НЕЙРОЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ РАСТВОРИМОЙ УРСОДЕЗОКСИХОЛЕВОЙ КИСЛОТЫ В МОДЕЛЯХ ФОКАЛЬНОЙ ИШЕМИИ Российский патент 2011 года по МПК A61K31/575 A61K47/36 A61P25/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к системе и способу создания прозрачных водных растворов одной или нескольких желчных кислот, способных ослабить воздействие инсульта.

ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствии с последними статистическими данными по оценкам в США каждый год первичный инсульт поражает свыше 400000 человек. Кроме того, инсульт может являться основной причиной инвалидности и третьей по значимости причиной летального исхода. Риск поражения мужчин инсультом, возможно, выше, чем у женщин. Приблизительно 80% всех инсультов могут представлять острые ишемические инсульты (ввиду, например, внутричерепного тромбоза либо внечерепной эмболии). Приблизительно четверть всех инсультов поражает людей моложе 65 лет, показатель, в некоторой степени, противоречащий сложившемуся мнению, что инсульт - это болезнь пожилых людей.

Ишемический каскад может возникнуть с первых секунд или минут вследствие прекращения перфузии в головной мозг. Отсутствие терапевтического вмешательства приводит к неврологическому повреждению. Указанное повреждение может быть разделено на два участка: область инфаркта, в которой повреждение может быть необратимым, и область ишемической полутени, в которой повреждение может быть обратимым. Тем не менее, спустя несколько часов и дней после прекращения циркуляции крови повреждение в области полутени, так же как и в области инфаркта, становится необратимым.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таким образом, существует необходимость в методах лечения, которые позволили бы сократить объем инфаркта и (или) сохранить неврологическую функцию. Соответственно, настоящее изобретение относится к композициям желчной кислоты, позволяющим сократить объем инфаркта и (или) улучшить функциональное восстановление после ишемического инсульта. Согласно некоторым примерам осуществления изобретения, не ограниченным каким-либо конкретным механизмом действия, указанное выше может быть достигнуто путем ингибирования апоптоза и (или) повышения экспрессии eNOS. Одна особенность настоящего изобретения заключается в том, что предлагается создание композиций, включающих: (1) желчную кислоту, производное желчной кислоты, соль желчной кислоты или желчную кислоту, конъюгированную с амином, (2) воду и (3) достаточное количество водорастворимого продукта гидролиза крахмала таким образом, чтобы желчная кислота и продукт гидролиза крахмала оставались в растворе при любом рН в выбранном диапазоне рН.

Изобретение также относится к композиции, содержащей 1) желчную кислоту, производное желчной кислоты, соль желчной кислоты или желчную кислоту, конъюгированную с амином, (2) воду и (3) достаточное количество водорастворимого некрахмального полисахарида таким образом, чтобы желчная кислота и полисахарид оставались в растворе при любом рН в выбранном диапазоне рН.

Изобретение далее относится к фармацевтической композиции, содержащей 1) желчную кислоту, производное желчной кислоты, соль желчной кислоты или желчную кислоту, конъюгированную с амином, (2) воду и (3) фармацевтическое соединение в фармацевтически приемлемом количестве и 4) достаточное количество водорастворимого продукта гидролиза крахмала и водорастворимого некрахмального полисахарида таким образом, чтобы желчная кислота, фармацевтическое соединение и углевод оставались в растворе при любом рН в выбранном диапазоне рН. В соответствии с одним неограничивающим примером осуществления настоящего изобретения фармацевтическое соединение может быть противоинсультной терапевтической молекулой или смесью.

Изобретение дополнительно относится к лекарственным формам раствора композиций желчной кислоты. Указанные лекарственные формы раствора могут проявлять повышенную биологическую доступность, и (или) всасываемость, и (или) мембранную проницаемость желчной кислоты. Указанные лекарственные формы раствора также могут проявлять повышенную биологическую доступность, и (или) всасываемость, и (или) мембранную проницаемость фармацевтического соединения. Кроме того, присутствие желчной кислоты позволяет снизить или устранить токсичность и (или) побочный (-е) эффект (-ы) фармацевтических препаратов.

В ряде примеров осуществления изобретения предлагается создание композиции, содержащей 1) желчную кислоту, производное желчной кислоты, соль желчной кислоты или желчную кислоту, конъюгированную с амином, (2) воду и (3) достаточное количество углевода таким образом, чтобы компонент желчной кислоты и углевод оставались в растворе при любом рН в выбранном диапазоне рН, в которой углевод представляет собой сочетание водорастворимого продукта гидролиза крахмала и водорастворимого некрахмального полисахарида. В примерах осуществления изобретения, содержащих как водорастворимый некрахмальный полисахарид, так и высокомолекулярный продукт гидролиза крахмала, количество каждого вещества является таковым, что при смешивании в композиции оно является достаточным для того, чтобы обеспечить сохранение компонента желчной кислоты, высокомолекулярного продукта гидролиза крахмала, водорастворимого некрахмального полисахарида и фармацевтического соединения, если таковые имеются, в растворе при любом рН в выбранном диапазоне рН.

В ряде примеров осуществления изобретения предусматривается создание композиции комбинированной терапии, которая может повысить интенсивность реакции на фармацевтический препарат либо его эффективность. Такая композиция обеспечивает введение меньших доз фармацевтического соединения, воздействие на комплекс болезни в различных точках и влияние на устранение и (или) изменение всасывания фармацевтического соединения. Композиции в соответствии с изобретением могут в ряде примеров осуществления изобретения привести к снижению или способствовать снижению токсичности и (или) побочных эффектов фармацевтического препарата.

В ряде примеров осуществления изобретения настоящее изобретение относится к способам сокращения объема инфаркта ишемического инсульта у человека, перенесшего ишемический инсульт или подверженного риску ишемического инсульта. Такие способы могут включать введение испытуемому композиции, содержащей (а) продукт желчной кислоты, выбранный из группы, состоящей из желчной кислоты, водорастворимого производного желчной кислоты, соли желчной кислоты и желчной кислоты, конъюгированной с амином путем амидной связи; (b) углевод, выбранный из группы, состоящей из водорастворимого продукта гидролиза крахмала или водорастворимого некрахмального полисахарида; и с) воду, в которых как продукт желчной кислоты, так и углевод остаются в растворе при всех значениях рН раствора в выбранном диапазоне значений рН и в которых обеспечивается сокращение объема инфаркта.

В ряде примеров осуществления изобретения настоящее изобретение относится к способам улучшения функционального восстановления человека, перенесшего ишемический инсульт или подверженного риску ишемического инсульта. В соответствии с рядом примеров осуществления изобретения функциональное восстановление может включать без ограничений восстановление любой неврологической, когнитивной, сенсорной и (или) моторной функции. Такие способы могут включать введение испытуемому композиции, содержащей (а) продукт желчной кислоты, выбранный из группы, состоящей из желчной кислоты, водорастворимого производного желчной кислоты, соли желчной кислоты и желчной кислоты, конъюгированной с амином путем амидной связи; (b) углевод, выбранный из группы, состоящей из водорастворимого продукта гидролиза крахмала или водорастворимого некрахмального полисахарида; и с) воду, в которых как продукт желчной кислоты, так и углевод остаются в растворе при всех значениях рН раствора в выбранном диапазоне значений рН и в которых обеспечивается улучшение функционального восстановления.

В соответствии с рядом примеров осуществления изобретение относится к способам снижения объема инфаркта путем повышения экспрессии eNOS у человека, перенесшего ишемический инсульт или подверженного риску ишемического инсульта. Такие способы могут включать введение испытуемому композиции, содержащей (а) продукт желчной кислоты, выбранный из группы, состоящей из желчной кислоты, водорастворимого производного желчной кислоты, соли желчной кислоты и желчной кислоты, конъюгированной с амином путем амидной связи; (b) углевод, выбранный из группы, состоящей из водорастворимого продукта гидролиза крахмала или водорастворимого некрахмального полисахарида; и с) воду, в которых как продукт желчной кислоты, так и углевод остаются в растворе при всех значениях рН раствора в выбранном диапазоне значений рН и в которых обеспечивается повышение экспрессии eNOS.

В ряде примеров осуществления изобретения настоящее изобретение относится к способам повышения функционального ингибирования апоптоза и повышения экспрессии eNOS у человека, перенесшего ишемический инсульт или подверженного риску ишемического инсульта. Такие способы могут включать введение испытуемому композиции, содержащей (а) продукт желчной кислоты, выбранный из группы, состоящей из желчной кислоты, водорастворимого производного желчной кислоты, соли желчной кислоты и желчной кислоты, конъюгированной с амином путем амидной связи; (b) углевод, выбранный из группы, состоящей из водорастворимого продукта гидролиза крахмала или водорастворимого некрахмального полисахарида; и с) воду, в которых как продукт желчной кислоты, так и углевод остаются в растворе при всех значениях рН раствора в выбранном диапазоне значений рН и в которых обеспечивается снижение апоптоза и повышение экспрессии eNOS.

В ряде примеров осуществления изобретения настоящее изобретение относится к способам лечения ишемического инсульта (например, лечение, уменьшение интенсивности или снятие, по меньшей мере, одного симптома, связанного с ишемическим инсультом) у людей, перенесших ишемический инсульт или подверженных риску ишемического инсульта. Такие способы могут включать введение испытуемому композиции, содержащей (а) продукт желчной кислоты, выбранный из группы, состоящей из желчной кислоты, водорастворимого производного желчной кислоты, соли желчной кислоты и желчной кислоты, конъюгированной с амином путем амидной связи; (b) углевод, выбранный из группы, состоящей из водорастворимого продукта гидролиза крахмала или водорастворимого некрахмального полисахарида; и с) воду, в которых как продукт желчной кислоты, так и углевод остаются в растворе при всех значениях рН раствора в выбранном диапазоне значений рН и в которых обеспечивается лечение ишемического инсульта (например, по меньшей мере, одного симптома ишемического инсульта).

В соответствии с рядом примеров осуществления изобретения настоящее изобретение относится к способам доставки вещества желчной кислоты к головному мозгу (например, через гематоэнцефалический барьер) испытуемого. Такие способы могут включать введение испытуемому композиции, содержащей (а) продукт желчной кислоты, выбранный из группы, состоящей из желчной кислоты, водорастворимого производного желчной кислоты, соли желчной кислоты и желчной кислоты, конъюгированной с амином путем амидной связи; (b) углевод, выбранный из группы, состоящей из водорастворимого продукта гидролиза крахмала или водорастворимого некрахмального полисахарида; и с) воду, в которых как продукт желчной кислоты, так и углевод остаются в растворе при всех значениях рН раствора в выбранном диапазоне значений рН и в которых обеспечивается доставка вещества желчной кислоты к головному мозгу.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

В материалах заявки на выдачу патента содержится, по меньшей мере, один выполненный в цвете рисунок. Копии указанного патента или публикации заявки на выдачу патента с цветным (-ми) чертежом (-ами) будут предоставлены Ведомством по патентным и товарным знакам США по запросу и после осуществления платежа требуемого сбора.

Ряд конкретных иллюстративных примеров осуществления изобретения очевиден частично из следующего ниже описания со ссылками на прилагаемые чертежи, на которых:

Фиг.1А - коронарные срезы мозга мышей, окрашенные по протоколу Ниссля;

Фиг.1В - графическое изображение объема инфаркта на 2-й и 7-й день после реперфузии (данные представлены в виде средних значений ±SD (стандартное отклонение) (n=6 соответственно);

Фиг.2А - графическое изображение результатов теста Rotarod (в каждой группе находилось девять мышей; звездочка (“*”) означает Р<0,05, тест Mann-Whitney U);

Фиг.2В - графическое изображение результатов модифицированного теста расположения конечностей (в каждой группе находилось девять мышей; звездочка (“*”) означает Р<0,05, тест Mann-Whitney U);

Фиг.3А - микрофотоснимки клеток в области ишемической полутени после мечения по методу TUNEL;

Фиг.3В - графическое представление количества TUNEL-позитивных клеток на одно поле в контралатеральном и ипсилатеральном полушариях (данные представлены в виде средних значений ±S.D. (стандартное отклонение) (штрихи));

Фиг.3С - графическое представление активности каспазы (в произвольных единицах), наблюдаемое в каждой группе, прошедшей лечение (данные представлены в виде средних значений ±S.D. (стандартное отклонение); и

Фиг.4 - экспрессия eNOS, измеренная с помощью анализа Western blot.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Урсодезоксихолевая кислота (3α-7β-дигидрокси-5β-холановая кислота) (UDCA), основной компонент медвежьей желчи, и иные формы желчной кислоты являются высокогидрофобными. Многие формы нерастворимы в водном растворе при физиологическом и кислотном рН (например, ниже приблизительно рН 8,4). Кроме того, несмотря на то, что UDCA и другие желчные кислоты могут хорошо переноситься при пероральном приеме, они могут иметь остро-горький и неприятный вкус и послевкусие.

Фармакологические действия урсодезоксихолевой кислоты могут включать без ограничений обусловленные дозой: (1) замену и (или) вытеснение токсичных желчных кислот, (2) цитопротективные эффекты, (3) стабилизацию и (или) защиту клеточных мембран, (4) антиапоптотические эффекты, (5) иммуномодуляторные эффекты (например, обусловленные активацией внутриклеточного глюкокортикоидного рецептора), (6) противовоспалительные эффекты, обусловленные репрессией NF-kB и ингибированием индукции синтазы окиси азота), (7) стимулирование секреции желчи и (8) стимулирование экзоцитоза и вставка каналикулярных мембранных транспортеров.

Некоторые формы желчной кислоты могут оказаться полезными в качестве терапевтических средств для одного или нескольких состояний. Например, урсодезоксихолевая кислота может являться полезной для лечения одного или нескольких состояний, включающих без ограничения защиту против многих типов заболеваний печени. Ее использование в области медицины может включать растворение лучепроницаемых желчных камней и лечение одного или нескольких холестатических заболеваний, включающих без ограничения первичный биллиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, внутрипеченочный холестаз при беременности, заболевания печени, связанные с кистозным фиброзом, педиатрические заболевания печени и хроническую гомологичную болезнь печени.

Несмотря на указанные полезные фармакологические свойства желчных кислот в качестве терапевтически активных средств и в качестве носителей и (или) адъювантов, коммерческое использование желчных кислот может быть ограничено низкой растворимостью и (или) биологической доступностью. Например, многие лекарственные формы желчной кислоты включают твердые вещества из желчной кислоты либо в качестве компонента таблетки, либо в качестве частицы и (или) осадка в растворе или суспензии. Указанные лекарственные формы могут включать кристаллы желчной кислоты, характеризующиеся низкой растворимостью при рН от 1 до 8. Растворение кристаллов урсодезоксихолевой кислоты может быть исключительно медленным и неполным.

В ряде случаев может быть абсорбировано менее приблизительно от 30% до приблизительно 60% введенной урсодезоксихолевой кислоты. Абсорбция, в основном, происходит в тонком кишечнике путем пассивной неионной диффузии, ограниченной растворением. Повышение растворимости кристаллов урсодезоксихолевой кислоты может оказаться возможным при эндолюминальном рН свыше приблизительно 8,4, однако указанное значение было невозможно достичь in vivo в процессе либо панкреатической, либо дуоденальной секреции. Таким образом, многие существующие формы желчной кислоты имеют ограниченную биологическую доступность. Это, в свою очередь, означает, что уровни желчи в систематической циркуляции после введения многих существующих форм урсодезоксихолевой кислоты могут оказаться исключительно низкими. Таким образом, многие существующие лекарственные формы желчной кислоты характеризуются ограниченной полезностью для системной доставки урсодезоксихолевой кислоты и даже еще меньшей полезностью для доставки урсодезоксихолевой кислоты к головному мозгу.

Гепатоциты могут поглощать и конъюгировагь урсодезоксихолевую кислоту и затем экскретировать ее в желчь во время процесса, называемого очищением «первого прохода». Концентрация урсодезоксихолевой кислоты в желчи может достичь максимума в течение от приблизительно 1 до приблизительно 3 часов после введения. Свободная урсодезоксихолевая кислота в желчи может быть реабсорбирована холангиоцитами. Данное явление, называемое холегепатическим шунтированием, может быть связано с повышенной секрецией биллиарного бикарбоната. Степень накопления урсодезоксихолевой кислоты в желчи биллиарной системы после длительного приема вовнутрь может коррелироваться с ее ежедневно принимаемой дозой. При использовании ряда существующих лекарственных форм урсодезоксихолевой кислоты дозы свыше 10±12 мг/кг в день не могут в дальнейшем увеличить пропорцию урсодезоксихолевой кислоты в желчи. Это может быть обусловлено ее эпимеризацией в хенодезоксихолевую кислоту и (или) невозможностью ингибировать гепатический синтез первичных желчных кислот.Таким образом, абсорбция урсодезоксихолевой кислоты может фактически снизиться при увеличении доз урсодезоксихолевой кислоты с использованием существующих лекарственных форм. Следовательно, существует необходимость в желчных композициях, имеющих повышенную растворимость, биологическую доступность и (или) мембранную проницаемость. Кроме того, существует необходимость в желчных композициях, в меньшей степени подверженных эпимеризации урсодезоксихолевой кислоты в хенодезоксихолевую кислоту.

В соответствии с рядом примеров осуществления настоящего изобретения соли, прекурсоры и (или) производные урсодезоксихолевой кислоты могут оказать благоприятный эффект на людей, страдающих от прекращения кровотока к тканям головного мозга. Препятствиями для терапевтической доставки желчных кислот к головному мозгу могут являться энтерогепатическое циркуляторное действие урсодезоксихолевой кислоты, исключительно низкая концентрация урсодезоксихолевой кислоты в крови и пониженная мембранная проницаемость, обусловленная высокой гидрофильностью и кислотным характером. Примеры осуществления настоящего изобретения предусматривают создание желчных лекарственных форм, которые позволяют уменьшить или преодолеть указанные недостатки.

В соответствии с конкретными иллюстративными примерами осуществления настоящего изобретения был проведен тест на нейропротективный эффект растворимой лекарственной формы желчной кислоты. Были подготовлены шестьдесят три крысы с транзиторной фокальной ишемией по модели транзиторной фокальной ишемии. Непосредственно после реперфузии в пяти группах были введены один раз различные дозы растворимой урсодезоксихолевой кислоты (UDCA): только физиологический раствор, 25 мг UDCA/кг, 100 мг UDCA/кг, 400 мг UDCA/кг и 400 мг TUDCA (тауроурсодезоксихолевая кислота)/кг соответственно. В каждой группе проводили измерение объема инфаркта и функционального результата, и мозг животных был изъят для проведения анализов на содержание желчной кислоты. Произошло сокращение объема инфаркта и увеличение количества баллов при проведении поведенческих тестов у крыс, лечение которых проводилось с использованием растворимой урсодезоксихолевой кислоты. В группе, прошедшей лечение растворимой урсодезоксихолевой кислотой, наблюдалось сокращение TUNEL-позитивных клеток в границах области полутени, более низкая активность каспазы и высокая церебральная концентрация урсодезоксихолевой кислоты. Таким образом, не ограничиваясь любым конкретным механизмом действия, растворимая урсодезоксихолевая кислота может оказать нейрозащитное воздействие против церебральной ишемии благодаря антиапоптическому механизму и (или) противовоспалительному действию.

В ряде примеров осуществления изобретения растворимые желчные кислоты могут включать без ограничения любой тип водорастворимых желчных кислот. В ряде примеров осуществления изобретения соль желчной кислоты может являться любой водорастворимой солью желчной кислоты. В соответствии с рядом примеров осуществления изобретения водорастворимые соли желчных кислот могут быть образованы путем реакции вышеописанных желчных кислот с амином, включая без ограничения алифатические свободные амины, такие как триентин, диэтилен-триамин, тетраэтилен пентамин и основные аминокислоты, такие как аригинин, лизин, орнитин и аммиак, и аминосахара, такие как D-глюкамин, N-алкилглюкамин, и четвертичные производные аммиака, такие как холин, гетероциклические амины, такие как пиперазин, N-алкипиперазин, пиперидин, N-аклипиперидин, морфолин, N-алкилморфолин, пирролидин, триэтаноламин и триметаноламин. В соответствии с рядом конкретных примеров осуществления изобретения водорастворимые металлические соли желчных кислот, соединение включения между желчной кислотой и циклодекстрином и его производные и водорастворимые O-сульфированные желчные кислоты также могут быть включены в качестве растворимых солей желчных кислот.

Растворимые производные желчных кислот в соответствии с настоящим изобретением могут представлять собой производные, являющиеся растворимыми в такой же степени, как и соответствующая недериватизированная желчная кислота или в большей степени, чем соответствующая недериватизированная желчная кислота. Производные желчной кислоты включают без ограничения производные, образованные в группах гидроксильных и карбоновых кислот желчной кислоты с другими функциональными группами, включающими без ограничения галогены и аминогруппы. Растворимая желчная кислота может включать водный препарат свободной кислотной формы желчной кислоты в сочетании с неорганической кислотой (например, соляной кислотой, серной кислотой, фосфорной кислотой и кислым фосфатом) и (или) органической кислотой (например, лимонной кислотой, винной кислотой и уксусной кислотой).

В соответствии с рядом примеров осуществления настоящего изобретения желчные кислоты могут включать без ограничения урсодезоксихолевую кислоту, хенодезоксихолевую кислоту, холевую кислоту, гиодезоксихолевую кислоту, дезоксихолевую кислоту, 7-оксолитохолевую кислоту, литохолевую кислоту, йододезоксихолевую кислоту, иохолевую кислоту, тауроурсодезоксихолевую кислоту, таурохенодезоксихолевую кислоту, тауродезоксихолевую кислоту, тауролитохолевую кислоту, гликоурсодезоксихолевую кислоту, таурохолевую кислоту, гликохолевую кислоту и их производные при группе гидроксильной и карбоновой кислот на стероидном ядре. Тем не менее, в ряде примеров осуществления изобретения композиция согласно изобретению может включать одну или несколько из вышеперечисленных желчных кислот (например, тауроурсодезоксихолевую кислоту).

В ряде примеров осуществления изобретения доставка желчной кислоты (например, урсодезоксихолевой кислоты) в растворе может достичь более высоких уровней желчной кислоты (например, урсодезоксихолевой кислоты) in vivo, чем существующие препараты. Таким образом, терапевтический потенциал желчной кислоты (например, урсодезоксихолевой кислоты) может быть более полно достигнут по сравнению с существующими составами. Ввиду того, что желчная кислота может быть полностью растворена в составе согласно настоящему изобретению, более высокие уровни желчной кислоты in vivo могут быть достигнуты в ряде примеров осуществления изобретения даже при введении меньших доз.

Гормон может быть введен с помощью любого эффективного метода, через любое отверстие и (или) через кожу, но не ограничивается ими. Например, пути введения могут включать пероральное введение, сублингвальное введение, парентеральное введение, интрадермальную инъекцию, подкожную инъекцию, внутрищитовидную инъекцию, внутривенную инъекцию, интраназальное введение, трансдермальное введение и трансконъюктивальное введение.

В ряде примеров осуществления изобретения композиции согласно изобретению могут иметь форму, выбранную из группы, включающей таблетки для приема вовнутрь, таблетки для медленного растворения в щечном кармане, лепешки, капсулы, эликсиры, суспензии, сиропы, облатки, пилюли, гранулы, порошки, крахмальные капсулы, эмульсии, жидкости, аэрозоли, мягкие или твердые желатиновые капсулы, стерилизованные жидкости для инъекций, стерилизованные порошки и т.п.

В ряде примеров осуществления изобретения несколько желчных кислот могут быть использованы в одной лекарственной форме. Смеси двух или нескольких желчных кислот, характеризующиеся различной гидрофобной активностью, могут вести себя как одна желчная соль промежуточной гидрофобной активности. В результате этого слабительные свойства и токсичность смесей двух желчных кислот различной гидрофобной активности могут быть промежуточными между отдельными компонентами.

Углеводы, приемлемые для использования в настоящем изобретении, могут включать водорастворимые продукты гидролиза крахмала и водорастворимые некрахмальные полисахариды. В соответствии с рядом примеров осуществления настоящего изобретения водорастворимые продукты гидролиза крахмала могут включать углеводы, полученные непосредственно путем частичного, или неполного, гидролиза крахмала при различных условиях рН. Неограничивающие примеры могут включать мальтодекстрин, декстрин, жидкую глюкозу, твердые вещества кукурузной патоки (высушенный порошок жидкой глюкозы) и растворимый крахмал. В ряде примеров осуществления изобретения углеводы могут быть выбраны из группы, состоящей из MALTRIN® М200, MALTRIN® М2050 - твердые частицы кукурузной патоки - и MALTRIN® М700, MALTRIN® M040, MALTRIN® M050, MALTRIN® M100, MALTRIN® M150, MALTRIN® M180 - мальтодекстрин, при этом оба продукта могут быть произведены GPC®, Grain Processing Corporation of Muscatine, Iowa. В настоящем примере осуществления изобретения термин «кукурузная патока» может включать как кукурузную патоку, так и жидкую глюкозу. Если продукт гидролиза крахмала является полимерным, полимер может иметь, по меньшей мере, один редуцирующий конец и, по меньшей мере, один нередуцирующий конец и может быть линейным или разветвленным. Молекулярный вес может составлять приблизительно от 100 единиц массы до более 106 единиц массы.

В соответствии с рядом примеров осуществления настоящего изобретения водорастворимые некрахмальные полисахариды могут быть получены при различных условиях рН с использованием разнообразных гидролитических или синтетических механизмов. Неограничивающие примеры включают декстран, гуаровую камедь, пектин и трудноперевариваемые растворимые волокна. Если продукт является полимерным, полимер может иметь, по меньшей мере, один редуцирующий конец и, по меньшей мере, один нередуцирующий конец. Полимер может быть линейным или разветвленным. Молекулярный вес может составлять приблизительно от 100 единиц массы до более 106 единиц массы.

Количество высокомолекулярного водорастворимого продукта гидролиза крахмала и (или) растворимого некрахмального полисахарида, используемых в примерах осуществления изобретения, является, по меньшей мере, количеством, необходимым для обеспечения выбранной(-ым) желчной(-ым) кислоте(-ам) состояния растворимости в препарате в требуемой концентрации и в требуемом диапазоне рН. В ряде примеров осуществления изобретения приблизительное минимальное весовое отношение мальтодекстрина к урсодезоксихолевой кислоте, необходимое для предотвращения осаждения урсодезоксихолевой кислоты, может составлять 6:1 (т.е. 1,2 г на каждые 0,2 г урсодезоксихолевой кислоты, 6 г на каждый 1 г урсодезоксихолевой кислоты и 12 г на каждые 2 г урсодезоксихолевой кислоты в 100 мл воды). В ряде примеров осуществления изобретения приблизительное минимальное количество мальтодекстрина может составлять 30 г на каждые 200 мг хенодезоксихолевой кислоты, 12 г на каждые 200 мг, 7-кетолитохолевой кислоты, 10 г на каждые 200 мг холевой кислоты и 50 г на каждые 200 мг дезоксихолевой кислоты. В ряде примеров осуществления изобретения приблизительное минимальное весовое отношение жидкой глюкозы (промышленная светлая кукурузная патока) к урсодезоксихолевой кислоте, необходимое для предотвращения осаждения желчных кислот из водного раствора лекарственных форм изобретения, может составлять приблизительно 160:1 (т.е. 80 г на каждые 500 мг урсодезоксихолевой кислоты в 100 мл воды и 80 г на каждые 500 мг урсодезоксихолевой кислоты в 200 мл воды). Минимальное требуемое количество высокомолекулярных водорастворимых продуктов гидролиза крахмала или растворимого некрахмального полисахарида может быть определено, в первую очередь, на основе абсолютного количества желчных кислот в растворе лекарственной формы, а не на основе концентрации.

В ряде примеров осуществления изобретения лекарственная форма может содержать циклодекстрин дополнительно к продукту гидролиза крахмала и (или) к некрахмальному полисахариду. В других примерах осуществления изобретения композиции изобретения включают циклодекстрин и его производные.

В ряде примеров осуществления изобретения лекарственная форма дополнительно включает пищевую клетчатку. Неограничивающие примеры пищевой клетчатки могут включать гуаровую камедь, пектин, подорожник, овсяную камедь, соевую клетчатку, овсяные отруби, кукурузные отруби, целлюлозу и пшеничные отруби.

В ряде примеров осуществления изобретения лекарственная форма может дополнительно включать эмульгирующий продукт. В ряде примеров осуществления изобретения эмульгирующий продукт может включать эмульгирующие вещества и суспендирующие вещества. Неограничивающие примеры эмульгирующих веществ могут включать гуаровую камедь, пектин, камедь, каррагенан, карбоксиметилцеллюлозу натрия, гидроксиметилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, метилцеллюлозу, поливиниловый спирт, повидон, трагакантовую камедь, ксантановую смолу и эфир сорбита.

Выбранный диапазон рН, при котором в лекарственной форме не произойдет выпадение в осадок желчной кислоты, продукта гидролиза крахмала, растворимого некрахмального полисахарида и (или) фармацевтического соединения, может представлять собой любой диапазон уровней рН, который можно достичь с использованием водной системы. Например, указанный диапазон может составлять приблизительно от рН 1 до приблизительно рН 14 или приблизительно от рН 1 до приблизительно рН 10. В ряде примеров осуществления изобретения диапазон может представлять собой любое подмножество диапазона уровней рН, которые можно достичь в водной системе, достаточных для сохранения фармацевтического состава в растворе. Например, фармацевтический продукт может находиться в растворе с момента приготовления до момента приема и всасывания в организме испытуемого в соответствии со способом приема. Следовательно, композиция может быть использована в качестве фармацевтического состава, в котором фармацевтическое соединение сохраняется в растворе без выпадения в осадок при существующих уровнях рН в ротовой полости, желудке и кишечнике. В ряде примеров осуществления изобретения желчная кислота остается растворенной при кислых условиях в качестве свободной желчной кислоты, несмотря на общую нерастворимость желчных кислот при кислых условиях.

Фармацевтическое соединение может оказывать воздействие на реакцию на другой лекарственный препарат (например, количественно или качественно). Например, количественный эффект может иметь место в том случае, когда совместный прием с желчной кислотой повышает интенсивность терапевтического воздействия фармацевтического соединения. Качественный эффект может иметь место, например, в том случае, когда совместный прием с желчной кислотой приводит к созданию различных или дополнительных групп (частей) in vivo.

В соответствии с изобретением предусматривается использование широкого диапазона фармацевтических веществ. Неограничивающие примеры включают гормоны, антагонисты гормонов, анальгетики, антипиретики, противовоспалительные лекарственные препараты, иммуноактивные лекарственные препараты, антинеопластические лекарственные средства, антибиотики, противовоспалительные средства, симпатомимитические средства, антибактериальные средства, противоопухолевые средства, анестетики. Далее, не ограничивающие примеры включают средства, оказывающие влияние непосредственно на желудочно-кишечный тракт, печень, сердечно-сосудистую систему и дыхательную систему. Кроме того, неограничивающие примеры фармацевтических соединений включают инсулин, гепарин, кальцитонин, ампицилин, октреотид, сильденафил цитрат, кальцитриол, дигидротахистерол, апоморфин, йохимбин, тразадон, ацикловир, амантадин•НСl, римантадин•НСl, цидофовир, делавирдин•мезилат, диданозин, фамцикловир, фоскарнет натрия, фторурацил, ганцикловир натрия, йодоксуридин, интерферон-α, ламивудин, невирапин, пенцикловир, рибавирин, ставудин, трифлюридин, валацикловир•НСl, зальцитабин, зидовудин, индинавир•Н₂SO₄, ритонавир, нельфинавир•СН₃SO₃Н, саквинавир•СН₃SO₃Н, d-пеницилламин, хлорокин, гидроксихлорокин, ауротиоглюкоза, золота натрия тиомалат, ауранофин левамизол, дакарбазин, изопринозин, метилинозин монофосфат, мурамил дипептид, диазоксид, гидралазин•НСl, миноксидил, дипиридамол, изоксуприн•НСl, ниацин, нилидрин•HCl, фентоламин, доксазозин-СН₃SO₃Н, празозин•НСl, теразоцин•HCl, хлонидин•НСl, нифедипин, мольсидомин, амиодарон, ацетилсалициловая кислота, верапамил, дилтиазем, низолдипин, израдипин, бепридил, изосорбид•динитрат, пентаэритритол•тетранитрат, нитроглицерин, цемитидин, фамотидин, низатидин, раницидин, лансопразол, омепразол, мизопростол, сукральфат, метоклопрамид•НСl, эритромицин, соединение висмута, алпростадил, альбутерол, пирбутерол, тербуталин•Н₂SO₄, сальметерол, аминофиллин, дифиллин, эфедрин, этил норэпинефрин, изоэтарин, изопротеренол, метапротеренол, недокромил, окстрифиллин, теофеллин, битолтерол, фенотерол, будезонид, флюнизолид, беклометазона•дипропионат, флютиказона•пропионат, кодеин, кодеина сульфат, кодеина фосфат, декстрометорфан•HBr, триамцинолона•ацетонид, монтелукаст натрия, зафирлукаст, зилеутон, кромолин натрия, ипратропиум бромид, недокромил натрия бензонат, дифенгидрамин•НСl, гидрокодон•битартарат, метадон•НСl, сульфат морфия, ацетилцистеин, гвайфенезин, смесь карбоната аммония и карбомата аммония, хлористый аммоний, антимонил-тартрат калия, глицерин, терпин•тидрат, кольфосцерил пальмитат, аторвастатин•кальций, правастанин•натрий, симвастанин, пикрориза курроа, андрографис паникулята, моринга масличная, альбизия леббек, адхадота васика, куркума длинная, дыня горькая, гимнема сильвестре, терминалия арджуна, азадирачта индика, тиноспора кордифолия, метронидазол, амфотерицин В, клотримазол, флюконозол, халопрогин, кетоконазол, гризеофулвин, итраконазол, тербинафин•НСl, эконазол•НNО₃, миконазол, нистанин, оксиконазол•НNО₃, сульконазол•НNО₃, цетиризин•2НСl, дексаметазон, гидрокортизон, преднизолон, кортизон, катечин и его производные, глицирризин, глицирризиновая кислота, бетаметазон, флюдрокортизон•ацетат, флюнизолид, флютиказон•пропионат, метилпреднизолон, соматостатин, лиспро, глюкагон, проинсулин, нерастворимые инсулины, акарбоз, хлорпропамид, глипизид, глибурид, метформин•НСl, репаглинид, толбутамид, аминокислота, колчицин, сульфинпиразон, аллопуринол, пироксикам, натрий толметин, индометацин, ибупрофен, дифлунизал, мефенамовая кислота, напроксен и триентин.

Дополнительные примеры фармацевтических составов, которые могут быть включены в композицию в соответствии с описанием изобретения, могут содержать без ограничений любое соединение, которое становится растворимым или остается растворимым при добавлении к рецептуре в соответствии с описанием изобретения, любое соединение, повышающее эффективность другого вещества (например, путем усиления желаемой реакции, снижения дозы, необходимой для достижения того же уровня эффективности, диверсификации механизма (-ов) действия или повышения абсорбции), и любое соединение, снижающее токсичность вещества (например, введенное одновременно и (или) в другое время. В соответствии с рядом примеров осуществления изобретения, в которых композиция в соответствии с настоящим описанием изобретения включает дополнительное фармацевтическое соединение, желчная кислота в растворе может выступать в качестве адъюванта, носителя или энхансера.

Например, желчная кислота может повышать терапевтический эффект или метаболизм дополнительного фармацевтического соединения.

В ряде примеров осуществления изобретения терапевтически активный продукт может включать без ограничений антикоагулянт (например, анизиндион, дикумарол, варифарин натрия, раствор цитрат дескстрозы, данапароид натрия, гепарин натрия), фибринолитический ингибитор (например, аминокапроновая кислота, транексамовая кислота), антитромбоцитарное соединение (например, тиклопедин HCl, клопидогреля бисульфат, эптифибатид, тирофибан HCL), блокатор кальциевых каналов (например, соли амлодипина, бепридил HCL, дилтиазем HCL, фелодипин, нифедипин), кортикостериод (например, бетаметазон, дексаметазон, флюдрокортизон, флюнизолид, гидрокортизон), ганглиоблокирующее средство (например, мекамиламин HCl, триметафан камсилат), гемопоэтический фактор роста (например, эритропоиэтин, гранулоцитарные колониестимулирующие факторы), гемостатическое соединение (например, микрофибриллярный коллаген, абсорбируемый желатин, тромбин), донор окиси азота (например, L-аргинин, ингибиторы синтазы окиси азота), тромболитическое средство (например, абциксимаб, алтеплазу, стрептокиназу, урокиназу), вазоактивное средство (например, диазоксид, гидралазин НСl, миноксидил), средства восточной медицины (например, дан шен, денжанхуа, дидан тан) и индивидуальные средства (например, гинго билоба, любелузол, раствор маннитола, нафтидрофурил, пентоксифиллин, пропентофиллин, пирацетам петнифиллина, простациклин, пуэрарин, санчи, теофиллин, аминофиллин, тирилазад, трифлюзал, винпоцетин).

Ряд примеров осуществления в соответствии с описанием изобретения могут найти практическое применение с рН регулируемыми веществами. Неограничивающие примеры включают HCl, фосфорную кислоту, H₂SO₄, НNО₃, СН₃СООН, лимонную кислоту, яблочную кислоту, виннокаменную кислоту, молочную кислоту, эйдетическую кислоту, фосфат и щелочи.

В ряде примеров осуществления в соответствии с описанием настоящего изобретения рецептура изменена таким образом, чтобы обеспечивалось ее введение в виде жидкости, твердого вещества, порошка или таблеток. В ряде примеров осуществления в соответствии с описанием настоящего изобретения в рецептуру входит сироп, густой сироп или паста. Неограничивающий пример сиропа представляет собой раствор мальтодекстрина, в котором концентрация мальтодекстрина составляет менее 1,0 кг/л. Неограничивающий пример густого сиропа представляет собой раствор мальтодекстрина, в котором концентрация мальтодекстрина находится в пределах от 1,0 кг/л до 1,2 кг/л включительно. Неограничивающий пример пасты представляет собой раствор мальтодекстрина, в котором концентрация мальтодекстрина составляет более 1,2 кг/л.

Композиции в соответствии с настоящим изобретением в ряде примеров осуществления изобретения могут быть введены в сочетании с иной противоинсультной терапией, включающей без ограничений симптоматическую терапию, лечение неврологических осложнений, антитромботическую терапию, тромболитическую терапию и терапию рекомбинантного тканевого активатора (rt-РА) плазминогена.

В соответствии с рядом примеров осуществления настоящего изобретения водный раствор, содержащий соединение желчной кислоты и гидрокарбоната, является прозрачным (т.е. не содержащим осадка, видимого глазом человека). Прозрачность в соответствии с некоторыми примерами осуществления изобретения может оцениваться путем визуального осмотра и (или) с помощью спектрофотометрических методов (Dasta JF et al. Am. J. Hospital Pharm. (1988) 45:2361-2366). В соответствии с примерами осуществления изобретения, в которых использованы спектрометрические методы, оптическая плотность может быть обнаружена при любой эффективной длине волны, включающей без ограничений 260 нм, 400 нм, 580 нм, 680 нм и 720 нм. В ряде примеров осуществления изобретения оптическую плотность раствора в соответствии с изобретением сравнивают только с водой или с водой, содержащей гидрокарбонат, но без соединения желчной кислоты. Относительная разница при отдельной длине волны в ряде примеров осуществления изобретения может составлять менее 0,1 единиц поглощения, в то время как в других примерах осуществления изобретения она может составлять менее 0,05 единиц поглощения. В ряде примеров осуществления настоящего изобретения разница может составлять менее 0,01 единиц поглощения или даже менее 0,005 единиц поглощения.

В некоторых примерах осуществления настоящего изобретения желчные растворы в соответствии с изобретением могут быть высушены (“высушенная s-урсодезоксихолевая кислота”(s-UDCA)). Высушенная форма может быть получена из рецептур растворов композиций желчной кислоты путем лиофилизации, выпаривания или с помощью любого иного способа дегидрации, известного в данной области техники. Раствор в соответствии с настоящим изобретением может быть частично высушен с целью получения полутвердых форм. Растворы могут быть тщательно высушены с целью образования твердого вещества, порошка и гранул. В ряде примеров осуществления настоящего изобретения высушенная форма может содержать приблизительно менее 20% первоначального содержания воды. В ряде примеров осуществления настоящего изобретения высушенная форма может содержать приблизительно менее 10% первоначального содержания воды. В ряде примеров осуществления настоящего изобретения высушенная форма может содержать приблизительно менее 5% первоначального содержания воды. В ряде примеров осуществления настоящего изобретения высушенная форма может содержать приблизительно менее 1% первоначального содержания воды. В ряде примеров осуществления настоящего изобретения высушенная форма может содержать приблизительно менее 0,2% первоначального содержания воды. В ряде примеров осуществления изобретения высушенные формы водных растворов в целом могут не содержать воды. Высушенные формы могут быть высушены с помощью процесса в псевдоожиженном слое, лоткового процесса сушки, распыления и (или) замораживания. Высушенные формы могут быть приняты непосредственно в виде твердых лекарственных форм либо могут смешиваться с водой до приема.

В ряде примеров осуществления композиции в соответствии с изобретением могут быть приготовлены по способам, описанным в заявке США №09/778,154, поданной 5 февраля 2001 г., и (или) в заявке США №10/996,945, поданной 24 ноября 2004 г., на которые здесь производится ссылка.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Получение растворимой урсодезоксихолевой кислоты

Получали прозрачный водный раствор солюбилизированной урсодезоксихолевой кислоты (s-UDCA), содержащий исходную урсодезоксихолевую кислоту и водорастворимый крахмал, имеющий низкую эквивалентность декстрозы. 6,48 г таблеток гидроокиси натрия растворили в 500 мл дистиллированной воды. Затем 60 г урсодезоксихолевой кислоты растворяли в растворе гидроокиси натрия при перемешивании при комнатной температуре. Далее, в прозрачный раствор по частям добавляли 400 г углевода (мальтодекстрина) и перемешивали его. В полученный прозрачный раствор добавляли подсластитель и консерванты (и (или) подсластитель и ароматизаторы) в количестве, приемлемом для фармацевтического состава. С помощью бифосфата натрия регулировали рН прозрачного раствора до значений в пределах 7-7,5. Добавляли дистиллированную воду до достижения полного объема в размере 1000 мл. Прозрачный раствор также можно отфильтровать с помощью устройства Stericup Filter, имеющего 0,22 мкм и GP plus мембрану.

Пример 2: Получение растворимой урсодезоксихолевой кислоты

Получали прозрачный водный раствор солюбилизированной урсодезоксихолевой кислоты (s-UDCA), содержащий исходную урсодезоксихолевую кислоту и водорастворимый крахмал, имеющий низкую эквивалентность декстрозы. 1,1 г таблеток гидроокиси натрия растворяли в 500 мл дистиллированной воды. Затем 10 г урсодезоксихолевой кислоты растворяли в растворе гидроокиси натрия при перемешивании при комнатной температуре. Далее, по частям добавляли 500 г углевода (твердого вещества кукурузной патоки) в прозрачный раствор и перемешивали его. В полученный прозрачный раствор добавляли подсластитель и консерванты (и (или) подсластитель и ароматизаторы) в количестве, приемлемом для фармацевтического состава. С помощью бифосфата натрия регулировали рН прозрачного раствора до значений в пределах 7-7,5. Добавляли дистиллированную воду до достижения полного объема в размере 1000 мл.

Данная композиция имела максимальную концентрацию (Сmax) в размере 20.4 мкг/мл, что в 7 раз превышало Сmax актигалла, производимого Novartis Pharmaceuticals, Newark, New Jersey. Данные из “Results of a Phase I Multiple-Dose Clinical Study of Ursodeoxycholic Acid" Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2004 May; 13(5):861-7. Кроме того, у данной композиции Tmax в 5,5 раз оказалось короче, а растворимость - в 2500 раз выше (50 г/л) по сравнению с актигаллом. В таблице 1 приведены сравнительные данные композиции по указанному примеру 2 с другими композициями.

Таблица 1. Фармакокинетические параметры различных лекарственных форм урсодезоксихолевой кислоты у человека после перорального приема   Состав Основа AUC Сmax Tmax Simoni и Таблетка, покрытая 500 мг 15,3 мкг     др. энтеросолюбильной оболочкой UDCA 8 ч мл^-1     Parquet и Капсула 500 мг   4,43   др.   UDCA   мкг/мл   Panini и Комплекс 2-гидроксипропил-β- 426 мг 8,1 мкг 6,1 63 др. циклодекстрин UDCA 4 ч мл^-1 мкг/мл мин Серийно выпускаемые таблетки 450 мг 3,8 мкг 2,9 83   UDCA 4 ч мл^-1 мкг/мл мин Пример 2 Жидкий состав с углеводом 500 мг 23 мкг 20,4 15     UDCA 4 ч мл^-1 мкг/мл мин 650 мг 25,2 мкг 15 60 UDCA 4 ч мл^-1 мкг/мл мин

Пример 3: Получение растворимой урсодезоксихолевой кислоты

Получали прозрачный водный раствор солюбилизированной урсодезоксихолевой кислоты (s-UDCA), содержащий исходную урсодезоксихолевую кислоту и водорастворимый крахмал, имеющий низкую эквивалентность декстрозы. 2,27 г таблеток гидроокиси натрия растворили в 100 мл дистиллированной воды. Затем 25 г урсодезоксихолевой кислоты растворили в растворе гидроокиси натрия при перемешивании при комнатной температуре. Далее, по частям добавляли 745 г углевода (мальтодекстрина) в 400 мл дистиллированной воды и перемешивали до растворения. В полученный прозрачный раствор углевода добавляли натриевую соль раствора урсодезоксихолевой кислоты и перемешивали. В полученный прозрачный раствор добавляли подсластитель и консерванты (и (или) подсластитель и ароматизаторы) в количестве, приемлемом для фармацевтического состава. С помощью бифосфата натрия регулировали рН прозрачного раствора до значений в пределах 6,5-7,5. Добавляли дистиллированную воду до достижения полного объема в размере 1000 мл.

Полученный раствор высушивали в роторном испарителе при 90-95°С в вакууме (1,3×10^-1 Ра) и получали сухой порошок солюбилизированной урсодезоксихолевой кислоты.

Пример 4: Экспериментальные животные и введение растворимой урсодезоксихолевой кислоты

Шестьдесят три крысы-самца Sprague-Dawley весом ~250 г (Геномика) подвергали анестезии с помощью кетамина (30 мг/кг)/ксилазина гидрохлорида (4 мг/кг) и проводили искусственную вентиляцию легких с помощью маски, подающей кислородно-воздушную смесь, содержащую 20% кислорода. Артериальное давление поддерживали в пределах 35-40 мм ртутного столба, и ректальную температуру контролировали и поддерживали приблизительно на уровне 37°С с помощью грелок-подушек. Крысы имели свободный доступ к воде, но им не давали пищи с вечера за день до операции.

Были вызваны мелкоочаговые инфаркты средней мозговой артерии с помощью метода внутрипросветной окклюзии перевязкой. Короче говоря, было выполнено рассечение для обнажения бифуркации левой сонной артерии. Было определено и лигировано крылонебное ответвление. Окклюзия общей сонной артерии была достигнута с помощью нейлоновой нити, имеющей покрытый силиконом наконечник. Нить вводили со стороны внешней сонной артерии в просвет внутренней сонной артерии до тех пор, пока она не блокировала начало средней мозговой артерии (Yanaka et al., 1996, J. Neurosurg. 85:125). Церебральный кровоток контролировали, и он рассматривался как окклюдированный, если кровоток сокращался на 75% по отношению к исходному. Реперфузия разрешалась спустя 90 минут путем полного удаления нити.

Крыс разделяли на 5 групп и в каждой группе была сделана внутривенно одна инъекция растворителя (n=18), 25 мг s-UDCA/кг (n=9), 100 мг UDCA/кг (n=18), 400 мг UDCA/кг (n=9) и 400 мг TUDCA/кг (n=9) непосредственно после реперфузии.

Во время периода выздоровления проводили оценку крыс на сгибание передних конечностей и контралатеральное вращение с целью подтверждения ишемии. В ходе проведения экспериментов в любой момент времени после окклюзии средней мозговой артерии не было зафиксировано случаев пароксизма. Ректальную температуру поддерживали на уровне 37±0,5°С с использованием обогревательной системы с обратной связью. После завершения действия наркоза крысам был предоставлен свободный доступ к пище и воде. Крысы содержались в вентилируемых воздухом клетках при температуре 24±0,5°С в течение всего периода проведения экспериментов. После двухнедельного периода количество таблеток было ограничено до 30 г/день с целью регулирования веса тела до 28 дней.

Пример 5: Анализ плазмы и мозга на содержание желчных кислот

Спустя 1 час после инъекции s-UDCA, TUDCA или растворителя брали образцы крови и мозга и проводили анализ на содержание желчных кислот с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Иными словами, брали цельную кровь, коагулировали и центрифугировали, плазму отделили и заморозили. После проведения соответствующей анестезии для человеческого организма (5% хлоралгидрата) и перфузии транскардиального фосфатного буфера мозг крыс удаляли, быстро замораживали и хранили при температуре -70°С. Были измерены уровни концентрации свободной урсодезоксихолевой кислоты с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (JASCO HPLC Bile Acids Analysis System). Анализ содержания желчных кислот проводили с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, например, в соответствии с патентной заявкой США №09/778,154, поданной 5 февраля 2001 г., на полное описание которой здесь производится ссылка.

Результаты приведены в таблице 2. В отличие от мозга контрольной группы животных, инъецированных растворителем, концентрация урсодезоксихолевой кислоты в мозгу животных, инъецированных урсодезоксихолевой кислотой, повышалась в соответствии с количеством инъецированной s-UDCA. Более высокие концентрации урсодезоксихолевой кислоты наблюдались в мозгу животных, инъецированных 25 мг s-UDCA по сравнению с животными, инъецированными 400 мг TUDCA. В мозгу или сыворотке контрольных животных, инъецированных растворителем, не было обнаружено свободной урсодезоксихолевой кислоты.

Таблица 2. Результаты анализа образцов мозга и крови животных из каждой группы на содержание желчных кислот, проведенного с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии s-UDCA на вес тела крысы Концентрация свободной урсодезоксихолевой кислоты в тканях мозга крысы Концентрация свободной урсодезоксихолевой кислоты в крови крысы Максимальная ретенция Максимальная ретенция (нмоль/г мозга) Время (мин) (мкммоль/л) Время (мин) Контрольная группа 0 - 0 - UDCA 26 мг/кг 8,6 14,108 71,6 14,208 UDCA 100 9,5 14,108 165,2 14,217 мг/кг         UDCA 400 103,6 14,258 738,1 14,242 мг/кг         TUDCA 400 7,3 14,000 0 14,000 мг/кг        

Пример 6: Проведение тестов на поведение

На 2-й и 7-й день после окклюзии, как описывалось ранее, был проведен тест Rotarod и модифицированный тест на расположение конечностей (MLPT) (Jeong et al,. 2003, Stroke 34:2258). Крысы, выделенные для теста на поведение, прошли предварительную дрессировку в течение 3 дней с целью ускорения эффекта обучения при проведении теста Rotarod (Chen et al., 2001, Stroke 32:1005). В процессе проведения теста Rotarod крыс помещали на вращающийся с ускорением цилиндр Rotarod (4-40 об/мин) и три раза проводили измерение времени, в течение которого животные удерживались на цилиндре Rotarod.

Данные теста Rotarod приведены на Фиг.2А в виде процентов максимальной продолжительности в сравнении со значениями внутреннего базового контроля (до ишемии). При проведении теста на 7-й день крысы, получившие только растворитель, удерживались на цилиндре в течение 36,6% базового времени, в то время как крысы, получившие 100 мг/кг s-UDCA, удерживались в течение 76,3% базового времени.

MLPT состоял из двух задач по размещению конечностей, на основании которых проводилась оценка сенсомотороной интеграции передних конечностей и задних конечностей путем проверки реакции на тактильную и проприоцептивную стимуляцию (Jeong et al.; Song et al, 2003, Stroke 34:2215), Сначала каждую крысу подвешивали на высоте 10 см над столом и наблюдали за вытягиванием передних конечностей в направлении стола и проводили оценку: нормальное вытягивание - 0 баллов; аномальная флексия - 1 балл. Затем каждую крысу располагали вдоль кромки стола и ее передние конечности располагали свободно за пределами стола свисающими через кромку и позволяли им свободно двигаться. Каждую переднюю конечность (передняя конечность - вторая задача, задняя конечность - третья задача) осторожно тянули вниз и наблюдали за тем, как она возвращалась в прежнее состояние и размещалась. Наконец, каждую крысу размещали в направлении кромки стола с целью проверки латерального расположения передних конечностей. Три задачи оценивались в баллах следующим образом: нормальное выполнение задачи - 0 баллов; выполнение с задержкой (2 сек) и (или) неполное выполнение - 1 балл; отсутствие выполнения - 2 балла; 7 баллов означают максимальный неврологический дефицит и 0 баллов означает нормальное выполнение. Результаты приведены на Фиг.2В. Животные, получившие только один растворитель, получили 3,2 балла, в то время как крысы, получившие 100 мг/кг s-UDCA, получили 1,5 балла.

Животные, лечение которых проводилось с использованием s-UDCA, выполняли задачу лучше, чем контрольные животные. Кроме того, животные в группе, в которой проводилось инъецирование 100 мг UDCA, продемонстрировали существенно лучшее выполнение задачи, чем животные в группах, в которых было проведено инъецирование 25 мг UDCA и 400 мг TUDCA. Спустя 7 дней животные в группе, в которой было проведено лечение путем инъецирования 100 мг s-UDCA, продемонстрировали более высокие результаты при проведении тестов Rotarod и MLPT, крысы в группах, получившие инъекции 25 мг s-UDCA и 400 мг TUDCA, продемонстрировали менее высокие результаты по сравнению с контрольной группой (Фиг.2). На 28-й день после реперфузии выполнение задачи при проведении теста Rotarod улучшилось на 80% по сравнению с уровнем предварительного обучения, в то время как в контрольной группе, получившей инъекции растворителя, это значение составило 40% (данные не приведены). Начальный вес тела и вес тела на протяжении 4-х недель был одинаков.

Пример 7: Объем инфаркта

После проведения тестов на поведение удаляли мозг животных и готовили серийные срезы толщиной 1 мм по всему мозгу с использованием матричного устройства для мозговых срезов. Каждый срез в последующем окрашивали по Нисслю. Прослеживали и измеряли кортикальный, стриарный и межполушарный объем в областях инфаркта и в контрповрежденных (contralesional) областях каждого среза с использованием системы анализа изображений (image-Pro Plus™, Media Cybernetics, Sliver Spring, MD). Количественный анализ степени повреждения проводили с использованием компьютеризированной системы анализа изображений. С целью проведения указанного анализа получали цифровое изображение каждого среза и определяли границы области повреждения путем создания контура участка, в котором не происходило сокращение вещества Ниссля. В случаях, при которых некроз являлся настолько тяжелым, что фактически имела место потеря ткани и, следовательно, исключалась возможность непосредственного проведения оценки границ, контур контралатеральной стороны использовали для проведения оценки объема поврежденного мозга. Общий объем инфаркта рассчитывали по методу Cavalieri.

В левом полушарии можно видеть четко определенную бледную область, рассматриваемую как инфаркт (Фиг.1А). Объемы инфаркта на 2-й день заметно снизились у животных, получивших инъекцию 100 мг s-UDCA, особенно в коре головного мозга (Фиг.1А). Средние объемы инфаркта в группах, получивших инъекцию 100 мг s-UDCA, на 2-й день (41,03±29,2 мм³) были вдвое меньше по сравнению с объемом инфаркта у животных, получивших инъекции растворителя (90,59±33,03 мм³, Р<0,05) (Фиг.1В). Аналогичные результаты были получены на 7-й день после реперфузии: 86,64±18,78 мм³ в контрольной группе, 39,07±26,36 мм³ - в группе, получившей инъекцию 25 мг s-UDCA, 26,87±26,63 мм³ - в группе, получившей инъекцию 100 мг UDCA (Фиг.1 В). Несмотря на то, что объем инфаркта у животных в группе, получившей инъекцию 400 мг s-UDCA, был меньше, чем у животных в контрольной группе, разница в данном конкретном эксперименте может быть не была статистически существенной.

Пример 8: Окрашивание по протоколу TUNEL

На 2-й и 7-й день после реперфузии был проведен количественный подсчет апоптических клеток путем анализа по методу TUNEL. Анализ по методу TUNEL был проведен с использованием набора для обнаружения фрагментации ДНК (cat. no. QIA33; Oncogene, Boston, MA, USA). После иммерсии в 100 мкл 3% Н₂O₂ в течение 5 минут срезы инкубировали в реакционной смеси для мечения TdT (поставляется вместе с набором) в увлажнительной камере в течение 90 минут при 37°С, а затем инкубировали в стопорном буфере при 37°С в течение 5 минут. Срезы промывали физиологическим раствором с фосфатным буфером до проведения инкубирования в блокирующем буфере (поставляемом вместе с набором) в течение 30 минут при комнатной температуре, окрашивали раствором диаминобензидин-Н₂O₂ и проводили контрастное окрашивание метиловым зеленым. В соответствии с морфологическими критериями TUNEL-позитивные ядра с конденсированием хроматина и фрагментированные ядра рассматривались как вероятные апоптотические клетки, а TUNEL-позитивные клетки с диффузионным мечением ядер светло-коричневым цветом и циоплазм рассматривались как вероятные некротические клетки.

В процессе окрашивания по протоколу TUNEL были проведены количественные исследования. Для анализа были выбраны латеральный каудопутамен и верхняя лобно-теменная кора головного мозга ввиду того, что ишемическое повреждение обычно оказывает негативное влияние на две указанные области, и они представляют различные степени ослабления функции кортикального слоя головного мозга. Вероятно, что латеральный каудопутамен содержит ишемическое ядро, а лобно-теменная кора головного мозга - граничную зону или область полутени в данной модели окклюзии средней мозговой артерии. Пять непересекающихся микроскопических полей на участок на срез и два среза на мозг были проанализированы исследователем по «слепому» методу. Количество апоптотических клеток на каждом участке подсчитывали в поле зрения микроскопа под большим увеличением (×400), и это количество выражали в виде количество/мм². Микрофотоснимки меченой ткани показаны на Фиг.3А, а диаграмма результатов приведена на Фиг.3В.

Как показано на Фиг.3А, TUNEL-позитивные апоптотические клетки были обнаружены в латеральном каудопутамене и лобно-теменной коре головного мозга у животных всех групп спустя 7 дней после реперфузии (Фиг.3А). Данные результаты указывают на то, что инъекции 25 мг и 100 мг s-UDCA значительно сократили количество TUNEL-позитивных клеток в полушарии, ипсилатеральном по отношению к окклюзии средней мозговой артерии.

Количественный анализ продемонстрировал приблизительно 50% сокращение апоптотических клеток в группе животных, получивших инъекцию 25 мг s-UDCA. Кроме того, при введении более высокой дозы в количестве 100 мг s-UDCA сокращение апоптотических клеток достигло приблизительно 70%. В частности, было обнаружено, что крысы контрольной группы, получавшие инъекцию растворителя, имели 67,5 TUNEL-позитивных клеток пиков на поле (Фиг.3В), и в противоположность этому было обнаружено, что крысы, получившие 100 мг/кг s-UDCA, имели 16,7 пиков на поле (HFP). Апоптотические клетки статистически исследовали с помощью критерия Стьюдента.

Пример 9: Активность каспазы

На 7-й день после реперфузии цельный мозг животных гомогенезировали в изолирующем буфере и проводили его оценку DEVD-специфической активности каспазы, затем его немедленно помещали в лизирующий буфер (5 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 20 мМ ЭДТК и 0,5% Triton-X 100) при 4°С на 15 минут. Затем лизаты центрифугировали при 1000 g в течение 10 минут при температуре 4°С, и супернатанты центрифугировали при 17000 g в течение 20 минут при 4°С. Концентрации протеина определяли с использованием метода Bradford (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Ac-DEVD- AMC [N-ацетил-Asp-Glu-Val-Asp-AMP (7-амино-4-метилкумарин)] (Pharmingen, San Diego, CA, USA) была использована для проведения анализов активности каспазы-3, и в каждую лунку 96-луночной планшеты добавляли 200 мкг протеина, 200 мкл реакционного буфера (20 мМ HEPES, pH 7,5, 10% глицерин, 4 мМ DTT) и 5 мкл (1 мкг/мкл) восстановленного Ас-DEVD-AMC. Реакционную смесь инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Количество выделившейся AMC измеряли с использованием флюоресцентного спектрофотометра (LS-50B, Perkin-Elmer, Wellesley, MA, USA) при 380 нм возбуждении и 460 нм эмиссии. Результаты на Фиг.3С показывают, что s-UDCA также препятствовала активации каспазы-3, которую измеряли с использованием колориметрических субстратов DEVD-pNA. В группах животных, получивших инъекцию 25 мг и 100 мг s-UDCA, наблюдалось снижение активности каспазы-3 на 7-й день после реперфузии. Звездочка (“*”) означает Р<0,05, что составляет существенную разницу между контрольной и постишемической группами в соответствии с дисперсионным анализом (ANOVA) с последующим проведением одностороннего теста наименьшей значимой разницы Фишера. Было обнаружено, что активность капказы-3 существенно снизилась спустя 7 дней после реперфузии в группе, получившей инъекцию 100 мг s-UDCA (1,72±0,32, n=3), по сравнению с контрольной группой (0,56±0,51, n=3). Активность каспазы также была снижена у животных, инъецированных 25 мг s-UDCA или 400 мг s-UDCA, хотя снижение при инъецировании 400 мг s-UDCA может быть не было статистически значимым в указанном одном примере.

Пример 10: Анализ Western Blot

С целью дальнейшей оценки любого нейрозащитного действия была проведена оценка экспрессии eNOS с помощью анализа Western Blot на 7-й день после реперфузии. Результаты приведены на Фиг.4.

Не ограничиваясь каким-либо механизмом действия, вышеприведенные результаты могут указывать на то, что s-UDCA позволяет снизить объем инфаркта и улучшить функциональное восстановление после ишемического инсульта путем ингибирования апоптоза и повышения экспрессии eNOS. В ряде примеров осуществления изобретения доза в размере 100 мг UDCA/кг может быть более эффективной, в то время как доза в размере 400 мг может быть связана с более высоким процентом смертности. В ряде конкретных иллюстративных примеров осуществления изобретения повышенная вязкость раствора, обусловленная мальтодекстрином, может быть связана с повышенной смертностью. В соответствии с рядом примеров осуществления изобретения s-UDCA может коррелироваться с концентрацией урсодезоксихолевой кислоты в мозгу и крови. Тем не менее, тауроурсодезоксихолевая кислота не была обнаружена в мозгу, а также в крови после введения урсодезоксихолевой кислоты и тауроурсодезоксихолевой кислоты, несмотря на незначительное увеличение концентрация урсодезоксихолевой кислоты в мозгу после инъекции тауроурсодезоксихолевой кислоты.

Пример 11: Физиологические параметры

Все животные контрольной группы, группы, получившей инъекцию 25 мг, и группы, получившей инъекцию 100 мг s-UDCA, жили в течение 1 недели после хирургического вмешательства. Но в группе животных, получивших инъекцию 400 мг s-UDCA, наблюдались частая одышка и смерть (75% смертность), вероятно, обусловленные закупоркой сосудов в результате внутривенной инъекции вязкого раствора s-UDCA, что было подтверждено при аутопсии. Среди выживших животных во всех экспериментальных группах не наблюдалось существенного различия физиологических параметров, включающих среднее артериальное кровяное давление, газы крови, глюкозу сыворотки и температуру тела, до, во время или после инфаркта.

Пример 11: Статистический анализ

Данные представлены в виде средних значений ±S.D. (стандартное отклонение). Статистические анализы физиологических переменных были выполнены с использованием однофакторного дисперсионного анализа. Тест Стьюдента использовали для определения значимости любой разницы объема инфаркта и количества апоптотических клеток между группами. Уровни активности каспазы-3 исследовали путем проведения дисперсионного анализа с последующим проведением одностороннего теста наименьшей значимой разницы Фишера. Значение Р<0,05 рассматривалось как значимое.

Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии, и может быть использовано для снижения объема инфаркта ишемического инсульта, улучшения функционального восстановления, повышения экспрессии eNOS, ингибирования апоптоза и повышения экспрессии eNOS, лечения симптомов ишемического инсульта или доставки продукта желчной кислоты к мозгу у пациента, перенесшего ишемический инсульт или подверженного риску ишемического инсульта. Для этого вводят композицию, включающую урсодезоксихолевую кислоту, мальтодекстрин и воду. Причем в указанной композиции урсодезоксихолевая кислота и мальтодекстрин остаются в растворе при всех значениях pH раствора в выбранном диапазоне от рН 1 до рН 10. Изобретение позволяет эффективно влиять на указанные состояния за счет улучшенной биодоступности урсодезоксихолевой кислоты к головному мозгу пациента. 7 з.п. ф-лы, 2 табл., 4 ил.

1. Способ применения композиции для
- снижения объема инфаркта ишемического инсульта,
- улучшения функционального восстановления,
- повышения экспрессии eNOS,
- ингибирования апоптоза и повышения экспрессии eNOS,
- лечения, по меньшей мере, одного симптома ишемического инсульта или
- доставки продукта желчной кислоты к мозгу у пациента, перенесшего ишемический инсульт или подверженного риску ишемического инсульта, при этом способ включает введение пациенту указанной композиции, включающей
(a) урсодезоксихолевую кислоту,
(b) мальтодекстрин; и
(c) воду,
в котором урсодезоксихолевая кислота и мальтодекстрин остаются в растворе при всех значениях рН раствора в выбранном диапазоне от рН 1 до рН 10.

2. Способ по п.1, в котором композиция дополнительно содержит, по меньшей мере, один фармацевтический продукт в фармацевтически приемлемом количестве.

3. Способ по п.2, в котором фармацевтический продукт выбран из группы, состоящей из антикоагулянта, фибринолитического ингибитора, антитромбоцитарного соединения, блокатора кальциевых каналов, кортикостериода, ганглиоблокирующего средства, гемопоэтического фактора роста, гемостатического соединения, донора окиси азота, тромболитического средства, вазоактивного средства.

4. Способ по п.2, в котором фармацевтический продукт выбран из группы, состоящей из анизиндиона, дикумарола, варифарина натрия, раствора цитрата дескстрозы, данапароида натрия, гепарина натрия, аминокапроновой кислоты, транексамовой кислоты, тиклопедина HCl, клопидогреля бисульфата, эптифибатида, тирофибана HCL, солей амлодипина, бепридила HCL, дилтиазема HCl, фелодипина, нифедипина, бетаметазона, дексаметазона, флюдрокортизона, флюнизолида, гидрокортизона, мекамиламина HCl, триметафана камсилата, эритропоиэтина, гранулоцитарных колониестимулирующих факторов, микрофибриллярного коллагена, абсорбируемого желатина, тромбина, L-аргинина, ингибиторов синтазы окиси азота, абциксимаба, алтеплазы, стрептокиназы, урокиназы, диазоксида, гидралазина НС1, миноксидила, dan shen, degzhanhua, didang tang, гинго билобы, любелузола, раствора маннитола, нафтидрофурила, пентоксифиллина, пропентофиллина, пирацетам петнифиллина, простациклина, пуэрарина, sanchi, теофиллина, аминофиллина, тирилазада, трифлюзала и винпоцетина.

5. Способ по любому из пп.1-4, в котором композиция является прозрачным раствором.

6. Способ по любому из пп.1-5, в котором композиция дополнительно содержит производное урсодезоксихолевой кислоты при группе гидроксильной и карбоновой кислот на стероидном ядре.

7. Способ по п.1, в котором композиция является высушенным солюбилизированным составом урсодезоксихолевой кислоты.

8. Способ по любому из пп.1-7, в котором мальтодектрин не содержит циклодекстрина.