КАЛИЕВАЯ СОЛЬ КАРБОКСИМЕТИЛОВОГО ЭФИРА 3-ОКСИ-УРСАН-12-ЕН-28-ОВОЙ КИСЛОТЫ, ОБЛАДАЮЩАЯ ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОЙ, АНТИОКСИДАНТНОЙ И ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2011 года по МПК C07J63/00 C07J53/00 A61P29/00 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, конкретно к новому химическому соединению - калиевой соли карбоксиметилового эфира 3-окси-урсан-12-ен-28-овой кислоты (по номенклатуре IUPAC - калиевая соль 2-((1S,2R,4aS,6aS,6bR,10S,12aR,12bR,14bS)-10-гидрокси-1,2,6a,6b,9,9,12а-гептаметил-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-эйкозагидропицен-4а-карбонилокси) уксусной кислоты) формулы I

обладающему гепатопротекторной, антиоксидантной и противовоспалительной активностью, что сделает возможным его использование в медицине в качестве фармацевтического средства.

Большинство современных гепатопротекторных препаратов производятся из растительного сырья. Лекарственные формы представлены либо суммарными водно-спиртовыми и сухими экстрактами соответствующих растений, либо извлечениями близких по свойствам компонентов экстракта. Примером являются препараты легалон, силибор, катерген, валилив, фламин, флакумин. Действующим началом препаратов этой группы являются в основном флавоноиды, такие как рутин, кверцетин [М.Д.Машковский. Лекарственные средства. В двух томах. Изд. «Новая волна», Москва, 1996, т.1, с.603., Лекарственные препараты, разрешенные к применению в СССР. Под ред. М.А.Клюева, Э.А.Бабаяна. М., «Медицина», 1979, с.61-65], дигидрокверцетин [М.Б.Плотников, Н.А.Тюкавкина, Т.М.Плотникова. Лекарственные препараты на основе диквертина. Томск. Изд. Томского университета. 2005, 228 с, В.В.Кугач, Н.И.Никульшина, В.И. Ищенко. Лекарственные формы флаваноидов. (Обзор). Химико-фармацевтический журнал. 1988, №8, с.1018-1025]. Основное побочное действие препаратов на основе флавоноидов связано с их влиянием на желудочно-кишечный тракт, проявляющееся в основном в виде тошноты, изжоги, диспепсии, иногда рвоты [М.Д.Машковский. Лекарственные средства. В двух томах. Изд. «Новая волна», Москва, 1996, т.1, с.603. Лекарственные препараты, разрешенные к применению в СССР. Под ред. М.А.Клюева, Э.А.Бабаяна. М., «Медицина», 1979, с.61-65].

Дигидрокверцетин является основным биофлавоноидом (содержание 90% и выше) препарата диквертин, который производится из отходов переработки древесины лиственницы [патент RU №2088256. «Средство для комплексной терапии заболеваний диквертин и способ его получения» Опубл. 02.12.1996, Открытия. Изобретения. 1997, №24]. Дигидрокверцетин обладает антиоксидантным, противовоспалительным, капилляропротективным, гастро- и гепатопротекторным свойствами [В.К.Колхир, Н.А.Тюкавкина, В.А.Быков. Новое антиоксидантное средство «Диквертин», Практическая фитотерапия. 1997, №1. С.12-16]. Указанные эффекты обеспечивают этому соединению статус базовой "субстанции для создания на ее основе комбинированных препаратов, расширяющих спектр его биологической активности [М.Б. Плотников, Н.А.Тюкавкина, Т.М.Плотникова. Лекарственные препараты на основе диквертина. Томск. Изд. Томского университета. 2005, 228 с, В.В.Кугач, Н.И.Никульшина, В.И.Ищенко. Лекарственные формы флаваноидов. (Обзор). Химико-фармацевтический журнал. 1988, №8, с.1018-1025].

Другим потенциально ценным для медицины соединением, выделяемым из растительного сырья, является урсоловая кислота. Установлено, что она проявляет гепатопротекторную, противовоспалительную, антиоксидантную и противоопухолевую активность [Liu Jie. Pharmacology of oleanolic acid and ursolic acid, J. of Ethnopharmacology. 1995. V.49, Issues 2-1, pp.57-68., R.Saravanam, P.Viswanathan, R.Viswanathan Pugalendi. Protective effect of ursolic acid on ethanol-mediated experimental liver damage in rats, Life Sciences. 2006. V.78. Issue 7, pp.713-719].

Указанные свойства свидетельствуют о ее высокой перспективности как базового продукта для получения производных с высокой биологической активностью.

Урсоловая кислота относится к растительным метаболитам и содержится в разнообразных растительных источниках. Урсоловая кислота высокой чистоты может быть легко получена из доступного отечественного сырья - отходов производства соков - шротов клюквы [патент RU №181636, С.А.Шевцов, В.А.Ралдугин, Г.И.Щукин Способ получения урсоловой кислоты. Опубл. 27.09.1995] и черноплодной рябины [патент RU №2329048, Л.П.Козлова, Е.В.Малыхин, С.М.Обут, С.А.Попов, О.П.Шеремет. Способ получения урсоловой кислоты. Опубл. 20.07.2008].

Недостатком этого соединения, ограничивающим его использование в медицинских препаратах, является низкая растворимость в полярных и неполярных растворителях. Данное свойство может проявляться в виде невысокой биодоступности, что обычно требует повышения дозировок.

Задачей изобретения является создание на основе урсоловой кислоты гепатопротектора с антиоксидантной и противовоспалительной активностью, характеризующегося более высокой растворимостью в воде по сравнению с урсоловой кислотой и получаемого из возобновляемого отечественного сырья.

Решение поставленной задачи достигается созданием соединения формулы I, представляющего собой калиевую соль карбоксиметилового эфира 3-окси-урсан-12-ен-28-овой кислоты, обладающего повышенной растворимостью в воде и проявляющего гепатопротекторную, антиоксидантную и противовоспалительную активность. В настоящее время лекарственных препаратов на основе этого соединения на рынке не представлено.

Преимуществом производных оксиуксусной кислоты, к которым относится соединение I, является то, что они являются более сильными кислотами по сравнению с урсоловой и образуют стабильные соли, которые не гидролизуются в водных растворах. Благодаря этому свойству соединение I обладает более высокой растворимостью по сравнению с урсоловой кислотой и ее солями. Показано, что соли урсоловой кислоты, являющейся слабой кислотой, в водной среде неустойчивы и легко гидролизуются, при этом из растворов выпадает свободная урсоловая кислота [Н.М.Sell, R.Е.Kremers, Metallic Salts of Ursolic Acid, bid. Eng. Chem. Anal. Ed., 1935, 7 (2), p.105-106].

Аналогом заявляемого соединения по антиоксидантному и гепатопротекторному действию является дигидрокверцетин [(2R,3R)-3,5,7,3',4'-пентагидроксифлаванон] формулы (II)

Прототипом и аналогом заявляемого соединения по структуре и биологическим свойствам является пентациклическое тритерпеновое соединение - урсоловая кислота III

Соединением сравнения по противовоспалительным свойствам является нестероидный противовоспалительный препарат индометацин (субстанция "Fluka" BioChemika).

Соединение I получают следующим образом: урсоловую кислоту III алкилируют этилхлорацетатом в диметилформамиде в присутствии карбоната калия, при этом получают этиловый эфир IV, который отделяют фильтрацией после выливания реакционной смеси в воду. Этиловый эфир IV без высушивания обрабатывают раствором спиртового раствора KOH при кипячении, при этом происходит селективный гидролиз карбоксиэтильного фрагмента, после чего калиевую соль I отделяют кристаллизацией (см. чертеж).

Биологическая активность соединения I изучалась путем определения гепатопротекторных, антиоксидантных и противовоспалительных свойств на беспородных мышах. В качестве препаратов сравнения использовали антиоксидант дигидрокверцетин (II) (99,9% чистоты) и нестероидный противовоспалительный препарат индометацин (субстанция «Fluka» BioChemika). Структурным аналогом изучаемого соединения являлась урсоловая кислота.

Для исследования гепатопротекторного и антиоксидантного эффектов была использована стандартная экспериментальная модель токсического CCl₄ гепатита у мышей. Модель воспроизводилась согласно методическим рекомендациям [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Москва. Изд-во ОАО Медицина. 2005, 240 с.]. Токсический гепатит моделировали путем внутрижелудочного введения мышам 25% раствора CCl₄ в растительном масле. Соединение I вводили в желудок в дозе 20 мг/кг в виде водно-твиновой взвеси за 1 час до гепатотоксина. Референсное соединение - дигидрокверцетин (ДКВ) - вводили аналогичным образом в дозе 50 мг/кг. Гепатопротекторный эффект определяли по снижению в сыворотке крови маркеров цитолиза и холестаза - аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT) и щелочной фосфатазы (ЩФ), антиоксидантные свойства оценивали по уменьшению концентрации продуктов перекисного окисления (ТБКРС), определяемых по реакции с тиобарбитуровой кислотой [Камышников B.C. Справочник по клинико-химической лабораторной диагностике, Минск: Беларусь, 2000, Т. 2, с.207].

Пробы сыворотки крови отбирали через сутки после введения агентов. Анализ биохимических показателей проводили с использованием стандартных наборов реактивов («Ольвекс диагностикум», Германия) на биохимическом анализаторе (Фотометр 5010, Германия).

Установлено, что соединение I при внутрижелудочном введении в дозе 20 мг/кг обладает выраженным гепатопротекторным действием, снижая в 2,5-3,5 раза выраженность цитолитических процессов и в 1,6 раза тяжесть холестаза на фоне токсического гепатита. Показано, что по величине антицитолитического и антихолестазнго эффекта соединение I превосходит свой структурный аналог и эталонный препарат (табл.1).

Показано, что соединение I оказывает достоверное антиоксидантное действие, снижая в 1,4 раза концентрацию ТБКРС в крови относительно контроля, при этом по величине антиоксидантного эффекта заявленное соединение не уступает референсным агентам (табл.2).

Противовоспалительную активность производного урсоловой кислоты исследовали на стандартной модели воспаления, вызываемого гистамином [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Москва. Изд-во ОАО Медицина. 2005, 240 с.]. Соединение I и его структурный аналог вводили внутрижелудочно в дозе 20 мг/кг за 1 час до субплантарного введения флогогена. Препарат сравнения индометацин вводили тем же способом в эффективной дозе 20 мг/кг. Противовоспалительный эффект оценивали по уменьшению по сравнению с контролем индекса отека, который рассчитывали в процентах как отношение разности здоровой и воспаленной лапы к массе здоровой. Показано, что соединение I снижает выраженность отека лапы мышей в 1,8 раз. По величине противовоспалительного эффекта заявленное соединение не уступало урсоловой кислоте, но было в 1,2 раза менее эффективным, чем эталонный препарат индометацин (табл.3).

Таким образом, новое соединение - калиевая соль карбоксиметилового эфира 3-окси-урсан-12-ен-28-овой кислоты (I) - обладает следующими преимуществами, а именно:

- более высоким гепатопротекторным эффектом по сравнению с урсоловой кислотой и дигидрокверцетином;

- антиоксидантной активностью аналогичной дигидрокверцетину;

- противоспалительной активностью, не уступающей таковой урсоловой кислоты;

- более высокой растворимостью в воде, чем урсоловая кислота;

- использованием в синтезе доступной урсоловой кислоты, получаемой из отходов пищевой промышленности.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение калиевой соли карбоксиметилового эфира 3-окси-урсан-12-ен-28-овой кислоты (I)

К суспензии урсоловой кислоты (0.92 г, 2 ммоль) в ДМФА (10 мл) добавляют измельченный K₂CO₃ (0.45 г, 3.3 ммоль) и этил 2-хлорацетат (0.25 г, 2 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре 4 час. Реакционную смесь выливают в воду 30 мл и отфильтровают.

Сырой осадок без высушивания помещают в раствор KOH (0.4 г, 7.2 ммоль) в этаноле (10 мл). Смесь кипятят в течение 1 часа и охлаждают до комнатной температуры, выпавшие кристаллы отделяют фильтрованием и промывают охлажденным этиловым спиртом (+5°C, 5 мл), высушивают на воздухе и получают калиевую соль I 0,97 г (94%) в виде игольчатых кристаллов. Т пл.>300°C (разл.)

Спектры ЯМР снимают для свободной кислоты V. Для получения кислоты V обрабатывают калиевую соль I разбавленной серной кислотой, промывают водой и сушат на воздухе:

Спектр ЯМР H¹ соединения V (Py-d₅, 300 MHz, δ_С м.д.): 0.83 s (3H), 0.90 s (3H), 0.91 s (3Н), 0.92 m (3Н), 1.00 s (3Н), 1.15 s (3Н), 1.21 s (3Н), 2.49 d (1H, J=l 1.0 Hz), 3.41 m (1H), 4.92 d (1H, J=15.5 Hz), 5.03 d (1 H, J=15.5 Hz), 5.3 m (1 H).

Спектр ЯМР С¹³ соединения V (Py-d₅, 75 MHz, δ_C м.д.): 174.78, 168.87, 136.47, 123.90, 76.00, 59.26, 53.67, 51.14, 46.24, 45.86, 40.25, 37.82, 37.22, 37.19, 37.02, 36.99, 35.12, 34.87, 31.33, 28.77, 26.67, 26.31, 25.92, 22.54, 21.68, 21.49, 19.16, 16.63, 15.24, 15.20, 14.44, 13.60.

Пример 2. Изучение растворимости калиевой соли I и кислоты V в сравнении с растворимостью урсоловой кислоты III и ее калиевой соли

Растворимость кислот и их солей в этаноле изучают весовым методом для насыщенных растворов. Растворимость кислот и их солей в воде изучают с использованием спектров УФ-поглощения для насыщенных растворов.

Таблица 1 Растворимость урсоловой кислоты, карбоксиметилового эфира 3-окси-урсан-12-ен-28-овой кислоты и их калиевых солей Растворитель Урсоловая кислота III K соль урсоловой кислоты Кислота V K соль (I) этанол 10±1 г/л - 65±10 г/л 35±5 г/л вода 6±2 мг/л 70±15 мг/л 90±15 мг/л 120±20 мг/л

Из данных, представленных в табл. 1, видно, что растворимость кислоты V и ее соли I в этаноле значительно превышает таковую для урсоловой кислоты. Растворимость кислоты V и ее соли I в воде также превосходят соответствующие значения для урсоловой кислоты и ее калиевой соли.

Более высокая растворимость К соли I в воде по сравнению со свободной кислотой V, возможно, может обеспечивать повышение биодоступности соединения I.

Пример 3. Исследование гепатопротекторных свойств на модели острого токсического гепатита

Острый токсический гепатит вызывали у беспородных самцов мышей массой 20-25 г путем однократного внутрижелудочного введения 25% раствора CCl₄ в подсолнечном масле из расчета по 0,1 мл на 10 г массы тела [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Москва. Изд-во ОАО Медицина. 2005, 240 с.]. Соединение I и урсоловую кислоту вводили за 1 час до воспроизведения гепатита внутрижелудочно в виде взвеси в дистиллированной воде с добавлением эмульгатора Tween-80 в дозе 20 мг/кг (в объеме 0,2 мл на 10 г массы животного). Дигидрокверцетин вводили тем же способом в эффективной дозе 50 мг/кг. Контрольным животным вводили водно-твиновую взвесь в эквивалентном объеме. В каждой группе было по 9-10 особей.

Через сутки животных забивали декапитацией под легким эфирным наркозом и определяли в сыворотке крови мышей активность АЛТ, ACT и щелочной фосфатазы с помощью стандартных наборов реактивов («Ольвекс диагностикум»).

Результаты обрабатывали статистически с помощью пакета программ «STATISTIKA 6».

Установлено, что соединение I в условиях токсического гепатита оказывает достоверный антицитолитический эффект, снижая активность АЛТ и ACT в крови соответственно в 3,6 и 2,4 раза по сравнению с контролем. Аналогичные эффекты у референсных агентов были выражены в меньшей степени: урсоловая кислота уменьшила активность АЛТ и ACT в 2,8 и 1,7 раза против контроля, а дигидрокверцетин - соответственно в 2,9 и 1,5 раза. Показано, что соединение I проявило значимый антихолестазный эффект, понизив в 1,6 раза уровень ЩФ в крови. Урсоловая кислота снижала данный показатель в 1,2 раза по сравнению с контролем. Дигидрокверцетин не проявил антихолестазного действия, достоверно повысив уровень ЩФ относительно контроля. Таким образом, соединение I обладает выраженным гепатопротекторным действием, превосходя свой структурный аналог и эталонный препарат по антицитолитическому и антихолестазному (табл.1).

Таблица 2 Влияние соединения I на биохимические показатели сыворотки крови мышей с индуцированным CCl₄ гепатитом   Контроль Соединение I УК ДКВ АЛТ, Ед/л 159,3±20,4 43,8±11,1*** 57,1±0,2*** 54,3±10,9*** ACT, Ед/л 121,5±11,1 51,3±11,3** 71,1±13,5* 80,9±11,1* ЩФ, Ед/л 530,3±47,4 326,8±25,7** 442,6±55,8 735,9±66,7* *Р<0,05; **Р<0,01; ***Р<0,001 - различия с контролем достоверны К - контроль, УК - урсоловая кислота, ДКВ - дигидрокверцетин, АЛТ, ACT - аланин-, аспартатаминотрансфераза, ЩФ - щелочная фосфатаза.

Таким образом, показано, что соединение I при внутрижелудочном введении в дозе 20 мг/кг обладает выраженным гепатопротекторным действием, снижая в 2,5-3,5 раза выраженность цитолитических процессов и в 1,6 раза тяжесть холестаза на фоне токсического гепатита.

Пример 4. Исследование антиоксидантных свойств на модели острого токсического гепатита

Определение антиоксидантного эффекта соединения I проводили на модели токсического CCl₄ гепатита, описанной выше. Влияние агентов на выраженность процессов перекисного окисления липидов оценивали по уровню ТБК-реактивных соединений (ТБАРС) в сыворотке крови, которые являются вторичными продуктами перекисного окисления. Соединение I и агенты сравнения вводили за 1 час до воспроизведения гепатита внутрижелудочно в виде взвеси в дистиллированной воде с добавлением эмульгатора Tween-80 в дозе 20 мг/кг (в объеме 0,2 мл на 10 г массы животного). Введенные дозы составили: для урсоловой кислоты и соединения 1-20 мг/кг; для дигидрокверцетина - 50 мг/кг. Контрольным животным вводили водно-твиновую взвесь в эквивалентном объеме. В каждой группе было по 9-10 особей. Через сутки животных забивали декапитацией под легким эфирным наркозом и определяли концентрацию ТБАРС в сыворотке крови мышей общепринятым методом [Камышников B.C. Справочник по клинико-химической лабораторной диагностике, Минск: Беларусь, 2000, Т.2, с.207].

Результаты обрабатывали статистически с помощью пакета программ «STATISTIKA 6». Различия считали достоверными с вероятностью p<0,05.

Установлено, что соединение I оказывало достоверное антиоксидантное действие, снижая в 1,4 раза концентрацию ТБКРС в крови относительно контроля, урсоловая кислота и дигидрокверцетин практически одинаково (в 1,3 раза) уменьшали данный показатель, однако эффект урсоловой кислоты не был достоверным (табл.2). Таким образом, соединение I по антиоксидантным свойствам не уступало референсным агентам.

Таблица 3 Влияние соединения I на уровень ТБК-реактивных соединений в сыворотке крови Группа Контроль Соединение I УК ДКВ ТБКРС, мкмоль/л 4,9±0,5 3,6±0,2* 3,8±0,3 3,7±0,3* *Р<0,05; **Р<0,01 - различия с контролем достоверны ^#Р<0,05 различия с ДКВ достоверны К - контроль, УК - урсоловая кислота, ДКВ - дигидрокверцетин, ТБКРС - ТБК реактивные соединения.

Пример 5. Исследование противовоспалительных свойств соединения I на модели гистаминового воспаления.

Эксперименты проводили на беспородных мышах самцах массой 20-25 г. Животных делили на группы по 8 особей. Соединение I вводили внутрижелудочно в виде взвеси в дистиллированной воде с добавлением эмульгатора Tween-80 в дозе 20 мг/кг (в объеме 0,2 мл на 10 г массы животного). Отдельным группам мышей аналогично вводили структурный аналог урсоловую кислоту в дозе 20 мг/кг, а также эталонный противовоспалительный препарат индометацин в эффективной дозе 20 мг/кг. Контрольные животные получали эквивалентное количество водно-твиновой эмульсии. Через 1 час после введения агентов всем мышам субпланарно в заднюю лапу введен 0,5% водный раствор гистамина по 0,05 мл/мышь. Через 5 часов после введения флогогена мышей умерщвляли путем цервикальной дислокации позвоночника, отсекали обе задние лапы, определяли массу каждой. Противовоспалительный эффект оценивали по величине индекса воспаления, который определяли как отношение разности масс воспаленной и интактной лап к массе интактной, выраженное в процентах. Результаты обрабатывали статистически с помощью пакета программ «STATISTIKA 6». Различия считали достоверными с вероятностью р<0,05.

Данные эсперимента приведены в табл. 3. Показано, что соединение I снижало выраженность отека лапы мышей так же, как и урсоловая кислота (в 1,8 раза), тогда как индометацин уменьшил отек в 2,1 раза. Таким образом, в условиях воспаления, вызванного гистамином, соединение I не уступало по противовоспалительному эффекту своему структурному аналогу, но было в 1,2 раза менее эффективным, чем эталонный препарат индометацин.

Таблица 4 Влияние агентов на величину индекса гистаминового отека Группа Контроль Соединение I УК Индометацин Индекс отека, % 29,57±3,11# 16,94±1,06** 16,82±3,00* 13,83±1,55** *p<0,05; **p<0,01- различия с контролем достоверны; ^#p<0,05 различия с индометацином достоверны.

Таким образом, установлено, что соединение I по противовоспалительной активности не уступает урсоловой кислоте.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, конкретно к калиевой соли карбоксиметилового эфира 3-окси-урсан-12-ен-28-овой кислоты формулы I

Соединение обладает выраженной гепатопротекторной, антиоксидантной активностью и противовоспалительными свойствами, а также более высокой растворимостью в сравнении с урсоловой кислотой, что позволит использовать его в медицине в качестве гепатопротектора комплексного действия. Способ получения основан на превращениях урсоловой кислоты, получаемой из отходов от производства сока. 4 табл., 1 ил.

Калиевая соль карбоксиметилового эфира 3-окси-урсан-12-ен-28-овой кислоты формулы I

обладающая гепатопротекторной, антиоксидантной и противовоспалительной активностью.