тестом при нарушениях обмена, сопровождающих интоксикации свинцом, бензолом и другими химическими агентами (В.Г.Артамонова, 1996). Для уточнения причины изменения АЛК целесообразно исследование уровня свинца. Таким образом, «бионеорганическая» диагностика, впервые предложенная для целей детской гинекологии, позволяла установить этиологическую особенность НМЦ, тем самым, давая обоснования, как модифицировать известные медикаментозные схемы лечения данной нозологии в гинекологической практике.

Подробное описание способа и примеры его конкретного выполнения

Определение дельта-аминолевулиновой кислоты (АЛК) в моче осуществляют по общепринятой методике (Л.С.Семенова и др. - Сравнительная оценка методик определения аминолевулиновой кислоты в моче. - Гигиена труда. - № 1. - 1982. -35-39). Ее принцип заключается в отделении мешающих веществ (профобилиноген и др.) от АЛК, сорбирования их на активированном угле и последующем определении АЛК по реакции образования пиррола с ацетилацетоном при нагревании. Конечный этап методики состоит в спектрофотометрировании окрашенного продукта реакции пиррола с реактивом Эрлиха. В работе используют спектрофотометр «Хитачи DU-800» (Япония).

Для определения микроэлементного пула, участвующего в регуляции функции яичников и свинца, применяют модернизированный спектрометр для рентгенофлуоресцентного анализа с полным внешним отражением «РФС-02» (Россия). Результат модернизации - увеличение чувствительности прибора в необходимой области атомных номеров определяемых химических элементов (ХЭ). Принцип метода заключается в том, что полихроматическое рентгеновское излучение от анода рентгеновской трубки падает на поверхность одного из вторичных излучателей из материалов TiO2, CuO, Ge, SrCO3, Mo, Rh, возбуждая в его массе монохроматическое вторичное характеристическое рентгеновское излучение Ка-линии металла. При этом энергия первичного рентгеновского излучения дискретно изменяется путем замены вторичного излучателя. Это позволяет регулировать чувствительность спектрометра в необходимых областях химических элементов. Монохроматичное вторичное флуоресцентное излучение путем многократного полного внешнего отражения от их внутренних поверхностей и прямого распространения вдоль оптической оси падает на рабочую поверхность второго рефлектора с исследуемой пробой, в которой возбуждается флуоресцентное характеристическое излучение, регистрируемое энергодисперсионным детектором.

Волосы для анализа состригают с затылочной части головы, масса навески - 10 мг. Пробу волос растворяют в 20 мл концентрированной азотной кислоты марки «ОСЧ» в кювете объемом 20 мл с притертой пробкой. В раствор вносят 10 мкл раствора «внутреннего стандарта». Жидкость должна наполнять кювету до краев во избежание улетучивания ХЭ, содержащихся в ней. Затем раствор нагревают в муфельном шкафу при температуре 60 градусов в течение 40 минут, затем он охлаждается до комнатной температуры. На рентгеновское зеркало размещают исследуемую пробу в виде тонкой пленки, толщиной до 10 мкм.

Полученный раствор анализируют методом рентгенофлуоресцентного анализа. Для этого на рентгеновское зеркало спектрометра размещают каплю объемом около 10 мкл. Ее высушивают до получения сухого остатка при температуре не более 40 градусов. Далее регистрируют спектр в течение 300 секунд. В качестве вторичного излучателя при выполнении регистрации спектров применяют Мо (17,4 КэВ). После этого на рентгеновское зеркало в это же место сверху наносят еще одну каплю. Это проделывают 5-8 раз (выполняется концентрирование пробы). Полученные 8 спектров накладывают друг на друга и анализируют. Экспериментальный спектр аппроксимируют суммой гауссовых функций и площади аналитических линий, определяемых ХЭ, вычисляют как их интегралы. Перерасчет площадей линий в единицы массы осуществляют методом коэффициентов относительно линии внутреннего стандарта.

Рассчитывают соотношения концентраций пар ХЭ-антагонистов Pb/Zn, Se/Pb, Pb/Cu.

При обнаружении отклонений перечисленных показателей не менее чем в 2 раза от нормативов диагностируют у данной пациентки НМЦ микроэлементозной этиологии.

Пример 1

Пациентка Б-ая, 1996 г. рождения, обратилась по поводу неустановившегося в течение 2 месяцев менструального цикла. Проведено исследование уровня АЛК в моче, который составил 19,8 мкг/сут, что входит в разброс нормы. Следовательно, думать о микроэлементозе, создаваемом повышенным содержанием свинца и недостаточным содержанием эссенциальных ХЭ, как о причине аномалии менархе, не было оснований. Это было подтверждено и результатами исследований концентраций ХЭ в волосах по описанной методике, с последующим вычислением коэффициентов их соотношений (Рв/Zn:0,012; Se/Pb:0,42; Pb/Cu:0,10), что соответствовало норме. Проведенные дополнительные клинико-лабораторные исследования позволили диагностировать психоэмоциональную этиологию «задержки» становления менструального цикла. Назначенная психорелаксирующая терапия в сочетании с общеукрепляющими физиотерапевтическими процедурами, витаминными препаратами позволила быстро добиться желаемых лечебных результатов. У девушки установился нормальный двухфазный менструальный цикл.

Пример 2

Пациентка Г-ева, 1993 г. рождения, обратилась по поводу дизритмии менструального цикла в течение последних 6 месяцев (менструации начались 2 года назад). Исследование уровня АЛК в моче выявило значительно повышенный уровень - 70,8 мкМ/сут. Это указывало микроэлементозную этиологию НМЦ. Дополнительно проведено исследование химических элементов в волосах по описанной методике. В результате были выявлены сниженные уровни концентраций меди, цинка, селена, концентрация марганца была в пределах разброса биологически допустимых значений. Соотношения пар ХЭ-антагонистов Рв/Zn:0,049; Se/Pb:0,08; Pb/Cu:0,0358, что резко выходит за пределы нормативных разбросов данных коэффициентов для здоровых девушек. Следовательно, можно говорить о том, что в данном случае НМЦ имеет выраженную микроэлементозную этиологию. Последствием МЭ явилось снижение продукции половых гормонов (эстрадиола, прогестерона), выявленное в последующих исследованиях. Был поставлен диагноз - недостаточность лютеиновой фазы цикла микроэлементозной этиологии. Девушке была назначена соответствующая этиопатогенетическая терапия. В ее состав входили гормональные препараты, витаминно-минеральные комплексы, а также сорбенты. Такая модификация медикаментозной схемы позволила добиться терапевтического эффекта после завершения курса лечения.

Нами было проведено исследование указанных химических элементов в волосах у девушек с нормальным менструальным циклом, проживающих в «чистых» районах города (группа сравнения), и в волосах девушек, проживающих в промзоне пригородов, страдающих несколько месяцев НМЦ. В обеих группах было по 20 человек. Возраст обеих групп был одинаковым - 14-17 лет. Все девушки были обследованы детским гинекологом, было исключено возможное участие в возникновении НМЦ воспалительных заболеваний половых путей инфекционной природы.

Согласно сценарию исследований определены концентрации ХЭ в пробах волос (табл.1) и показатели АЛК в моче (табл.3). Обращало внимание, что для девушек, страдающих НМЦ, характерным был более высокий уровень свинца в волосах. Концентрации селена, меди, цинка были ниже таковых в группе сравнения. Значения концентрации марганца отличались от контрольных незначительно. Достоверность различий рассчитывали по критерию Стьюдента.

Соотношения пар функциональных антагонистов были значительно изменены. Особенно это имело место у девушек с более длительным сроком течения НМЦ (табл.2).

Проведенные дополнительные клинико-лабораторные обследования показали идентичный вектор изменений секреции прогестерона и коэффициентов соотношений пар селен/свинец, свинец/медь (снижение). Обращено внимание на то, что повышение уровня свинца и, соответственно, АЛК, даже при незначительно сниженном уровне его функциональных антагонистов (селен, цинк, медь), сопровождалось негативными тенденциями в продукции указанного гормона яичников. Патологию НМЦ диагностировали как «недостаточность лютеиновой фазы цикла».

Таблица 1 Концентрация ХЭ в волосах девушек обследуемых групп (мкг/г) Группы обследуемых Химические элементы Se Cu Mn Zn Pb Здоровые девушки (группа сравнения) 2,0±0,2 48,5±3,3 1,8±0,08 328,0±7,5 5,1±0,3 Девушки с длительностью НМЦ не более 3 мес 1,7±0,1 39,1±2,6 1,6±0,07 276,8±7,0 8,5±0,7 Девушки с длительностью НМЦ не более 6 мес 1,1±0,07* 32,1±2,4* 1,5±0,06* 245,3±6,7* 11,8±1,2* * - Отмечены значения, достоверно отличающиеся от контроля. Таблица 2 Значения соотношений ХЭ у девушек обследуемых групп Группы обследуемых Коэффициенты Рв/Zn Se/Pb Pb/Cu Здоровые девушки (группа сравнения,) 0,015 0,40 0,11 Девушки с длительностью НМЦ не более 3 мес 0,032 0,20 0,216 Девушки с длительностью НМЦ не более 6 мес 0,041 0,09 0,351 Таблица 3 Концентрации АЛК в моче девушек обследуемых групп Группы обследуемых Показатели АЛК в суточной моче, мкг/сут Здоровые девушки (группа сравнения)
Девушки с длительностью 28,9±2,1 НМЦ не более 3 мес 54,7±4,8* Девушки с длительностью НМЦ не более 6 мес 69,7±5,4* * - Отмечены значения, достоверно отличающиеся от контрольных.

Возрастание выше нормы показателей АЛК (разброс значений нормы 9,9-53,4 мкМ/сут - собственные и литературные данные (В.М.Лифшиц и др. Биохимические анализы в клинике, 2006) указывало на то, что биологическое действие находящейся в организме концентрации свинца не является для него не существенной. Она не может быть нейтрализована регуляторными механизмами, как это происходит при оптимальных концентрациях ХЭ. Следовательно, возникающие эндокринные дисфункции (снижение прогестерона) имеют микроэлементозную этиологию. Их патогенез связан с токсическим влиянием свинца и продуктов его метаболизма на гипофизарно-гонадную секрецию.

Таким образом, учитывая значения концентраций указанных химических элементов, соотношения пар функциональных антагонистов у конкретной обследуемой и, в качестве косвенного подтверждения МЭ природы процесса, показателя АЛК, можно диагностировать НМЦ микроэлементозной этиологии. Это можно осуществить еще на донозологическом этапе, не подвергая пациентку инвазивным методам обследования при скрининговых экспресс-исследованиях соответствующего профиля.

Исследование химических элементов в волосах с целью выявления этиологического аспекта НМЦ и определения пациенток, относящихся к группе риска по данной нозологии, является новым этапом в изучении проблемы патологии репродукции. По сравнению с прототипом разработанный метод более точен, его можно отнести к экспресс-анализу, информативному в аспекте генеза заболевания. С учетом выявленных этиопатогенетических особенностей нарушений репродуктивного здоровья можно улучшить эффективность восстановительных мероприятий, направленных на коррекцию гормональной секреции яичников.

Преимуществом заявляемого метода является также то, что образцы проб биосубстратов (в данном случае - волос) могут быть доставлены на исследование почтой или любым другим видом доставки, что особенно актуально для труднодоступных районов проживания населения, возможен анонимный характер исследований.

Заявляемый способ ранней диагностики нарушений функции яичников микроэлементозной этиологии у девушек, проживающих в экологически неблагоприятных районах, апробирован в клинике и может быть рекомендован к использованию в амбулаторных условиях.

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, и может быть использовано для диагностики девушек с нарушениями функции яичников, в частности нарушений менструального цикла (НМЦ) микроэлементозного генеза. У девушек, проживающих в экологически неблагоприятных районах, определяют в моче уровень АЛК, и если он превышает значение 53,2 мкМ/сут, то дополнительно проводят отбор проб волос, в которых определяют концентрации таких химических элементов, как медь, цинк, селен, свинец. Рассчитывают соотношения концентраций пар ХЭ-антагонистов Pb/Zn, Se/Pb, Pb/Cu. При обнаружении отклонений перечисленных показателей не менее чем в 2 раза от нормативов диагностируют у данной пациентки НМЦ микроэлементозной этиологии. Способ обеспечивает раннее выявление признаков НМЦ микроэлементозного генеза и исключает необходимость проведения специфических инвазивных дорогостоящих лабораторных исследований репродуктивной системы. 3 табл.

Способ ранней диагностики нарушений функции яичников микроэлементозной этиологии у девушек, проживающих в экологически неблагоприятных районах, путем исследования биосубстрата пациента, отличающийся тем, что предварительно определяют в моче уровень аминолевулиновой кислоты (АЛК) и, если он превышает значение 53,2 мкМ/сут, то дополнительно проводят исследование волос данной пациентки, в которых методом рентгенофлуоресцентного анализа определяют концентрации таких химических элементов как медь, цинк, селен, свинец и рассчитывают соотношения концентраций пар Pb/Zn, Se/Pb, Pb/Cu, если полученные показатели не менее чем в 2 раза отличаются от нормативов пар Pb/Zn=0,015, Se/Pb=0,40, Pb/Cu=0,11, диагностируют нарушение менструального цикла микроэлементозной этиологии.