Способы и композиции на основе желчных кислот и их солей для уменьшения количества жира Российский патент 2018 года по МПК A61K31/575 A61K45/06 A61K8/63 A61K9/08 A61Q19/06 

Описание патента на изобретение RU2662356C1

ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Липосакция, также известная как липопластика, липоструктурная липэктомия, липэктомия или просто липо, является косметической хирургической операцией, при которой удаляют жир из многих различных участков на теле человека. Пораженные площади могут варьировать от живота, бедер и ягодиц до шеи, тыльной стороны рук и других мест.

Несколько факторов ограничивают количество жира, которое можно безопасно удалить за один сеанс. Существуют негативные аспекты удаления слишком большого количества жира. Непривычные уплотнения и/или следы на коже можно увидеть у пациентов, к которым применили "излишнее отсасывание жира". Чем больше жира удалено, тем выше хирургический риск.

Инъекционное расщепление жира представляет собой косметическую процедуру, при которой пациентам инъецируют смесь лекарственных средств с целью разрушения жировых клеток. Данная практика с использованием лекарственных средств, в целом основанная на фосфатидилхолине (РРС) и дезоксихолате (DCA), развилась из первоначального внутривенного применения этих составов лекарственных средств для лечения заболеваний крови.

РРС относится к классу фосфолипидов, которые содержат холин в виде концевой группы. Он является одним из основных компонентов биологических мембран, и его можно легко получить из различных доступных источников, таких как яичный желток или соевые бобы, из которого(которых) его выделяют механическим или химическим путем с использованием гексана. РРС предотвращает накопление жировой ткани, и его используют для лечения печеночной недостаточности, вызванной жировым перерождением печени, ишемии миокарда, заболеваний сосудов головного мозга и слабоумия. Он был также недавно представлен для расщепления жира при лечении ожирения в Соединенных Штатах, Европе и остальных странах мира.

DCA представляет собой одну из солей вторичных желчных кислот, которые представляют собой продукты обмена веществ кишечных бактерий. DCA используют с момента его открытия в различных областях медицины человека и открыто используют при инъекциях по расщеплению жира, смешивая с РРС. DCA используют для улучшения растворимости РРС в воде и в последнее время лекарственных препаратов, таких как амфотерицин В, Taxol™ и диазепам. Высокоочищенный РРС может быть объединен с DCA, противомикробным средством, бензиловым спиртом и водой с образованием стабильного, смешанного мицеллярного препарата, который можно быстро стерилизовать и использовать для внутривенного введения.

В 1966 году исследователи отметили, что внутривенное введение РРС-содержащих растворов может устранить жировую эмболию. Позже состав лекарственного средства под названием Lipostabil®, содержащий 5% РРС и 4,75% DCA, был одобрен в Германии и применялся в лечении жировой эмболии, дислипидемии и цирроза печени, обусловленного алкоголизмом.

Среди детергентов соли желчных кислот являются особенно мощными солюбилизаторами липидных двухслойных мембран. Все биологические мембраны клеток состоят из той же структуры липидного бислоя, и поэтому они подвержены солюбилизации с помощью детергентов. Солюбилизация мембран клеток с помощью детергента включает в себя распределение детергента между липидными бислоями, дестабилизацию бислоя, дезинтеграцию и последующее формирование смешанных мицелл (состоящих из детергента и липида клеточной мембраны). Соли желчных кислот и другие детергенты уменьшают поверхностное натяжение на границе несмешиваемых материалов и позволяют разбивать крупные агрегаты на меньшие и меньшие частицы. В ткани эти средства растворяют мембраны клеток и вызывают лизис клеток. Воспалительная реакция генерируется лизисом клеток, в результате чего тело удаляет солюбилизированный детергентом материал.

Недавно Kythera Biopharmaceuticals, частная компания, расположенная в США, разработала инъекцию по расщеплению жира с применением версии РРС без DCA. На основании роли РРС в качестве эмульгатора в DCA и его применения в лечении гиперлипидемии РРС был предложен в качестве активного ингредиента при инъекции по расщеплению жира. Детергенты, такие как DCA, в этих композициях из предшествующего уровня техники были добавлены исключительно для дисперсии или растворения предполагаемого активного ингредиента, РРС. Однако было показано, что DCA был на самом деле активным средством для эмульгации локализованного жира.

Поскольку DCA является одним из сильных детергентов в семействе солей желчных кислот, лечение с помощью РРС и DCA или отдельно DCA может вызывать нежелательные побочные эффекты. Введение DCA вызывает разрушение окружающих тканей в местах инъекции. Использование DC А для удаления туловищного жира также связано со значительными побочными эффектами, включая боль, жжение, онемение, гематому, отек, опухание, пигментацию и отвердение. Кроме того, предыдущие исследователи предполагают повышение риска рака молочной железы или рака толстой кишки после воздействия DCA.

Наряду с определенным успехом предыдущих методик и композиций, имели место некоторые ограничения. Таким образом, было бы желательно иметь способ уменьшения локализованных жировых накоплений, который не требует хирургического вмешательства или продолжительного времени восстановления и имеет меньше неблагоприятных побочных эффектов, чем у доступных в настоящее время методов. Настоящее изобретение удовлетворяет эту потребность.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предусматривает состав для нехирургического удаления локализованного жирового отложения у субъекта. Согласно одному варианту осуществления изобретения состав содержит концентрацию, при которой лизируется жир, одного или нескольких из холата и хенодезоксихолата в фармацевтически приемлемом составе со значением рН менее 9. Согласно одному варианту осуществления состав имеет уровень рН менее 8. Согласно другому варианту осуществления состав имеет уровень рН менее 7,5.

Согласно одному варианту осуществления изобретения состав содержит концентрацию, при которой лизируется жир, одного или нескольких из холата и хенодезоксихолата, при концентрации от приблизительно 0,5% до приблизительно 4,0%. Согласно другому варианту осуществления концентрация составляет от приблизительно 0,5% до приблизительно 2,0%.

Согласно одному варианту осуществления состав дополнительно содержит по меньшей мере один дополнительный активный ингредиент, выбранный из группы, состоящей из противовоспалительного средства, аналгетика, диспергирующего средства и вещества, способствующего проникновению.

Согласно одному варианту осуществления состав дополнительно содержит терапевтическое средство, выбранное из группы, состоящей из противомикробного средства, антитромботического средства, антикоагулянта, подавителя образования пены, противовоспалительного средства, анестетика, аналгетика, стероида, транквилизатора, антидиспергирующего средства и миорелаксанта.

Согласно одному варианту осуществления состав представлен в форме инъекционного состава. Согласно другому варианту осуществления состав представлен в виде состава для инъекции по расщеплению жира.

Настоящее изобретение предусматривает способ нехирургического удаления локализованных жировых отложений у субъекта, имеющего локализованные жировые накопления. Согласно одному варианту осуществления изобретения способ включает введение состава, содержащего концентрацию, при которой лизируется жир, одного или нескольких из холата и хенодезоксихолата в фармацевтически приемлемом составе со значением рН менее 9.

Согласно одному варианту осуществления стадия введения предусматривает подкожную инъекцию.

Согласно одному варианту осуществления локализованное жировое накопление выбрано из группы, состоящей из грыжи жировой клетчатки нижнего века, липом, липодистрофии и жировых отложений, связанных с целлюлитом.

Согласно одному варианту осуществления жировое отложение локализовано под глазом, под подбородком, под рукой, ягодицей, голенью, спиной, Зедром, лодыжкой или животом субъекта.

Настоящее изобретение также предусматривает набор, содержащий (а) первый контейнер, содержащий состав для нехирургического удаления локализованного жирового отложения у субъекта, который содержит концентрацию, при которой лизируется жир, одного или нескольких из холата и хенодезоксихолата в фармацевтически приемлемом составе со значением рН менее 9; и (b) письменные инструкции по применению состава для снижения жирового отложения у субъекта без применения хирургического вмешательства.

Согласно одному варианту осуществления первый контейнер

дополнительно содержит терапевтическое средство, выбранное из группы, состоящей из противомикробного средства, антитромботического средства, антикоагулянта, подавителя образования пены, противовоспалительного средства, анестетика, аналгетика, стероида, транквилизатора, антидиспергирующего средства и миорелаксанта.

Согласно одному варианту осуществления дополнительно содержится второй контейнер, при этом второй контейнер содержит второе терапевтическое средство, выбранное из группы, состоящей из противомикробного средства, антитромботического средства, антикоагулянта, подавителя образования пены, противовоспалительного средства, анестетика, аналгетика, стероида, транквилизатора, антидиспергирующего средства и миорелаксанта.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Следующее подробное описание предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения будет лучше понятно при прочтении совместно с прилагаемыми графическими материалами. С целью иллюстрации настоящего изобретения, на графических материалах показаны варианты осуществления, которые в настоящее время являются предпочтительными. Однако следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается точными условиями и средствами вариантов осуществления, показанных на графических материалах.

На фигуре 1, включающей фигуры 1А-1С, представлен ряд изображений, на которых показано дифференциацию преадипоцитов 3T3-L1. Преадипоциты 3T3-L1 (фигура 1А) обрабатывали средой для дифференциации (среда MDI) и дифференцированные адипоциты (фигура 1 В) промывали и фиксировали. После фильтрации с помощью 0,2% Тритона Х-100 клетки окрашивали масляным красным О (фигура 1С) и фотографировали при увеличении 200Х.

На фигуре 2, включающей фигуры 2А-2С, представлен ряд изображений, на которых показаны эффекты лизиса клеток детергентами в адипоцитах 3T3-L1. Дифференцированные адипоциты 3T3-L1 подвергали воздействию дезоксихолатом (DCA), хенодезоксихолатом (CDCA), тауроуросодезоксихолатом (TUDCA) и холатом (СА) (0~0,1%) (фигура 2 А) и TUDCA и СА (0~2%) (фигура 2В), и урсодезоксихолатом (UDCA), гиодезоксихолатом (HDCA) и СА (0~1%) (фигура 2С) в течение 1 часа и жизнеспособность клеток измеряли с помощью анализа с 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромидом (МТТ). Все детергенты кроме TUDCA показывали дозозависимый эффект лизиса клеток. Эксперимент проводили в трех повторностях для каждой обработки. Результаты выражены в общей процентной доле жизнеспособных клеток по сравнению с необработанным контролем.

На фигуре 3, включающей фигуры 3А и 3В, представлен ряд диаграмм, на которых показано измерение лизиса жировой ткани после обработки с помощью DCA, CDCA, HDCA и СА. 95~100 мг жировых тканей вырезали у мышей с ожирением, вызванным рационом, и их подвергали воздействию различных концентраций DCA, CDCA и СА (фигура 3А), а также HDCA (фигура 3В). Жизнеспособность жировых тканей измеряли с помощью анализа МТТ и относительную поглощающую способность (OD570) измеряли с помощью спектрофотометра. Повышение концентрации детергентов вызывало более выраженный лизис жировой ткани. Эксперимент проводили в пяти повторностях для каждой обработки.

На фигуре 4 представлены графики, на которых показано среднее увеличение веса тела мышей, которых кормили рационом с высоким содержанием жиров. Вес тела отслеживали каждые две недели.

На фигуре 5, включающей фигуры 5А и 5В, представлен ряд диаграмм, на которых показан (фигура 5А) вес тела и (фигура 5В) вес паховых скоплений жировой ткани у мышей с ожирением, которым инъецировали 1% DCA, CDCA, СА и фосфатный буферный раствор (PBS). Растворы солей желчных кислот (DCA, CDCA и СА) инъецировали в паховые скопления жировой ткани мышей с правой стороны. Паховые скопления жировой ткани мышей с левой стороны получали такой же объемом PBS в качестве контроля. Инъекции повторяли еще 4 раза в течение 2 недель. Мышей умерщвляли через 4 дня после последней инъекции и иссекали паховые скопления жировой ткани и измеряли их вес.

Фигура 6 представляет собой изображение, описывающие гистологические изменения, наблюдаемые в скоплениях жировой ткани мышей, которым вводили соли желчных кислот. После инъекций солей желчных кислот и PBS, иссекали жировые ткани в участке инъекции. Иссеченные ткани фиксировали параформальдегидом, заключали в парафиновые блоки, разделяли по предметным стеклам. Наблюдали повреждение тканей и некроз при окрашивании Н & Е.

На фигуре 7 представлена процедура измерения площади некроза. Изображения скоплений жировой ткани, окрашенной 2,3,5-трифенилтетразолия хлоридом (ТТС), получали через 24 часа после инъекции. Нормальная ткань окрашивалась в красный цвет, а площадь некроза окрашивалась в белый цвет, и количественную оценку осуществляли с помощью системы анализа изображений. Площади некроза (белая, неокрашенная область) измеряли с помощью системы анализа изображений (ImageJ; National Institutes of Health, Бетесда, Мериленд, США).

На фигуре 8 представлена диаграмма, на которой показано количественное определение площади некроза in vivo. Скопления жировой ткани, в которые инъецировали различные концентрации солей желчных кислот (DCA, CDCA и СА) и PBS, иссекали и площади некроза определяли с помощью ТТС-окрашивания (n=8 в каждой группе). Повышение концентрации детергентов вызывало более выраженный лизис жировой ткани.

На фигуре 9 представлены изображения ТТС-окрашенного с помощью скопления жировой ткани после обработки различными (DCA, СА, CDCA) солями желчных кислот и носителем (PBS).

На фигуре 10, включающей фигуры 10А и 10В, представлен ряд диаграмм, изображающих жизнеспособность ткани по сравнению с нормальным PBS (фигура 10A) и относительную поглощающую способность (фигура 10В) после анализа МТТ. Паховые скопления жировой ткани мышей подвергали воздействию различными концентрациями солей (0~200 ммоль хлорида натрия) в фосфатном буфере, который содержал CA, DCA и CDCA. 95~100 мг жировой ткани инкубировали с DCA, CDCA и СА при концентрации ЕС50 (концентрации, которые показывают снижение на 50% жизнеспособности ткани в нормальном PBS) в различных концентрациях солей. Эксперимент проводили в пяти повторностях для каждой обработки.

На фигуре 11, включающей фигуры 11A-11D, представлен ряд изображений, на которых показана жизнеспособность (фигуры 11А, 11С) и относительная поглощающая способность (фигуры 11В, 11D) пахового скопления жировой ткани мышей, которых подвергали воздействию DCA, CDCA, СА, HDCA и PBS при различных рН (рН 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0). 95~100 мг жировой ткани инкубировали с DCA, CDCA, HDCA и СА при концентрации ЕС50 в различных условиях рН. Жизнеспособность жировых тканей измеряли с помощью анализа МТТ и поглощающую способность (OD570) измеряли с помощью спектрофотометра. Эксперимент проводили в пяти повторностях для каждой обработки.

На фигуре 12, включающей фигуры 12А-12С, представлен ряд графиков, на которых показана относительная площадь некроза. Скопления жировой ткани, в которые инъецировали различные концентрации DCA, CDCA и СА (фигура 12А), UDCA (фигура 12В), HDCA (фигура 12С), иссекали и площади некроза определяли с помощью ТТС-окрашивания (n=10 в каждой группе). Площади некроза (белая, неокрашенная область) измеряли с помощью системы анализа изображений. Инъекция более высокой концентрации детергентов вызывала более выраженный лизис жировой ткани.

На фигуре 13 представлен ряд изображений, на которых показаны гистологические изменения, которые наблюдали в скоплениях жировой ткани мышей после введения солей желчных кислот. Жировые ткани иссекали и фиксировали параформальдегидом, заключали в парафиновые блоки и разделяли по предметным стеклам после инъекции 1,5% СА, 1,5% HDCA и 1,5% раствора UDCA. Инфильтрацию полиморфно-ядерных (PMN) клеток в скоплении жировой ткани наблюдали в обработанных HDCA или UDCA тканях при окрашивании Н & Е.

На фигуре 14, включающей фигуры 14А-14С, представлен ряд диаграмм, на которых показаны эффекты лизиса клеток различными солями желчных кислот в адипоцитах 3T3-L1. Дифференцированные адипоциты 3T3-L1 подвергали воздействию таурохолатом (ТСА), гликохолатом (GCA), СА, тауродезоксихолатом (TDCA), гликодезоксихолатом (GDCA), DCA, таурохенодезоксихолатом (TCDCA) и CDCA (фигуры 14А-14С) в течение 1 часа и жизнеспособность клеток измеряли с помощью анализа МТТ. Все детергенты показывали дозозависимый эффект лизиса клеток. Соединенный с таурином глицин не влиял на активность лизиса клеток СА, DCA и CDCA. Эксперимент проводили в трех повторностях для каждой обработки. Результаты выражены в общей процентной доле жизнеспособных клеток по сравнению с необработанным контролем.

На фигуре 15, включающей фигуры 16А и 16В, представлен ряд изображений, на которых показана жизнеспособность ткани пахового скопления жировой ткани мышей, которую подвергали воздействию при различных условиях рН (рН 6,0, 6,5, 7,0, 8,0, 9,0) растворов СА, GCA, ТСА и носителя (PBS). 95~100 мг жировой ткани инкубировали с 0,1% GCA, ТСА и СА при различных условиях рН. Жизнеспособность жировой ткани отслеживали как поглощающую способность (фигура 16А) и относительную поглощающую способность (фигура 16В) с помощью анализа МТТ. Поглощающая способность (фигура 16А) и относительная поглощающая способность (фигура 16В). Эксперимент проводили в пяти повторностях для каждой обработки.

На фигуре 16 представлен ряд изображений, на которых показано гистологическое исследование хвостов мышей через 14 дней после инъекции DCA, СА и PBS. Окрашивание Н&Е показало некроз подкожного жира в обработанном хвосте. Также наблюдали тканевую структуру мышц и слоя кожи в обработанных хвостах.

На фигуре 17, включающей фигуры 17А-17Е, представлен ряд Изображений, на которых показаны внешний вид крысиных лап (фигура 17А, 17С) и толщина лап (фигуры 17В, 17D, Е) после инъекций в задние лапы 1% DCA, 1,5% СА, 0,8% CDCA, 1,5% UDCA, 1,5% HDCA и PBS.

На фигуре 18, включающей фигуры 18А и 18В, представлен ряд изображений, на которых показаны внешний вид мышиной кожи (фигура 18А) и тяжесть поражений кожи (фигура 18В) после подкожных инъекций различных концентраций (0,5-1,5%; в растворе с рН 7,4) DCA, СА и PBS.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии эффекта лизиса жира холатом in vivo, которое не является предсказуемым, исходя из показателей активности холата, наблюдаемых in vitro и ex vivo. Таким образом, хотя холат проявлял относительно низкую активность лизиса по сравнению с дезоксихолатом и хенодезоксихолатом in vitro, холат проявлял превосходные результаты in vivo. Например, обработка холатом in vivo вызвала значительное снижение побочных эффектов в коже по сравнению с обработкой дезоксихолатом. Данный неожиданный эффект лизиса жира холатом, при котором уменьшались побочные эффекты in vivo, подкрепляет применение холата в качестве активного компонента при инъекции по расщеплению жира, в частности в концентрации, которую не предполагали из результатов in vitro и ex vivo.

Настоящее изобретение направлено на решение проблемы локализованных жировых накоплений у животных путем обеспечения нехирургического способа уменьшения жировых отложений. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение предусматривает введение эффективного количества концентрации, при которой лизируется жир, одного или нескольких из холата и хенодезоксихолата в фармацевтически приемлемом составе.

Настоящее изобретение относится к применению желчной кислоты или ее соли для уменьшения количества жира в организме животного, предпочтительно млекопитающего, более предпочтительно человека. Согласно одному варианту осуществления желчная кислота или ее соль представляют собой один или несколько из холата и хенодезоксихолата.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к применению одного или нескольких из холата и хенодезоксихолата для уменьшения подкожных жировых накоплений у млекопитающих путем введения фармацевтически приемлемого состава локально в целевой участок. Согласно одному варианту осуществления состав имеет форму для инъекции по расщеплению жира.

Настоящее изобретение относится к способу уменьшения жирового отложения у млекопитающих, включающему контакт жирового отложения с составом, содержащим один или несколько из холата и хенодезоксихолата.

Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу обработки целлюлита и излишних жировых отложений с помощью одного или нескольких из холата и хенодезоксихолата для того, чтобы лизировать жировые клетки, связанные с целлюлитом и излишними жировыми отложениями.

Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу удаления жира путем контроля уровня рН состава для улучшения активности одного или нескольких из холата и хенодезоксихолата. Согласно одному варианту осуществления состав, который содержит один или несколько из холата и хенодезоксихолата, можно составить для получения подходящего значения рН менее приблизительно 9.

Определения

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, которое обычно понимается специалистом в области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Хотя при практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения можно применять любые способы и материалы, сходные с описанными в данном документе или эквивалентные им, в данном документе описаны предпочтительные способы и материалы.

Используемый в данном документе, каждый из следующих терминов имеет значение, связанное с ним в этом разделе.

Форма единственного числа применяется в данном документе для обозначения одного или нескольких (т.е. по меньшей мере одного) грамматического объекта. В качестве примера, элемент" означает один элемент или несколько элементов.

"Приблизительно", как используется в данном документе, при ссылке на измеряемую величину, такую как количество, продолжительность времени и тому подобное, предназначено для охвата вариантов ±20%, ±10%, ±5%, ±1% или ±0,1% от указанного значения, так как такие вариации являются подходящими для осуществления описанных способов.

Заболевание или расстройство "облегчены", если тяжесть симптома заболевания или расстройства, частота, с которой такой симптом, который испытывает пациент, или и то, и другое, снижаются.

Термин "желчные кислоты", используемый в данном документе, включает стероидные кислоты (и/или их карбоксилатный анион) и их соли, найденные в желчи животного (например, человека), в том числе, в качестве неограничивающего примера, холевую кислоту, холат, дезоксихолевую кислоту, дезоксихолат, гиодезоксихолевую кислоту, гиодезоксихолат, гликохолевую кислоту, гликохолат, таурохолевую кислоту, таурохолат, хенодезоксихолевую кислоту, хенодезоксихолат, литохолевую кислоту, литохолат и т.п. (и их соли).

Термины "пациент", "субъект", "индивидуум", и т.п. используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к любому животному или его клетке, или in vitro, или in situ, которые доступны в способах, описанных в данном документе. Согласно определенным неограничивающим вариантам осуществления пациент, субъект или индивидуум является человеком.

Используемый в данном документе термин "композиция" или "фармацевтическая композиция" относится к смеси по меньшей мере одного соединения по настоящему изобретению с другими химическими компонентами, такими как носители, стабилизаторы, разбавители, диспергирующие средства, суспендирующие средства, загустители и/или вспомогательные средства. Фармацевтическая композиция облегчает введение соединения в организм.

Используемые в данном документе термины "эффективное количество", "фармацевтически эффективное количество" и "терапевтически эффективное количество" относятся к нетоксичному, но достаточному количеству средства для обеспечения желаемого биологического результата. Результатом может быть уменьшение и/или облегчение признаков, симптомов или причин болезни или любое другое желаемое изменение биологической системы. Соответствующее терапевтическое количество в каждом отдельном случае может быть определено одним из специалистов в данной области техники, с использованием рутинного экспериментирования.

Используемый в данном документе термин "эффективность" относится к максимальному эффекту (Emax), достигнутому в исследовании.

Используемый в данном документе "обучающий материал" включает публикацию, запись, диаграмму или любую другую среду выражения, которые можно использовать для сообщения пользы соединения, композиции, вектора или системы доставки в наборе по настоящему изобретению для обеспечения облегчения различных заболеваний или расстройств, приведенных в данном документе. Необязательно или с другой стороны в обучающем материале может описываться один или несколько способов облегчения заболеваний или расстройств в клетке или ткани млекопитающего. Обучающий материал набора по настоящему изобретению может, например, быть прикреплен к контейнеру, который содержит идентифицированное соединение, композицию, вектор или систему доставки по настоящему изобретению, или может поставляться вместе с контейнером, который содержит идентифицированное соединение, композицию, вектор или систему доставки. Альтернативно, обучающий материал может поставляться отдельно от контейнера с намерением, чтобы обучающий материал и соединение получатель использовал совместно.

"Локальное введение" означает введение пациенту несистемным путем фармацевтического средства или в непосредственной близости от мышцы, или в нее, или в подкожное место. Таким образом, локальное введение исключает системные пути введения, такие как внутривенное или пероральное введение.

"Периферическое введение" означает введение в место, отдаленное от места симптома, в отличие от локального введения.

"Фармацевтически приемлемый" относится к тем свойствам и/или веществам, которые являются приемлемыми для пациента с фармакологической/токсикологической точки зрения и для фармацевта химика-Технолога с физической/химической точки зрения относительно композиции, состава, стабильности, переносимости пациентом и биодоступности. "Фармацевтически приемлемый носитель" относится к среде, которая не препятствует эффективности биологической активности активного(активных) ингредиента(ингредиентов) и не является токсичной для хозяина, которому его вводят.

"Терапевтическое" лечение представляет собой лечение, которое назначают субъекту, который проявляет признаки или симптомы патологии, с целью уменьшения или устранения этих признаков или симптомов.

Используемый в настоящем описании термин "лечение" или "обеспечение лечения" определяется как применение или введение терапевтического средства, т.е. соединения по настоящему изобретению (отдельно или в комбинации с другим фармацевтическим средством), пациенту или применение или введение терапевтического средства в выделенную ткань или клеточную линию от пациента (например, для диагностики или применения ex vivo), который характеризуется рассматриваемым в данном документе состоянием, симптомом рассматриваемого в данном документе состояния или потенциалом для развития рассматриваемого в данном документе состояния, с целью вылечить, исцелить, облегчить, ослабить, обратить, устранить, улучшить, усовершенствовать или повлиять на рассматриваемое в данном документе состояние, симптомы рассматриваемого в данном документе состояния или потенциал для развития рассматриваемого в данном документе состояния. Такие способы лечения могут быть специально разработаны или модифицированы на основе знаний, полученных из области фармакологии.

"Терапевтически эффективное количество" означает количество соединения по настоящему изобретению, которое при введении пациенту улучшает симптомы заболевания. Количество соединения по настоящему изобретению, которое представляет собой "терапевтически эффективное количество", будет варьировать в зависимости от соединения, состояния заболевания и его тяжести, возраста пациента, подлежащего лечению, и т.п. Терапевтически эффективное количество может быть определено рутинным способом специалистом в данной области с учетом его собственных знаний и данного раскрытия.

Диапазоны: в настоящем документе, различные аспекты настоящего изобретения могут быть представлены в формате диапазона. Следует понимать, что описание в формате диапазона предназначено лишь для удобства и краткости и не должно быть истолковано как негибкое ограничение объема настоящего изобретения. Соответственно, описание диапазона следует рассматривать как имеющее конкретно раскрытые все возможные поддиапазоны, а также отдельные числовые значения в пределах этого диапазона. Например, описание диапазона, например, от 1 до 6, следует рассматривать как имеющее специфические раскрытые поддиапазоны, такие как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 до 6 и т.д., а также отдельные числа в пределах этого диапазона, например, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 и 6. Это применяется независимо от ширины диапазона.

Описание

Стабильность и активность солей желчных кислот в значительной степени зависит от условий их рН. Настоящее изобретение частично связано с наблюдением того, что безопасность инъекции соли желчных кислот улучшается путем регулирования условия рН.

Настоящее изобретение относится к открытию того, что комбинация соответствующего диапазона концентрации соли желчных кислот в соответствующем диапазоне рН характеризуется важным значением для достижения желаемого терапевтического результата за счет снижения побочных эффектов. Например, более низкую концентрацию солей желчных кислот можно применять в составе с более низким значением рН, поскольку условие с более низким значением рН усиливает активность лизиса клеток солью желчных кислот. Предпочтительно, применяемое низкое значение рН не увеличивает неблагоприятные эффекты состава соли желчных кислот. Соответственно, неблагоприятные эффекты можно отличить от активности лизиса клеток при соответствующем уровне рН. Таким образом, в некоторых случаях применение более низкой концентрации соли желчных кислот в составе с более низким значением рН может уменьшить неблагоприятные эффекты соли желчных кислот без снижения активности лизиса клеток.

В случае дезоксихолата наблюдали осаждение дезоксихолата в растворах с более низким значением рН. В результате, для дезоксихолата необходимы буферы с более высоким значением рН. Однако растворы с более высоким значением рН, чем физиологическое, проявляли побочные эффекты. Соответственно, настоящее изобретение предусматривает состав раствора одного или нескольких из холата и хенодезоксихолата с физиологическим значением рН и низкими концентрациями, что обеспечивает дополнительные преимущества, такие как снижение побочных эффектов по сравнению с составом дезоксихолата.

Настоящее изобретение основано на неожиданном эффекте лизиса жира холатом in vivo, при котором холат не проявлял неблагоприятные эффекты на реципиента при концентрации, в которой в противном случае дезоксихолат проявлял неблагоприятные эффекты. Соответственно, настоящее изобретение предусматривает состав холата, в котором концентрация холата может быть выше, чем концентрация дезоксихолата, который также проявляет снижение неблагоприятного эффекта у пациента. Согласно другому аспекту, настоящее изобретение предусматривает состав холата, при этом концентрация холата может быть аналогичной концентрации дезоксихолата, но приводит в результате к большему эффекту лизиса жира, также проявляет снижение неблагоприятного эффекта у пациентов. Таким образом, настоящее изобретение предусматривает безопасную инъекцию по расщеплению жира, предусматривающую холат с эффективной концентрацией, которая не проявляет неблагоприятные эффекты по сравнению с применением дезоксихолата.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение предусматривает композиции и способы применения одного или нескольких из холата и хенодезоксихолата в качестве активного компонента для уменьшения количества жира у млекопитающих. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение предусматривает композиции и способы применения одного или нескольких из холата и хенодезоксихолата при инъекции по расщеплению жира.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение предусматривает композиции и способы, полезные при нехирургическом уменьшении локализованных жировых отложений у нуждающихся в этом пациентов, таким образом, способ предусматривает применение композиции, содержащей фармакологически активную желчную кислоту или ее соль, например, холат и хенодезоксихолат. Композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать другие средства, такие как противовоспалительные средства, аналгетики, диспергирующие средства и их фармацевтически приемлемые вспомогательные средства. Композиции по настоящему изобретению полезны для лечения локализованных жировых накоплений, включая жировые отложения под глазом, подбородком или рукой, а также ягодицей, голенью, спиной, бедром, лодыжкой или животом млекопитающего. Согласно другому варианту осуществления способы могут уменьшать определенные типы жировых отложений, таких как, например, образование грыжи жировой клетчатки века, липомы, липодистрофию, липодистрофию по типу "бычий горб" или жировые отложения, связанные с целлюлитом. Согласно одному варианту осуществления уменьшение количества жира не требует хирургических процедур, таких как липосакция.

Согласно одному варианту осуществления композиции по настоящему изобретению составлены так, чтобы они подходили для инъекции прямо в подвергаемый лечению участок нуждающегося в уменьшении количества жира пациента, без необходимости в хирургическом вмешательстве.

Согласно одному варианту осуществления нехирургический способ удаления жира не включает липосакцию, липопластику или липэктомию путем отсасывания жира.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение предусматривает композиции, способы и наборы для уменьшения подкожных жировых отложений, а также разглаживания дряблой кожи.

Композиция

Настоящее изобретение предусматривает композиции, полезные при нехирургическом уменьшении или удалении локализованных жировых отложений у нуждающихся в этом пациентов. Согласно одному варианту осуществления композиция содержит эффективное для лизиса жира количество одного или нескольких из холата и хенодезоксихолата. Согласно одному варианту осуществления композиции по настоящему изобретению полезны для лечения, среди прочего, локализованных жировых накоплений, включая образование грыжи жировой клетчатки, липодистрофию и жировые отложения, связанные с целлюлитом. Предпочтительно композиции по настоящему изобретению применяются таким образом, что не требуют хирургических процедур, таких как липосакция.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение предусматривает композицию биологически совместимых желчных кислот или их солей, включая одну или более фармакологически активную желчную кислоту и ее соль и фармацевтически приемлемые вспомогательные средства в водном носителе. В частности, в объеме настоящего изобретения существует вариант применения фармакологически активной желчной кислоты или ее соли для лизирования жира.

Несколько желчных кислот и их солей включены в настоящее изобретение. Например, желчные кислоты и их соли, охватываемые в настоящем изобретении, выбраны из холевой кислоты, хенодезоксихолевой кислоты и любой их соли. Согласно различным аспектам любая желчная кислота или конъюгат желчных кислот могут иметь форму физиологически приемлемой соли, например, натриевой соли или конъюгата с таурином или глицином холевой кислоты или хенодезоксихолевой кислоты. Согласно одному аспекту термин холевая кислота относится к натриевой соли холевой кислоты. Согласно одному варианту осуществления холевая кислота (холат) представляет собой активный ингредиент в составе по настоящему изобретению. Согласно другому аспекту, термин хенодезоксихолевая кислота относится к натриевой соли хенодезоксихолевой кислоты. Согласно одному варианту осуществления хенодезоксихолевая кислота (хенодезоксихолат) представляет собой активный ингредиент в составе по настоящему изобретению.

В некоторых случаях термины соединение холата, холат и холевая кислота применяют взаимозаменяемо. В некоторых случаях термины соединение хенодезоксихолата, хенодезоксихолат и хенодезоксихолевая кислота применяют взаимозаменяемо.

Согласно одному варианту осуществления адекватные количества подходящей желчной кислоты предусматриваются в данном документе в качестве определенной фармацевтической композиции. Согласно одному аспекту определенные фармацевтические композиции холата и хенодезоксихолата не содержат каких-либо фрагментов животного происхождения и пирогенов млекопитающих и/или бактерий. Согласно другому аспекту представлены адекватные количества подходящего одного или нескольких из холата и хенодезоксихолата, как определено в фармацевтических композициях, которые можно применять в качестве инъекцируемой фармацевтической композиции для удаления локализованного жира наряду с соответствующей композицией. Определенный вводимый раствор из одного или нескольких из холата и хенодезоксихолата по настоящему изобретению можно объединять с молекулой, которая вызывает удаление жира.

Согласно некоторым вариантам осуществления соль желчных кислот включает катион, выбранный из группы, состоящей из натрия (Na+), калия (К+), лития (Li+), магния (Mg2+), кальция (Са2+), бария (Ва2+), стронция (Sr2+) и аммония (NH4+). Согласно некоторым вариантам осуществления детергент содержит соль желчных кислот с катионом, который представляет собой щелочной металл или щелочноземельный металл. Предпочтительно щелочной металл является натрием (Na+), калием (К+) или литием (Li+), и щелочноземельный металл является магнием (Mg2+), кальцием (Са2+), барием (Ва2+) или стронцием (Sr2+). Согласно определенным вариантам осуществления соли желчных кислот, применяемые в способах и композициях, описанных в настоящей документе, представляют собой фармацевтически приемлемые соли, включая в качестве не ограничивающего примера их натриевые и калиевые соли.

Согласно определенным вариантам осуществления концентрация одной или нескольких из композиций холата и хенодезоксихолата по настоящему изобретению могут содержать приблизительно 0,5%, приблизительно 1%, приблизительно 2%, приблизительно 3%, приблизительно 4%, приблизительно 5%, приблизительно 6%, приблизительно 7%, приблизительно 8%, приблизительно 9%, приблизительно 10%, приблизительно 11%), приблизительно 12%, приблизительно 13%, приблизительно 14%, приблизительно 15%, приблизительно 16%, приблизительно 17%, приблизительно 18%, приблизительно 19%, приблизительно 20%, приблизительно 21%, приблизительно 22%, приблизительно 23%, приблизительно 24%, приблизительно 25%, приблизительно 26%, приблизительно 27%, приблизительно 28%, приблизительно 29%, приблизительно 30%, приблизительно 31%, приблизительно 32%, приблизительно 33%, приблизительно 34%, приблизительно 35%, приблизительно 36%, приблизительно 37%, приблизительно 38%, приблизительно 39%, приблизительно 40%, приблизительно 41%, приблизительно 42%, приблизительно 43%, приблизительно 44%, приблизительно 45%, приблизительно 46%, приблизительно 47%, приблизительно 48%, приблизительно 49%, приблизительно 50%, приблизительно 51%, приблизительно 52%, приблизительно 53%, приблизительно 54%, приблизительно 55%, приблизительно 56%, приблизительно 57%, приблизительно 58%, приблизительно 59%, приблизительно 60%, приблизительно 61%, приблизительно 62%, приблизительно 63%, приблизительно 64%, приблизительно 65%, приблизительно 66%, приблизительно 67%, приблизительно 68%, приблизительно 69%, приблизительно 70%, приблизительно 71%, приблизительно 72%, приблизительно 73%, приблизительно 74%, приблизительно 75%, приблизительно 76%, приблизительно 77%, приблизительно 78%, приблизительно 79%, приблизительно 80%, приблизительно 81%, приблизительно 82%, приблизительно 83%, приблизительно 84%, приблизительно 85%, приблизительно 86%, приблизительно 87%, приблизительно 88%, приблизительно 89%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99%, приблизительно 100% или любой диапазон, который можно получить из них, композиции по настоящему изобретению по весу или объему. Таким образом, рассмотрено, что композиции из одного или нескольких из холата и хенодезоксихолата могут содержать один или несколько из холата и хенодезоксихолата в любой комбинации или процентном диапазоне.

Согласно одному варианту осуществления композиции по настоящему изобретению в данном документе являются раствором. Предпочтительно, раствор является водным.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к раствору для подкожной инъекции, содержащему (i) терапевтически эффективное количество одного или нескольких из фармакологически активного холата и хенодезоксихолата и (ii) фармацевтическое, ветеринарное или косметическое вспомогательное средство.

Согласно некоторым вариантам осуществления раствор может дополнительно содержать второе терапевтическое средство, выбранное из группы, состоящей из противомикробных средств, вазоконстрикторов, антитромботических средств, антикоагулянтов, подавителей образования пены, противовоспалительных средств, анлгетиков, диспергирующих средств, антидиспергирующих средств, веществ, способствующих проникновению, стероидов, транквилизаторов, миорелаксантов и противодиарейных средств.

Согласно некоторым вариантам осуществления раствор представляет собой контейнер, который содержит до 500 мл раствора. Такой контейнер может представлять собой шприц или контейнер, загружаемый шприцом.

Композиции (например, растворы) включают терапевтически эффективное количество одного или нескольких из холата и хенодезоксихолата. Такие терапевтически эффективные количества являются эффективными при уменьшении подкожного жирового отложения или разглаживании области дряблой кожи с неблагоприятными эффектами.

Один или несколько из холата и хенодезоксихолата в растворе по настоящему изобретению могут характеризоваться концентрацией от приблизительно 0,001 до 10, от 0,01 до 5 или от 0,1 до 2% вес/вес, вес/об. или об./об. Предпочтительно один или несколько из холата и хенодезоксихолата в растворе могут характеризоваться концентрацией от приблизительно 0,1-5 вес/вес или более, предпочтительно приблизительно 1% вес/вес.

Согласно одному варианту осуществления один или несколько из холата и хенодезоксихолата составлены так, что характеризуются значением рН ниже приблизительно 9 для того, чтобы один или несколько из холата и хенодезоксихолата были эффективными при лизисе жира. Согласно одному варианту осуществления один или несколько из холата и хенодезоксихолата составлены так, что характеризуются значением рН ниже приблизительно 8 для того, чтобы один или несколько из холата и хенодезоксихолата были эффективными при лизисе жира. Согласно одному варианту осуществления один или несколько из холата и хенодезоксихолата составлены так, что характеризуются значением рН ниже приблизительно 7,5 для того, чтобы один или несколько из холата и хенодезоксихолата были эффективными при лизисе жира. Согласно одному варианту осуществления один или несколько из холата и хенодезоксихолата составлены так, что характеризуются значением рН ниже приблизительно 7,0 для того, чтобы один или несколько из холата и хенодезоксихолата были эффективными при лизисе жира. Предпочтительно, состав представляет собой жидкий состав, где один или несколько из холата и хенодезоксихолата находятся в стабильной форме при 25°С. Используемая в данном документе стабильная форма не является гелеобразной формой или формой осадка.

Согласно одному варианту осуществления один или несколько из холата и хенодезоксихолата составлены так, что характеризуются концентрацией от приблизительно 0,5% до приблизительно 4,0%. Согласно одному варианту осуществления один или несколько из холата и хенодезоксихолата составлены так, что характеризуются концентрацией от приблизительно 0,5% до приблизительно 2,0%. Предпочтительно состав представляет собой жидкий состав, где один или несколько из холата и хенодезоксихолата находятся в стабильной форме при 25°С. Используемая в данном документе стабильная форма не является гелеобразной формой или формой осадка.

Согласно одному варианту осуществления один или несколько из холата и хенодезоксихолата составлены так, что характеризуются концентрацией от приблизительно 0,5% до приблизительно 4,0% в буфере со значением рН менее чем приблизительно 9. Согласно одному варианту осуществления один или несколько из холата и хенодезоксихолата составлены так, что характеризуются концентрацией от приблизительно 0,5% до приблизительно 4,0% в буфере со значением рН менее приблизительно 8. Согласно одному варианту осуществления один или несколько из холата и хенодезоксихолата составлены так, что характеризуются концентрацией от приблизительно 0,5% до приблизительно 4,0% в буфере со значением рН менее приблизительно 7,5. Согласно одному варианту осуществления один или несколько из холата и хенодезоксихолата составлены так, что характеризуются концентрацией от приблизительно 0,5% до приблизительно 4,0% в буфере со значением рН менее приблизительно 7. Предпочтительно состав представляет собой жидкий состав, где один или несколько из холата и хенодезоксихолата находятся в стабильной форме при 25°С. Используемая в данном документе стабильная форма не является гелеобразной формой или формой осадка.

Согласно одному варианту осуществления один или несколько из холата и хенодезоксихолата составлены так, что характеризуются концентрацией от приблизительно 0,5% до приблизительно 2,0% в буфере со значением рН менее приблизительно 9. Согласно одному варианту осуществления один или несколько из холата и хенодезоксихолата составлены так, что характеризуются концентрацией от приблизительно 0,5% до приблизительно 2,0% в буфере со значением рН менее приблизительно 8. Согласно одному варианту осуществления один или несколько из холата и хенодезоксихолата составлены так, что характеризуются концентрацией от приблизительно 0,5% до приблизительно 2,0% в буфере со значением рН менее приблизительно 7,5. Согласно одному варианту осуществления один или несколько из холата и хенодезоксихолата составлены так, что характеризуются концентрацией от приблизительно 0,5% до приблизительно 2,0% в буфере со значением рН менее приблизительно 7. Предпочтительно состав представляет собой жидкий состав, где один или несколько из холата и хенодезоксихолата находятся в стабильной форме при 25°С.Используемая в данном документе стабильная форма не является гелеобразной формой или формой осадка.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение предусматривает состав из одного или нескольких из холата и хенодезоксихолата с концентрацией от приблизительно 0,5% до приблизительно 2,0% в буфере со значением рН менее приблизительно 8 в стабильной форме при 25°С. Преимущество состава по настоящему изобретению заключается в том, что раствор соли желчных кислот с физиологическим значением рН и низкой концентрацией уменьшает побочные эффекты при применении раствора с более высоким значением рН и более высокими концентрациями солей желчных кислот.

Способ

Композицию по настоящему изобретению можно применять в многочисленных клинических случаях. Настоящее изобретение относится к применению одного или нескольких фармакологически активных одного или Нескольких из холата и хенодезоксихолата для уменьшения подкожных жировых накоплений у млекопитающих путем введения такого состава локально в целевой участок. Другие варианты использования данной композиции могут включать растворение липом, жира, мезотерапию, отделение ткани, уменьшение опухоли, уменьшение онкологического заболевания, лечение онкологического заболевания, а также любой другой клинический случай, при котором можно было бы использовать ослабление, удаление, помощь при истощении тела или расщепление воска, липидов, белков или углеводов из части или области тела. Например, при лечении липом, можно Проводить подкожную инъекцию композиции для контакта с липомами для лизиса липом. Также можно использовать любой другой подходящий способ применения относительно липом.

Согласно одному варианту осуществления композицию по настоящему изобретению применяют для уменьшения жирового отложения у субъекта. В некоторых случаях, жировое отложение связано с состоянием, выбранным из группы, состоящей из ожирения, синдрома перераспределения жировой ткани, грыжи жировой клетчатки века, липом, болезни Деркума, липодистрофии, липодистрофии по типу "бычий горб", дорсоцервикального ожирения, висцерального ожирения, увеличения груди, гиперадипоза, диффузного распространения туловищного жира вокруг туловища и рук и жировых отложений, связанных с целлюлитом. Согласно предпочтительному варианту осуществления способы по настоящему изобретению не включают осуществление хирургического вмешательства на субъекте.

Композиция по настоящему изобретению может быль полезна при лечении гранулем, шрамов, опухолей, кистозных угрей, атером, гиперплазии сальных желез, болезней сальных желез, дерматозов, связанных с угрями, болезней подкожной жировой ткани, опухолей, удаления татуировок, инфекций и биопленок, целлюлита, жировых отложений, жировой ткани и связанных состояний. Ее также можно применять для выравнивания дефектов формы кожи (таких как асимметрия груди или асимметрия губ, например, после излишней коррекции с помощью наполнителя кожи или гиперчувствительности тела к инъекции). Такую процедуру можно провести в живой ткани, ткани, удаленной из организма, или для помощи в патологических или детективных оценках. Ее можно провести на ткани, сыворотке крови или любой другой части тела. Помимо ухода за человеком, композиция также применима для ухода за животными.

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к способам уменьшения количества жира у субъекта. Такие способы включают этап локального введения в целевую область композиции по настоящему изобретению.

Согласно некоторым вариантам осуществления этап введения включает доставку композиции по настоящему изобретению путем подкожной или внутрикожкой инъекции.

Согласно некоторым вариантам осуществления этап введения включает доставку композиции по настоящему изобретению посредством дермального пластыря, насоса или подкожного депо.

Согласно некоторым вариантам осуществления этап введения включает доставку композиции по настоящему изобретению наружно или подкожно.

Согласно некоторым вариантам осуществления область целевого участка, который обрабатывают, находится под глазом, под подбородком, под рукой, ягодицей, щекой, бровью, голенью, спиной, бедром, лодыжкой или животом.

Согласно некоторым вариантам осуществления композиции, которые применяют для уменьшения количества жира у субъекта, составлены с раствором для разглаживания кожи. Такой разглаживающий кожу раствор может дополнительно содержать второе терапевтическое средство, выбранное из группы, состоящей из противомикробных средств, вазоконстрикторов, антитромботических средств, антикоагулянтов, подавителей образования пены, противовоспалительных средств, аналгетиков, диспергирующих средств, антидиспергирующих средств, веществ, способствующих проникновению, стероидов, транквилизаторов, миорелаксантов и противодиарейных средств.

Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему изобретению не включают осуществление хирургического вмешательства на субъекте.

Согласно определенным вариантам осуществления время между первой обработкой и второй обработкой по настоящему изобретению составляет по меньшей мере одну неделю, по меньшей мере две недели, по меньшей мере один месяц, по меньшей мере 2 месяца, по меньшей мере 12 недель, по меньшей мере 13 недель, по меньшей мере 14 недель, по меньшей мере 15 недель, по меньшей мере 16 недель, по меньшей мере 17 недель, по меньшей мере 18 недель, по меньшей мере 19 недель, по меньшей мере 20 недель, по меньшей мере 21 неделю, по меньшей мере 22 недели, по меньшей мере 23 недели, по меньшей мере 24 недели, по меньшей мере 25 недель, по меньшей мере 26 недель, по меньшей мере 27 недель, по меньшей мере 28 недель, по меньшей мере 29 недель, по меньшей мере 30 недель, по меньшей мере 31 неделю, по меньшей мере 32 недели, по меньшей мере 33 недели, по меньшей мере 34 недели, по меньшей мере 35 недель, по меньшей мере 36 недель, по меньшей мере 37 недель, по меньшей мере 38 недель, по меньшей мере 39 недель, по меньшей мере 40 недель, по меньшей мере 41 неделю, по меньшей мере 42 недели, по меньшей мере 43 недели, по меньшей мере 44 недели, по меньшей мере 45 недель, по меньшей мере 46 недель, по меньшей мере 47 недель, по меньшей мере 48 недель, по меньшей мере 49 недель, по меньшей мере 50 недель, по меньшей мере 51 неделю, по меньшей мере 52 недели или более.

Фармацевтические композиции

Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение предусматривает жидкую фармацевтическую композицию, содержащую один или несколько из холата и хенодезоксихолата в буфере со значением рН менее приблизительно 9, менее приблизительно 8, менее приблизительно 7,5 или менее приблизительно 7. Согласно одному варианту осуществления один или несколько из холата и хенодезоксихолата стабильны в жидкой фармацевтической композиции при 25°С. Согласно одному варианту осуществления стабильный в жидкой фармацевтической композиции при 25°С означает, что один или несколько из холата и хенодезоксихолата находятся не в гелеобразной форме или форме осадка.

Составы фармацевтических композиций, описанных в данном документе, могут быть подготовлены любым известным способом или позднее разработанным в области фармакологии. В целом, такие способы подготовки включают этап приведения активного ингредиента в ассоциацию с носителем или одним или несколькими другими вспомогательными ингредиентами, а затем, если необходимо или требуется, придания формы или упаковки продукта в необходимую единицу с одной или несколькими дозами.

Несмотря на то, что описания фармацевтических композиций, предоставленные в данном документе, главным образом направлены на фармацевтические композиции, которые подходят для рецептурного введения людям, квалифицированному специалисту в данной области будет понятно, что такие композиции в целом подходят для введения животным всех видов. Хорошо понятна модификация фармацевтических композиций, подходящих для введения людям, для того, чтобы привести композиции в состояние, пригодное для введения различным животным, и рядовой специалист в ветеринарной фармакологии может спланировать и выполнить такую модификацию с помощью исключительно простого, при необходимости, опыта. Субъекты, для которых предполагается введение фармацевтических композиций по настоящему изобретению, включают, но без Ограничения, людей и других приматов, млекопитающих, в том числе коммерчески важных млекопитающих, таких как отличные от человека приматы, крупный рогатый скот, свиньи, лошади, овцы, кошки и собаки.

Фармацевтические композиции, которые пригодны в способах настоящего изобретения, могут быть получены, упакованы или проданы в составах, подходящих для офтальмического, перорального, ректального, вагинального, парентерального, наружного, пульмонального, интраназального, трансбуккального или другого пути введения. Другие предполагаемые составы включают спроектированные наночастицы, липосомные препараты, "вторично запечатанные" эритроциты, содержащие активный ингредиент, и составы на иммунологической основе.

Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может быть получена, упакована или продана в объеме, таком как однократная доза или как множество однократных доз. Как используется в данном документе, "однократная доза" представляет собой отдельное количество фармацевтической композиции, которое содержит заранее определенное количество активного ингредиента. Количество активного ингредиента обычно является равным дозировке активного ингредиента, которая будет введена субъекту, или подходящей доле такой дозировки, такой как, например, половина или треть такой дозировки.

Относительные количества активного ингредиента, фармацевтически приемлемого носителя и любых дополнительных ингредиентов в фармацевтической композиции по настоящему изобретению будут варьировать в зависимости от индивидуальных особенностей, размера и состояния субъекта, подвергаемого лечению, а также в зависимости от пути, с помощью которого вводят композицию. В качестве примера композиция может содержать от 0,1% до 100% (вес/вес) активного ингредиента.

Составы с контролируемым или с замедленным высвобождением фармацевтической композиции по настоящему изобретению можно получить с применением обычной технологии.

Фармацевтические композиции могут быть получены, упакованы или проданы в форме стерильной инъекционной водной или масляной суспензии или раствора. Эта суспензия или раствор могут быть составлены согласно известному уровню техники и могут включать, кроме активного ингредиента, дополнительные ингредиенты, такие как диспергирующие средства, смачивающее средства или суспендирующие средства, описанные в данном документе. Такие стерильные инъекционные составы могут быть получены с применением нетоксичного парентерально приемлемого разбавителя или растворителя, такого как, например, вода или 1,3-бутандиол. Другие приемлемые разбавители и растворители включают, но без ограничения, раствор Рингера, изотонический раствор хлорида натрия и нелетучие масла, такие как синтетические моно- или диглицериды. Другие парентерально вводимые составы, которые являются применимыми, включают такие, которые включают активный ингредиент в микрокристаллической форме, в липосомальном препарате или в качестве компонента биоразлагаемых полимерных систем. Композиции для замедленного высвобождения или вживления могут содержать фармацевтически приемлемые полимерные или гидрофобные материалы, такие как эмульсию, ионообменную смолу, умеренно растворимый полимер или умеренно растворимую соль.

Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может быть получена, упакована или продана в составе, подходящем для транскубального введения. Такие составы могут, например, иметь форму таблеток или пастилок, полученных с применением традиционных способов, и могут, например, содержать 0,1-20% (вес/вес) активного ингредиента, остаток, включающий перорально растворяемую или биоразлагаемую композицию и необязательно один или несколько дополнительных ингредиентов, описанных в данном документе. С другой стороны составы, подходящие для транскубального введения, могут включать порошок или аэрозольный или распыляемый раствор или суспензию, включающую активный ингредиент. Такие порошковые, аэрозольные или распыляемые составы при распылении предпочтительно имеют средний размер частицы или капли в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 200 нанометров и могут дополнительно включать один или несколько дополнительных ингредиентов, описанных в данном документе.

Как используется в данном документе, "дополнительные ингредиенты" включают, но без ограничения, одно или несколько из следующих: вспомогательные средства; поверхностно активные вещества; диспергирующие средства; инертные разбавители; гранулирующие средства и средства, способствующие распадаемости; связующие средства; смазывающие средства; подслащающие средства; ароматизующие средства; красители; консерванты; физиологически разлагаемые композиции, такие как желатин; водные носители и растворители; масляные носители и растворители; суспендирующие средства; диспергирующие или смачивающие средства; эмульгирующие средства, средства, уменьшающие раздражение; буферы; соли; загустители; наполнители; эмульгирующие средства; антиоксиданты; антибиотики; противогрибковые средства; стабилизаторы и фармацевтически приемлемые полимерные или гидрофобные материалы. Другие "дополнительные ингредиенты", которые могут быть включены в фармацевтические композиции по настоящему изобретению, известны из уровня техники и описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences (1985, Genaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA), которая включена в данный документ посредством ссылки.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРИМЕРЫ

Настоящее изобретение дополнительно подробно описано посредством ссылки на следующие экспериментальные примеры. Эти примеры приведены исключительно с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения, если не указано иное. Таким образом, настоящее изобретение не должно любым путем истолковываться как ограниченное следующими примерами, но, скорее, должно истолковываться как охватывающее любые и все варианты, которые становятся очевидными в результате объяснений, приведенных в данном документе.

Без дополнительного описания считается, что специалист в данной области может, с применением предыдущего описания и следующих иллюстративных примеров, создать и использовать соединения по настоящему изобретению и осуществлять на практике заявленные способы. Следующие рассматриваемые примеры, таким образом, конкретно показывают предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения и не подразумеваются как ограничивающие каким-либо образом остальную часть раскрытия.

Пример 1. Желчные кислоты и соли для уменьшения количества жира

Представленные в данном документе результаты показали неожиданные полученные данные, в которых эффект лизиса жира холатом обеспечивает применение холата в качестве активного компонента при инъекции по расщеплению жира, в частности в концентрации, не предусмотренной результатами in vitro и ex vivo.

Далее будут описаны материалы и способы, используемые в данных экспериментах.

Культура клеток и дифференциация адипоцитов in vitro

Клетки 3T3-L1 культивировали в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки в увлажненной атмосфере, содержащей 5%СО2/95% воздуха при 37□, до слияния. Для индукции дифференциации адипоцитов преадипоциты 3T3-L1 сеяли в 96-луночные планшеты (5X103 клеток/лунку) и выращивали до 2 дней после слияния (день 0), а затем обрабатывали в течение 2 дней с помощью сред для роста с MDI (0,5 мкМ метилизобутилксантина, 1 мкМ дексаметазона и 10 мкг/мл инсулина; все от Sigma-Aldrich Chemical, Сент-Луис, Миссури, США), с дальнейшей обработкой в течение 2 дней средами, содержащими отдельно 10 мкг/мл инсулина. Среду заменяли каждые 2 дня в течение следующих 8 дней.

Окрашивание масляным красным О

От семи до десяти дней после индукции дифференциации, клетки дважды промывали фосфатным буферным раствором (PBS), фиксировали с помощью 10% формалина в течение 1 часа и три раза промывали PBS. Клетки окрашивали фильтрованным рабочим раствором масляного красного О (0,3%) в течение 20 минут и окрашенные клетки промывали три раза дистиллированной водой. Изображения получали с применением инвертированного микроскопа Olympus, оснащенного цифровой камерой Olympus.

Эффект лизиса клеток in vitro с помощью детергента

Дифференцированные адипоциты в 96-луночных планшетах дважды промывали PBS и инкубировали при различных концентрациях солей желчных кислот в DMEM без сыворотки. Через 1 час инкубации при 37°С меняли среды и добавляли 20 мкл раствора МТТ (5 мг МТТ/мл в PBS) в каждую лунку и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Полученный продукт формазан растворяли в 100 мкл DMSO/лунку и жизнеспособность клеток определяли путем измерения оптической плотности при 570 нм (OD570) с применением считывающего устройства для микропланшетов.

Получение жировой ткани мышей и исследование лизиса жира ex vivo

Паховые скопления жировой ткани (подкожного жира) вырезали у мышей с ожирением, вызванным рационом, и разрезали до приблизительно аналогичного размера. 100 мг образцов тканей переносили в 48-луночные планшеты и инкубировали в течение 10 минут с 350 мкл DCA, CDCA, СА и фосфатного буфера с различными концентрациями и значениями рН. 70 мкл раствора МТТ (5 мг/мл в PBS) добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение ночи при 37°С. Раствор удаляли и осажденный продукт формазан растворяли в 300 мкл DMSO. Жизнеспособность тканей отслеживали путем измерения оптической плотности при 570 нм (OD570) с применением считывающего устройства для микропланшетов.

Индукция ожирения, вызванного рационом, у мышей

Четырехнедельных самцов мышей C57BL/6N приобретали у Orient Bio (Соннам, Южная Корея). Мышей кормили рационом с высоким содержанием жиров (D12331 - состоящий на 58% калорий из жира, 16,4% калорий из белков и 25,5% калорий из углеводов, главным образом сахарозы; Research Diets, Нью-Брансуик, Нью-Джерси, США) начиная с 4 недели жизни до 18 недель. Мышей содержали в условиях с контролируемым климатом (22,8±2,0°С, 45~50% влажности), с периодом чередования 12 часов света/12 часов темноты. Вода и обозначенный рацион были доступны в неограниченном количестве. Вес тела отдельной мыши отслеживали раз в две недели.

Отслеживание in vivo солей желчных кислот, вызывающих потерю жира

Самец C57BL/6N мыши находился в клетке и его кормили рационом с высоким содержанием жиров в течение 12 недель. Влияние солей желчных кислот in vivo отслеживали путем прямой инъекции соли желчных кислот в подкожную жировую ткань. Вкратце, после индукции ожирения, вызванного рационом, мышей анестезировали кетамином и ксилазином (60 мг/кг и 12,5 мг/кг, соответственно, введенных внутрибрюшинной инъекцией). Места инъекции у мышей выбривали с помощью электронной стригальной машинки. 100 мкл солей желчных кислот (DCA, CDCA и С А, 1%о вес/об.) инъецировали в паховое скопление жировой ткани мышей с ожирением с правой стороны. Инъекции повторяли еще 4 раза в течение 2 недель. Паховые скопления жировой ткани мышей с левой стороны получали такой же объемом PBS в качестве контроля. Мышей умерщвляли через 4 дня после последней Инъекции. Измеряли вес тела и вес паховой жировой ткани из каждой группы мышей. Жировые ткани в области инъекции препарировали, фиксировали 10%) формалином и заключали в парафиновый блок для гистологического исследования.

Количественное определение площади некроза in vivo

После индукции ожирения, вызванного рационом, мышей анестезировали кетамином и ксилазином (60 мг/кг и 12,5 мг/кг, соответственно, введенные внутрибрюшинной инъекцией). Места инъекции у мышей выбривали с помощью электронной стригальной машинки. Различные концентрации растворов солей желчных кислот (DCA, CDCA и СА) в объеме 100 мкл PBS инъецировали в паховые скопления жировой ткани мышей с ожирением. Мышей умерщвляли через 1 день после инъекции. Паховые скопления жировой ткани мышей окрашивали с помощью 2% ТТС (Sigma-Aldrich Chemical, Сент-Луис, Миссури, США) в PBS в течение 2 часов для идентификации площадей без некроза и с некрозом и последовательно погружали в 10% формалин для усиления контраста. Площадь некроза была представлена в виде площади, не окрашеной ТТС. Внешний вид и площадь некроза областей жировой ткани фиксировали и отображали с помощью сканера. Площадь некроза скопления жировой ткани, обработанной DCA, CDCA, СА и PBS, подсчитывали с помощью Image J.

Стабильность солей желчных кислот в водном растворе

Для тестирования растворимости и стабильности солей желчных кислот получали различные значения рН фосфатного буфера (10 мМ; рН 6,5, 6,7, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,3) путем растворения двухосновного фосфата натрия и одноосновного фосфата натрия в воде. 0,01 г солей желчных кислот (UDCA, DCA, CDCA и С А) растворяли в 1 мл фосфатного буфера и оставляли при комнатной температуре на 10 дней.

Отслеживание тканеспецифичных эффектов солей желчных кислот in vivo

100 мкл DCA, СА и PBS (1%, 0,5% и 0,25%) инъецировали в хвосты (1 см каудальнее к его основанию) самок мышей ICR. Мышей умерщвляли через 14 дней, и в это время ткани в месте инъекции собирали и фиксировали в 4% формалине. Стандартные гистологические срезы были вырезаны перпендикулярно к продольной оси хвоста в пределах 5 мм от места инъекции. Затем образцы готовили для окрашивания гематоксилином и эозином (Н & Е). Изображения фиксировали с применением микроскопа Olympus, оснащенного цифровой камерой Olympus.

Отслеживание побочных эффектов на коже in vivo

Для отслеживания неблагоприятных эффектов солей желчных кислот на коже подкожно инъецировали различные концентрации (1,5%, 1% и 0,5% в объеме 100 мкл) DCA, СА и PBS подкожно в бок мышам. Инъекции повторяли еще 1 раз через 3 дня после первой инъекции. Мышей умерщвляли через 4 дня после последней инъекции. Тяжесть поражения кожи оценивали по следующим критериям. Общую оценку степени тяжести кожи определяли как сумму индивидуальных оценок по каждому из следующего признака и длины поражения. Длину поражения определяли путем измерения наибольшего диаметра наибольшего идентифицированного поражения. Измеренная длина должна включать только поражение и не захватывать клинически нормальную кожу. Длиу захвата поражением в пределах каждого инъецированного места оценивали от 0 до 3, где 0 = отсутствие вовлеченного поражения; 1 = ≤ 0,2 см, 2 = 0,2~0,5 см, 3 = > 0,5 см от длины места затронуты. Признак поражения оценивали от 0 до 3, где 0 = отсутствие повреждений, 1 = одна экскориация или один маленький точечный струп (< 2 мм), 2 = множественные, небольшие точечные струпья или сросшиеся струпья (> 2 мм), 3 = эрозии или язвы.

Отек лапы, вызванный солью желчных кислот

Самцов SD крыс (в возрасте 6 недель) приобретали у Koatech Со. (Сеул, Корея) и использовали после 1 недели акклиматизации. Крыс (200~230 г) выбирали случайным образом и объем интактной крысиной лапы измеряли во всех группах с помощью цифрового штангенциркуля (Bluebird, Сеул, Корея). Перед индукцией отека лапы крыс анестезировали кетамином и ксилазином (60 мг/кг и 12,5 мг/кг, соответственно, введенные внутрибрюшинной инъекцией). Для индукции отека, крысы получали 100 мкл различных солей желчных кислот и PBS в область подошвы задней лапы крыс. Измерения объема лапы проводили с помощью штангенциркуля непосредственно перед инъекцией солей желчных кислот и через 4 часа после инъекции.

Далее будут описаны результаты экспериментов.

Биологическая активность желчных кислот и солей

Биологическая активность молекулы соли желчных кислот тесно связана с ее химическими свойствами, такими как количество и ориентации гидроксильных групп или их конъюгация. Данные параметры непосредственно влияют на ее гидрофобность, которая представляет собой хорошо известный показатель токсичности и детергентной способности. Гидрофильный индекс солей желчных кислот не только пропорционален количеству гидроксильных групп, но также зависит от их позиции по обе стороны от стерольного кольца.

Детергентная эффективность солей желчных кислот непосредственно влияет на их токсичность. Как правило, более мощный детергент показывает более токсичные свойства. DCA часто используют в качестве биологического детергента для лизиса клеток и солюбилизации клеточных компонентов, так как DCA, как известно, является одним из самых сильных детергентов в семействе солей желчных кислот. Применение DCA для удаления туловищного жира связано со значительными неблагоприятными эффектами. Во избежание серьезных неблагоприятных эффектов, для замены DCA желательно применять более безопасные соли желчных кислот. Однако предполагают, что менее токсичные соли желчных кислот также характеризуются слабой детергентной эффективностью и биологической активностью.

По этой причине проводили эксперименты для сравнения активности лизиса клеток различными солями желчных кислот по сравнению с эффектами от DCA, с помощью простого, количественного анализа измерения жизнеспособности клетки. Для наблюдения за активностью лизиса адипоцитов, применяли дифференцированную клеточную линию адипоцитов 3T3-L1 (фигура 1). Жизнеспособность клеток отслеживали с помощью анализа МТТ. В предварительных экспериментах эффект лизиса клеток солями желчных кислот, включая TUDCA, CDCA, CA, HDCA, UDCA и DCA, сравнивали при различных концентрациях. При низкой концентрации (например, ниже 0,1%), только два типа солей желчных кислот, DCA, CDCA, снижали жизнеспособность клеток адипоцитов (фигура 2А). CDCA продемонстрировал подобную к DCA активность лизиса клеток при сходных концентрациях. Для тестирования эффекта лизиса остальных солей желчных кислот при высокой концентрации проводили эксперименты с применением до 2% концентрации СА и TUDCA. Обработка TUDCA не снижала жизнеспособность клеток адипоцитов. Однако СА продемонстрировал уничтожение клетки при таких более высоких концентрациях (фигура 2В). HDCA и HDCA продемонстрировали немного более высокий эффект уничтожения клетки по сравнению с СА при аналогичной концентрации (фигура 2С). Активность лизиса клеток СА, HDCA и UDCA была значительно ниже, чем у DCA и CDCA. Для сравнения относительной активности лизиса клеток каждой соли желчных кислот измеряли ЕС50 (концентрация, при которой уничтожается 50% клеток) DCA, CDCA, HDCA, UDCA и СА. ЕС50 DCA, CDCA, HDCA, UDCA и СА составляла 0,051%, 0,060%, 0,42%, 0,25% и 0,42%, соответственно (таблица 1). ЕС50 СА была приблизительно в 7~8 раз выше, чем у DCA и CDCA.

Результаты в условях in vitro предполагают, что DCA и CDCA могут эффективно лизировать жировые клетки, и, следовательно, их рассматривают как компоненты при инъекции по расщеплению жира. Без желания связи с какой-либо конкретной теорией отсутствие эффекта лизиса клетки TUDCA может иметь место из-за его низкой детергентной активности, что предполагает, что TUDCA не подходит для инъекции по расщеплению жира. Очень низкая активность лизиса СА, HDCA и UDCA в условиях in vitro позволяет предположить, что в качестве компонента при инъекции по расщеплению жира может потребоваться очень высокая концентрация СА, HDCA и UDCA. Таким образом, считается, исходя из представленных в данном документе результатов in vitro, что только CDCA может эффективно заменить DCA при инъекции по расщеплению жира.

Однако представленные в данном документе результаты показывают, что результаты in vitro не всегда отображают реальную ситуацию in vivo. Например, монослой культивируемых клеток не мог отображать структуры неповрежденной ткани. Поскольку проникновение в неповрежденные ткани могло повлиять на активность лизиса клеток солями желчных кислот, проводили эксперименты для тестирования литического эффекта на жировую ткань DCA, CDCA, HDCA и СА при различных концентрациях ex vivo. Подкожные жировые ткани были свежевыделены из мышей C57BL/6N, которых кормили рационом с высоким содержанием жиров в течение 12 недель. Жировые ткани инкубировали при различных концентрациях растворов солей желчных кислот в течение 10 минут. Показатели литической активности в отношении тканей измеряли с помощью анализа МТТ (фигура 3). Все четыре раствора солей продемонстрировали эффекты лизиса жировой ткани. DCA и CDCA продемонстрировали активность лизиса ткани, подобную результату у культивируемых клеток. Для сравнения относительной лизисной активности каждой соли желчных кислот в условиях ex vivo рассчитывали ЕС50 DCA, CDCA, HDCA и СА. Концентрации ЕС50 DCA, CDCA, HDCA и СА составляли 0,0179%, 0,0180%, 0,0250 и 0,0727%, соответственно (таблица 2). Лизисная активность СА, HDCA была еще ниже, чем у DCA или CDCA. Однако ЕС50 СА была только в 4 раза выше, чем у DCA или CDCA, в отличие от экспериментов с культурой клеток in vitro, где ЕС50 СА была приблизительно в 7~8 раз выше, чем у DCA и CDCA. Более того, ЕС50 HDCA была только в 1,4 раза выше, чем у DCA или CDCA, в отличие от экспериментов с культурой клеток in vitro, где ЕС50 HDCA была приблизительно в 4~5 раз выше, чем у DCA и CDCA.

Из результатов исследования ex vivo предполагают, что показатели активности лизиса у солей желчных кислот не могут быть просто оценены исходя из результатов in vitro. Условия ex vivo более сложные, чем условиях in vitro. Например, структура тканей может влиять на проникновение каждой соли желчных кислот в жировые клетки, и наличие внутренних структур в тканях также может влиять на лизисную активность солей желчных кислот. По сравнению с результатом in vitro, результат ex vivo предполагает, что относительно низкой концентрации СА или HDCA может быть достаточно для лизиса жировых тканей. Однако в 4 раза выше доза СА может быть необходима для получения подобной активности расщепления жира с помощью DCA или CDCA.

На основании результатов ex vivo было высказано предположение, что если СА имел подобную активность лизиса в отношении жировых тканей по сравнению с DCA или CDCA в условиях in vivo или ex vivo, но не в in vitro, побочные эффекты, которые появлялись вследствие повреждения окружающих тканей, могут быть отличными от лечения с помощью DCA или CDCA. Для тестирования этого провели Эксперименты in vivo для изучения активности лизиса в отношении жировой ткани у DCA, CDCA и СА. В отличие от условий in vitro и ex vivo, условия in vivo имеют еще более сложные аспекты и много переменных, таких как распределение, экскреция и метаболизм вводимых лекарственных средств. Растворы солей желчных кислот непосредственно применяли к подкожным жировым тканям мышей с ожирением. Ожирение у мышей индуцировали путем кормления рационом с 60% высокого содержания жиров мышей C57BL/6N. После 12 недель кормления рационом с высоким содержанием жира их вес тела достигал около 50 грамм (фигура 4). В одном эксперименте 1% растворов соли желчных кислот применяли к паховым скоплениям жировых тканей 5 раз в течение 2 недель. По сравнению с мышами, которым инъецировали солевой раствор, мыши, которым инъецировали соли желчных кислот, продемонстрировали слегка сниженный вес тела и содержание подкожного жира. Интересно, что снижение веса тела и содержание жира были подобны у всех трех типов солей желчных кислот (фигура 5А, 5В).

Для того, чтобы убедиться в активности лизиса солей желчных кислот в отношении ткани, наблюдали за местами инъекции в подкожные жировые ткани (фигура 6). В жировых тканях мышей, которым инъецировали солевой раствор, не наблюдали никаких очевидных аномальных поражений. Жировые ткани мышей, которые получали одну из солей желчных кислот (например, DCA, CDCA и СА), демонстрировали желтоватые поражения в участке введения, который представляет собой некротические места воспаления. Влияние солей желчных кислот на гистологию ткани отслеживали при окрашивании Н & Е участка инъекции. Инъекция всех трех солей желчных кислот вызывала значительное нарушение организации жировой ткани, по сравнению со случаем с солевым раствором. В участках инъекции DCA, CDCA и СА наблюдали участки фиброза. Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией считается, что повторное введение соли желчной кислоты может привести к фиброзу тканей из-за рецидивирующего воспаления.

Эти результаты указывают, что все три соли желчных кислот характеризуются липолитическими активностями в живых мышах и эффекты DCA, CDCA и СА in vivo подобны при тех же концентрациях. В отличие от условий in vitro или ex vivo, липолитический эффект от повторного ведения СА совместим с эффектами DCA или CDCA в условиях in vivo.

Несмотря на то, что уменьшение веса тела и жировой массы обусловлено обработкой солью желчной кислоты, считается, что неблагоприятные эффекты от введения солей желчных кислот и обезболивающие процедуры могут также влиять на потерю веса у мышей, обработанных солью желчной кислоты. Для проверки эффектов солей желчных кислот in vivo, непосредственно отслеживали активность лизиса солей желчных кислот в ткани живых мышей (с фигуры 7 по фигуру 9).

Для определения площади некроза жировой ткани, разработали новый экспериментальный способ с применением раствора ТТС. ТТС является окислительно-восстановительным индикатором, который широко используют в биологических экспериментах, который, в частности, указывает область инфаркта после ишемического шока. ТТС ферментативно восстановлен до красного 1,3,5-трифенилформазана в живых тканях вследствие активности различных дегидрогеназ, в то время как он остается белым в площадях некроза. После окрашивания ТТС формировались четкие границы между белыми площадями некроза и красными живыми площадями (фигура 7). Белые площади некроза легко измерить с помощью программы анализа изображения. Этот новый способ предусматривает более точную оценку эффекта некроза ткани химических веществ, таких как соли желчных кислот, и позволят сравнить эффекты лизиса ткани различными материалами.

Различные дозы DCA, CDCA или СА вводили в паховую жировую ткань мышей с ожирением C57BL/6N. После одного дня введения соли желчной кислоты измеряли площади некроза подкожных жиров у инъецированных мышей (фигура 8 и фигура 9). Повышенная концентрация введенных солей желчных кислот вызвала пропорциональное увеличение площадей некроза. DCA и CDCA демонстрировали схожий некроз ткани в таких же дозах, которые отражают данные in vitro и ex vivo. Площади некроза мышей, обработанных СА, были меньше, чем у DCA или CDCA в такой же концентрации. Однако приблизительно в два раза более высокой концентрации СА достаточно для проявления схожих некротических эффектов с DCA и CDCA. Характерные изображения после инъекций DCA, СА, CDCA представлены на фигуре 9.

В совокупности эффект лизиса ткани СА по сравнению с DCA или CDCA отличался в условиях in vitro, ex vivo и in vivo. Как правило, эффекты дозы активных реагентов in vivo можно предположить посредством экспериментов in vitro или ex vivo. Однако, во многих случаях, неожиданные эффекты в органах влияют на реальные биологические активности реагентов. Таким образом, результаты in vitro или ex vivo не так просто интерпретировать в условиях in vivo. Данные in vitro и ex vivo, представленные в данном документе, демонстрируют, что для лизиса тканей необходима доза СА более чем в 4 раза выше по сравнению с DCA или CDCA. Однако данные in vivo демонстрируют, что такая высокая доза СА не требуется для реальных эффектов лизиса жира. Детергентные активности солей желчных кислот представляют собой солюбилизирующий силу липидов или белков. Таким образом, предполагается, что активность лизиса клеток пропорциональна активности детергента. Поскольку, DCA и CDCA характеризуются более сильной детергентной активностью, чем СА, они также проявляют более высокую активность лизиса клеток. Однако активности лизиса клеток солей желчных кислот in vivo не просто представляют детергентную эффективность солей желчных кислот. Этот неожиданный эффект лизиса жира СА позволяет применять СА в качестве активного компонента при инъекции по расщеплению жира, особенно в концентрации, которую не предполагали из результатов in vitro и ex vivo.

Концентрация соли в растворе также может влиять на детергентную активность соли желчных кислот. Исследовали влияние концентрации хлорида натрия на активности лизиса жира солей желчных кислот. Паховые жировые ткани мышей с ожирением, вызванным рационом, инкубировали в различных растворах, содержащих разные концентрации хлорида натрия. Концентрацию каждой соли желчной кислоты доводили до ЕС50 при рН 7,4. Однако обработка различными концентрациями натриевой соли не вносила никаких отличий в активности лизиса жира отдельных солей желчных кислот (фигура 10).

Значение рН растворов детергента может влиять на образование мицелл и детергентную активность. Для исследования эффекта рН солей желчных кислот на активности лизиса жира, паховые жировые ткани мышей с ожирением, вызванным рационом, инкубировали при различных условиях рН (рН 6,0~рН 9,0) DCA, CDCA, HDCA и СА. Значение рН растворов соли желчной кислоты доводили посредством фосфатного буфера. Концентрацию каждой соли желчной кислоты доводили до ЕС50 при рН 7,4. Интересно, что повышенное значение рН раствора значительно снижало активности лизиса жира CDCA, HDCA и СА (фигура 11). В случае DCA наблюдали осаждение DCA в растворах с более низким значением рН. В результате буферы DCA с более высоким значением рН не демонстрировали значительного снижения активности лизиса жира по сравнению со случаями с СА, HDCA или CDCA. Растворы СА и CDCA со значением рН выше 9 в основном утратили их активности лизиса жира. Таким образом, значения рН ниже 9 было необходимо для эффективного лизиса жира с применением растворов СА или CDCA.

Значение рН раствора влияло на стабильность соли желчной кислоты. Проводили эксперименты для исследования стабильности 1% (вес/об.) солей желчных кислот в различных условиях фосфатного буфера (10 мМ; рН 6,5, 6,7, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,3 при 25°С) (фигура 12). При низком значении рН наблюдали осаждение или гелеобразование солей желчных кислот. Водный раствор DCA, CDCA, HDCA, UDCA и СА оставался стабильным при значениях рН ниже чем 8,3, 7,4, 7,4, 7,8 и 7,0, соответственно (таблица 3). Как правило, дискомфорт или боль в месте инъекции были вызваны раствором с более низким или более высоким значением рН, чем нормальное физиологическое значение рН. Поскольку CDCA, HDCA и СА имели стабильные свойства при нормальном значении рН, ожидалось, что их применение в качестве ингредиентов при инъекциях снизит дискомфорт и боль в отличие от применения других солей желчных кислот, таких как DCA и UDCA.

Учитывая, что раствор DCA нестабилен при физиологическом значении рН, состав раствора DCA при инъекции по расщеплению жира должен иметь значение рН выше 8,3. Раствор соли желчных кислот, который характеризуется более высоким рН, проявлял более низкую активность лизиса тканей. Поскольку раствор СА, CDCA, UDCA и HDCA стабильный при низком рН, предполагают, что небольшого количества СА, CDCA, UDCA и HDCA достаточно, чтобы проявить эффект лизиса ткани, подобный к раствору DCA с высоким значением рН. Для исследования этого концентрации, которые показывали аналогичную активность лизиса ткани с 1% раствором DCA при значении рН 8,3, отбирали путем отслеживания площади некроза ткани после инъекции раствора СА (рН 7,0) и CDCA (рН 7,4) при различных концентрациях. Наблюдали, что активность лизиса тканей раствором DCA при значении рН 8,3 была ниже, чем активность препарата DCA при значении рН 7,4. При аналогичном уровне рН (рН 7,4) инъекция приблизительно 2% раствора СА или 1% раствора CDCA проявляла активность лизиса ткани, подобную инъекции 1% DCA. Однако, концентрации 1,5% СА (рН 7,0) или 0,6% CDCA (рН 7,4) было достаточно, чтобы проявить эффект лизиса ткани, подобный 1% DCA с более высоким значением рН (рН 8,3) (фигура 12А). Раствор соли желчных кислот с физиологическим значением рН к низкой концентрацией может предоставить дополнительные преимущества, такие как уменьшение побочных эффектов.

В отличие от CDCA и СА эффект лизиса ткани UDCA или HDCA не увеличивался пропорционально при большей концентрации UDCA или HDCA (фигура 12В и 12С). Интересно, что одноразовая инъекция UDCA или CDCA в подкожный жир вызывала появление желтоватой структуры в месте инъекции (фигура 13А). Окрашивание Н&Е показало инфильтрацию большого количества полиморфно-ядерных (PMN) клеток в месте инъекции (фигура 13В). Желтоватые структуры, как предполагают, приводят к формированию богатых PMN экссудатов (гноя) после инъекции UDCA или HDCA. Инфильтрация PMN клеток и воспаление при инъекции UDCA или HDCA может быть фактором, влияющим на некротическую активность UDCA или HDCA. Наблюдение тяжелого воспаления после инъекции UDCA или HDCA в подкожный жир показывало, что UDCA или HDCA не подходят для использования в качестве ингредиента при инъекции по расщеплению жира.

Соли желчных кислот конъюгировали в печени с таурином или глицином. Исследования показали, что конъюгация таурина или глицина с солями желчных кислот оказывала всевозможные влияние на активность лизиса жировых клеток. Конъюгированными формами глицина или таурина с СА, CDCA и DCA обрабатывали дифференцированные жировые клетки (фигура 14 и фигура 15). Активности лизиса клеток глицином или таурином, конъюгированными с солями желчных кислот, были практически аналогичными неконъюгированным формам солей желчных кислот. Данные результаты показывают, что конъюгация глицина или таурина с солями желчных кислот не оказывает практически никакого влияния на активность лизиса клеток.

Различные аспекты лизиса жира в различных условиях также могут проявляться в других тканях. Несмотря на то, что нет большой разницы в эффектах лизиса жировых клеток в сравнении с эффектами мышечных клеток в условиях in vitro, отдельные показатели активности лизиса тканей могут варьировать в условиях in vivo. Таким образом, если некоторые соли желчных кислот могут приводить к уменьшению активности лизиса кожи или мышц по сравнению с жировыми тканями, могут быть разработаны липолитические реагенты с повышенной безопасностью. Для тестирования этого различные концентрации DCA и СА в растворе с рН 7,4 инъецировали в хвосты мышей и оценивали целостность тканей в хвостах (фигура 16). Поскольку хвосты состоят из жира, мышц и кожи, целостность отдельных слоев ткани можно легко отслеживать одновременно. Жировые слои хвостов разрушались при обеих инъекциях DCA и СА, в отличие от инъекции солевого раствора. Интересно, что повреждение мышц выделяются в хвостах, инъецированных DCA, по сравнению хвостами, инъецированными аналогичной концентрацией СА. Слои кожи мышей, инъецированные DCA или СА, не были существенно повреждены в обоих случаях.

Отек представляет собой один из типичных побочных эффектов, вызванный инъекцией DCA. Тяжесть отека отслеживали по толщине лап крыс после инъекции солей желчных кислот (фигура 17). Состав растворов солей желчных кислот доводили до концентрации и значения рН, которые проявляли подобные эффекты лизиса ткани (фигуры 17А и 17В). Инъекция того же объема PBS не показывал ал а увеличения толщины лапы. Напротив, инъекция солей желчных кислот увеличивала толщину лап крыс. Также активности некроза ткани были подобными во всех композициях солей желчных кислот, тяжесть отека была разной для каждой соли желчных кислот. Лапы с введенным DCA демонстрировали фенотип с наиболее тяжелым отеком. UDCA, HDCA и CDCA демонстрировали слегка меньший симптом после инъекции по сравнению с DCA. Наиболее поразительно то, что опухание, индуцированное инъекцией СА, было очень слабым по сравнению с DCA. Увеличение толщины лапы с применением СА было меньше, чем в половине случаев с DCA. Данные результаты были воспроизведены при лечении растворами солей желчных кислот, характеризующимися одинаковым рН (рН 7,4) (фигуры 17С и 17D). Практически одинаковый результат с предыдущим экспериментом указывает на то, что рН не является фактором, влияющим на отек после инъекции желчных кислот (фигура 17Е).

Далее исследовали неблагоприятный эффект от соли желчных кислот в слое кожи. Различные концентрации солей желчных кислот (доведенные до рН 7,4) и PBS инъецировали под кожу живым мышам и кожу отслеживали на наличие любого наблюдаемого повреждения (фигура 18). В коже мышей, обработанных PBS, не выявляли никаких обнаруживаемых поражений. Лечение с DCA вызвало серьезные повреждения кожи в участках инъекции. Даже лечение при наиболее низкой дозе (0,5%) DCA индуцировало мелкие точечные повреждения на коже. Большие повреждения, эрозии и язвы были найдены на месте инъекций более высокими концентрациями DCA. В отличие от DCA, при инъекции СА образуется значительно меньше повреждений в участке инъекции. Наблюдались только мелкие точечные поражения при более высокой дозе СА (1,5%). При более низких дозах не выявили никаких обнаруживаемых поражений на коже мышей, обработанных СА. Повреждение кожи оценивали по размеру и тяжести поражений, образованных на месте инъекции солями желчных кислот. Даже обработка самой высокой дозой СА (1,5%) продемонстрировала более низкую степень повреждений по сравнению с обработкой самой низкой дозой DCA (0,5%). Данные результаты указывают на то, что обработка СА приводила к значительно уменьшенным побочным эффектам на коже по сравнению с обработкой DCA.

Интересно, что только коммерчески доступный ингредиент при инъекции по расщеплению жира, DCA, продемонстрировал нестабильность при физиологическом значении рН и характеризовался более тяжелыми побочными эффектами после инъекции по сравнению с другими солями желчных кислот. Среди исследованных солей желчных кислот TUDCA не проявлял активностей лизиса клеток при исследовании in vitro, и его исключили из дополнительного анализа. Также, UDCA и CDCA характеризовались слабыми показателями активности лизиса в отношении клеток в исследованиях in vitro и ex vivo, при этом они не смогли продемонстрировать должной активности лизиса тканей при исследованиях in vivo. Данные соединения также продемонстрировали тяжелые воспаления в местах инъекций. В результате, CDCA и СА выбрали в качестве подходящих ингредиентов для инъекции по расщеплению жира среди данных исследованных солей желчных кислот. Краткое описание данных экспериментов представлено в таблице 4.

Результаты, представленные в данном документе, как полагают, являются первым исследованием, в котором оценивали эффективность лизиса жира отдельными солями желчных кислот. Хотя детергентная способность является критическим определителем эффектов лизиса жира солями желчных кислот, разные ответы на дозировку СА в условиях in vitro, ex vivo и in vivo предполагают, что эффекты лизиса у отдельных солей желчных кислот можно модулировать с помощью их окружения. Неожиданно высокая активность лизиса in vivo и уменьшение побочного эффекта в участке инъекции СА способствуют разработке более безопасной инъекции по расщеплению жира.

Результаты представленные в данном документе, показывают, что, при более низких значениях рН, таких, как те, которые использовали в раскрытых в данном документе экспериментах, можно использовать более низкую концентрацию солей желчных кислот, так как более низкое значение рН может усилить активность лизиса клеток солью желчных кислот. Однако применяемое в данных экспериментах низкое значение рН не увеличивало неблагоприятные эффекты состава из соли желчных кислот. Данные результаты показывают, что неблагоприятные эффекты можно отличить от активности лизиса клеток при соответствующем уровне рН. Таким образом, применение более низкой концентрации и более низкого значения рН солей желчных кислот может уменьшать неблагоприятные эффекты без уменьшения активности лизиса клеток. Более того, нейтральное значение рН может уменьшать неблагоприятный эффект, связанный с болью при инъекции.

Раскрытия каждого без исключения патента, патентной заявки и публикации, упомянутых в данном документе, настоящим включены в данный документ посредством ссылки во всей полноте. Не смотря на то, что настоящее изобретение было раскрыто со ссылкой на определенные варианты осуществления, очевидно, что другие варианты осуществления и вариации настоящего изобретения могут быть разработаны другими специалистами в данной области без отступления от истинной сути и объема настоящего изобретения. Прилагаемая формула изобретения предназначена для истолкования как включающая все такие варианты осуществления и эквивалентные варианты.

Похожие патенты RU2662356C1

название год авторы номер документа
ИНЪЕЦИРУЕМАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ УМЕНЬШЕНИЯ ЛОКАЛИЗОВАННОГО ЖИРА БЕЗ БОЛЕВОГО СИНДРОМА, ОТЁКА И ПОБОЧНЫХ ЭФФЕКТОВ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ 2018
  • Ли Ки Тэк
RU2736974C1
ПОЛУЧЕНИЕ ВОДНОГО ПРОЗРАЧНОГО РАСТВОРА ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ С ЖЕЛЧНЫМИ КИСЛОТАМИ 2001
  • Ю Сео Хонг
RU2277913C2
Композиция для применения в лечении состояний, вызванных недостатком кальция 2019
  • Фендрикс Ларс
  • Валлениус Вилле
RU2810711C2
Композиция для предупреждения или лечения нарушений зрения, содержащая урсодезоксихолевую кислоту 2018
  • Сон Хо
  • Ко Хви Чжин
RU2746592C1
Композиция для предупреждения или лечения нарушений зрения, содержащая урсодезоксихолевую кислоту 2018
  • Сон Хо
  • Ко Хви Чжин
RU2723988C1
ЛЕЧЕНИЕ ВНУТРИПЕЧЕНОЧНОГО ХОЛЕСТАЗА И РОДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПЕЧЕНИ 2016
  • Карлсон Фредрик
  • Мёльстам Бо
RU2743405C2
НЕЙРОЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ РАСТВОРИМОЙ УРСОДЕЗОКСИХОЛЕВОЙ КИСЛОТЫ В МОДЕЛЯХ ФОКАЛЬНОЙ ИШЕМИИ 2005
  • Ю Сео Хонг
RU2428987C2
КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ УМЕНЬШЕНИЯ ПОПУЛЯЦИИ Bilophila wadsworthia ИЛИ ИНГИБИРОВАНИЯ ЕЕ РОСТА 2017
  • Соколь, Арри
  • Лянжелла, Филипп
  • Нативида, Джейн
  • Вега, Патрик
  • Ван Хилкама Влиг, Йохан
RU2758969C2
ИНЪЕЦИРУЕМАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ МЕСТНОГО ПРИМЕНЕНИЯ 2020
  • Ким, Дзае Янг
  • Нам, Дзеонг Сун
RU2777316C1
ПРИМЕНЕНИЕ ФОСФОЛИПИД-СОДЕРЖАЩЕЙ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ УДАЛЕНИЯ ПОДКОЖНЫХ СКОПЛЕНИЙ ЖИРА ПОСРЕДСТВОМ ПОДКОЖНОГО ЛИПОЛИЗА 2011
  • Гундерман Карл-Йозеф
  • Брандль Дирк
RU2549966C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 662 356 C1

Реферат патента 2018 года Способы и композиции на основе желчных кислот и их солей для уменьшения количества жира

Изобретение относится к области косметологии и представляет собой состав для нехирургического удаления локализованного жирового отложения у субъекта, при этом состав содержит концентрацию, при которой лизируется жир, одного или нескольких из холата и хенодезоксихолата и имеет значение рН менее 8, где один или несколько из холата и хенодезоксихолата используются в качестве активного ингредиента для лизиса жира. Изобретение обеспечивает уменьшение локализованных жировых накоплений, не требует хирургического вмешательства или продолжительного времени восстановления, имеет меньше неблагоприятных побочных эффектов. 3 н. и 18 з.п. ф-лы, 4 табл., 18 ил.

Формула изобретения RU 2 662 356 C1

1. Состав для нехирургического удаления локализованного жирового отложения у субъекта, при этом состав содержит концентрацию, при которой лизируется жир, одного или нескольких из холата и хенодезоксихолата и имеет значение рН менее 8, где один или несколько из холата и хенодезоксихолата используются в качестве активного ингредиента для лизиса жира.

2. Состав по п. 1 для нехирургического удаления локализованного жирового отложения у субъекта, при этом состав характеризуется значением рН менее 7,5.

3. Состав по п. 1 для нехирургического удаления локализованного жирового отложения у субъекта, при этом состав характеризуется концентрацией от 0,5% до 4,0%.

4. Состав по п. 1 для нехирургического удаления локализованного жирового отложения у субъекта, при этом состав характеризуется концентрацией от 0,5% до 2,0%.

5. Состав по п. 1, дополнительно содержащий по меньшей мере один дополнительный активный ингредиент, выбранный из группы, состоящей из противовоспалительного средства, аналгетика, диспергирующего средства, вещества, способствующего проникновению, и их комбинации.

6. Состав по п. 1, дополнительно содержащий терапевтическое средство, выбранное из группы, состоящей из противомикробного средства, антитромботического средства, антикоагулянта, подавителя образования пены, противовоспалительного средства, анестетика, аналгетика, стероида, транквилизатора, антидиспергирующего средства, миорелаксанта и любой их комбинации.

7. Состав по п. 1, где состав представлен в виде инъекционного состава.

8. Состав по п. 1, где состав представлен в виде состава для инъекции по расщеплению жира.

9. Способ нехирургического удаления локализованных жировых отложений у субъекта, имеющего локализованные жировые накопления, включающий введение состава по п. 1.

10. Способ по п. 9, где состав дополнительно содержит дополнительный активный ингредиент, выбранный из группы, состоящей из противовоспалительного средства, аналгетика, диспергирующего средства, вещества, способствующего проникновению, и их комбинации.

11. Способ по п. 9, где состав дополнительно содержит терапевтическое средство, выбранное из группы, состоящей из противомикробного средства, антитромботического средства, антикоагулянта, подавителя образования пены, противовоспалительного средства, анестетика, аналгетика, стероида, транквилизатора, антидиспергирующего средства, миорелаксанта и их комбинации.

12. Способ по п. 9, где стадия введения включает подкожную инъекцию.

13. Способ по п. 9, где локализованное жировое накопление выбрано из группы, состоящей из грыжи жировой клетчатки нижнего века, липом, липодистрофии, жировых отложений, связанных с целлюлитом, и их комбинации.

14. Способ по п. 9, где жировое отложение локализовано в участке тела субъекта, выбранном из группы, состоящей из участка под глазом, под подбородком, под рукой, ягодицы, голени, спины, бедра, лодыжки, живота и их комбинации.

15. Способ по п. 9, где состав представлен в виде инъекционного состава.

16. Способ по п. 9, где состав представлен в виде состава для инъекции по расщеплению жира.

17. Набор для нехирургического удаления локализованного жирового отложения, содержащий (а) первый контейнер, содержащий состав по п. 1; и (b) письменные инструкции по применению состава для уменьшения жирового отложения у субъекта без применения хирургического вмешательства.

18. Набор по п. 17, где состав представлен в виде инъекционного состава.

19. Набор по п. 17, где состав представлен в виде состава для инъекции по расщеплению жира.

20. Набор по п. 17, где первый контейнер содержит терапевтическое средство, выбранное из группы, состоящей из противомикробного средства, антитромботического средства, антикоагулянта, подавителя образования пены, противовоспалительного средства, анестетика, аналгетика, стероида, транквилизатора, антидиспергирующего средства, миорелаксанта и их комбинации.

21. Набор по п. 17, дополнительно содержащий второй контейнер, где второй контейнер содержит второе терапевтическое средство, выбранное из группы, состоящей из противомикробного средства, антитромботического средства, антикоагулянта, подавителя образования пены, противовоспалительного средства, анестетика, аналгетика, стероида, транквилизатора, антидиспергирующего средства, миорелаксанта и их комбинации.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2018 года RU2662356C1

СПОСОБ КОНТРОЛЯ ГЕРМЕТИЧНОСТИ ШАРОВОГО КРАНА ЗАПОРНО-РЕГУЛИРУЮЩЕЙ АРМАТУРЫ МАГИСТРАЛЬНОГО ТРУБОПРОВОДА И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО РЕАЛИЗАЦИИ (ВАРИАНТЫ) 2010
  • Аксютин Олег Евгеньевич
  • Власов Сергей Викторович
  • Горяев Юрий Анатольевич
  • Егурцов Сергей Алексеевич
  • Митрохин Михаил Юрьевич
  • Пиксайкин Роман Владимирович
  • Проскуряков Александр Михайлович
  • Степаненко Олеся Александровна
RU2422789C1
И.Г.Герасимов "Влияние ионов натрия и калия на активность ионов водорода в буферных системах", Вiсник Донецького Нацiонального Унiверситету, Сер
А: Природничі науки, 2010, вип
Печь для непрерывного получения сернистого натрия 1921
  • Настюков А.М.
  • Настюков К.И.
SU1A1
Переносный кухонный очаг 1919
  • Вейсбрут Н.Г.
SU180A1
WO 2011135020 A1, 03.11.2011
WO2005112942 A1, 01.12.2005
Н.Г
Лапина и др
"Мехотерапия в коррекции локальных жировых отложений и целлюлита", Вестник Эстетической Медицины, 2009, том 8, N4, стр.65-67.

RU 2 662 356 C1

Авторы

Джун Хён Хо

Ян Ги Хёк

Ли Джунхо

Чо Суджин

Даты

2018-07-25Публикация

2015-06-26Подача