16-{2-БЕНЗОИЛАМИНО-2-[(3,5-ДИ-ТРЕТ-БУТИЛ-4-ГИДРОКСИФЕНИЛ)-АЛКИЛКАРБАМОИЛ]ВИНИЛ}-ЛАБДАТРИЕНЫ С АНТИОКСИДАНТНЫМИ, ГЕПАТОПРОТЕКТОРНЫМИ И ГЕМОСТИМУЛИРУЮЩИМИ СВОЙСТВАМИ Российский патент 2009 года по МПК C07D307/52 A61K31/341 A61P1/16 

Изобретение относится к новым химическим соединениям, конкретно к 16-{2-бензоиламино-2-[(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-алкилкарбамоил]винил}-лабдатриенам формулы (I)

обладающим антиоксидантной, гепатопротекторной и гемостимулирующей активностью.

Указанные свойства позволяют предполагать возможность использования соединений в медицине в качестве фармацевтических препаратов.

В медицинской практике используются антиоксиданты группы экранированных фенолов. Например, препарат дибунол (2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол) применяется для лечения рака и папилломатоза мочевого пузыря, циститов, ожогов, трофических и лучевых язв [1].

Препарат пробукол [4,4'-(изопропилидендитио)-бис-(2,6-ди-трет-бутил)фенол] назначается как гиполипидемическое средство при гиперхолестеринемии с риском развития ишемической болезни сердца [2]. Таким образом, производные 2,6-ди-трет-бутилфенола могут служить лекарственными средствами различной направленности, что делает перспективным синтез и фармакологическое изучение веществ, включающих названный структурный фрагмент.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является разработка антиоксидантов фенольного типа с дополнительными свойствами на основе доступного растительного лабданоида ламбертиановой кислоты. Важным элементом поставленной задачи служит получение антиоксиданта нового структурного типа, способного снижать побочные токсические эффекты цитостатических препаратов, к которым обычно относятся гемо- и миелодепрессия, иммунологические расстройства, функциональные и морфологические повреждения различных органов и т.д.

Интерес к разработке таких агентов на основе растительного сырья значительно возрос в новом столетии в связи необходимостью их включения в комплексную химиотерапию опухолей. Ассортимент подобных препаратов-корректоров химиотерапевтических средств в настоящее время недостаточно широк. В основном применяются препараты в виде сложных смесей экстрактивных веществ [3], которые имеют определенные недостатки, связанные с индивидуальной непереносимостью и аллергическими эффектами.

Анализ литературных данных показывает, что синтез новых соединений из растительного сырья с целью расширения ассортимента нетоксичных антиоксидантов с дополнительными (помимо антиоксидантной активности) протекторными свойствами, является актуальной задачей.

Поставленная задача решается новыми химическими соединениями 16-{2-бензоиламино-2-[(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-алкилкарбамоил] винил}-лабдатриенами формулы (I), а именно, (Z)-метил-16-{2-бензоиламино-2-[2-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-этилкарбамоил]-винил}-15,16-эпокси-8(17), 13 (16), 14-лабдатриен-18-оатом (Ia) или (Z)-метил-16-{2-бензоиламино-2-[3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-пропилкарбамоил]-винил}-15,16-эпокси-8(17), 13(16), 14-лабдатриен-18-оатом (Iб), проявляющими выраженные антиоксидантные, гепатопротекторные и гемостимулирующие свойства и пригодными для коррекции токсических эффектов цитостатической полихимиотерапии.

Аналогом по свойствам заявляемых соединений является дигидрокверцетин [(2R,3R)-3,5,7,3',4'-пентагидроксифлаванон] формулы (II).

Дигидрокверцетин является основным биофлавоноидом (90% и выше) препарата диквертин, производство которого из древесины лиственницы налажено в последние годы. Дигидрокверцетин обладает антирадикальной и антиоксидантной активностью, противовоспалительными, капилляропротективными, гастро- и гепатопротекторными свойствами [4]. Указанные эффекты обеспечивают этому соединению статус базовой субстанции для создания на ее основе средств, обладающих новыми фармакологическими свойствами. К основным недостаткам комплексных препаратов, в составе которых используется дигидрокверцетин, является развитие побочных эффектов в желудочно-кишечном тракте, например тошноты, изжоги [5].

Аналогом по структуре указанных соединений является 16-аминометилпроизводное ламбертиановой кислоты, формулы (III), обладающее ноотропной активностью [6].

Способ получения соединений (I), содержащих в структуре лабданоидный остов, соединенный с фрагментами пространственно затрудненных фенолов, реализуется по приведенной схеме 1. Формилирование метилового эфира ламбертиановой кислоты (IV) приводит к 16-формилпроизводному (V) [7], выделяемому кристаллизацией. Взаимодействие альдегида (V) с бензоилглицином (гиппуровой кислотой) приводит к образованию лабданоидного 5(4Н)-оксазолона (VI). Соединение (VI) образуется с выходом до 76% в виде индивидуального изомера с (Z)-конфигурацией двойной связи. Взаимодействие азлактона (VI) с 3,5-ди-третбутил-4-гидроксифенилэтил(пропил)-аминами (VIIa,б) гладко приводит к соответствующим 4-замещенным карбамоилвинилбензамидам (Iа, б) (выход 76-91%). Достоинством изобретения является способ получения соединений (Iа, б) путем химической модификации доступного растительного метаболита кедра сибирского Pinus sibirica R. Mayr. - метилового эфира ламбертиановой кислоты (IV). Последний легко выделяется из лесопромышленного продукта - кедровой живицы или из хвои кедра, являющейся многотоннажным отходом лесосеки [8]. Физико-химические константы новых, впервые полученных соединений, приведены в примерах 1, 2.

Биологическая активность соединений (Iа, б) изучалась путем определения токсичности, гепатопротекторных свойств на модели токсического гепатита, антиоксидантной и гемостимулирующей активности - на модели токсического поражения крыс, вызванного циклофосфаном. В качестве препарата сравнения использовали антиоксидант дигидрокверцетин (II).

Острую токсичность определяли на беспородных мышах массой 18-23 г при однократном внутрижелудочном способе введения. Параметры токсичности рассчитывали по методу Кербера. Установлено, что LD₅₀ соединений (Iа, б) превышает максимально возможную для разового введения дозу 1000 мг/кг.

Для исследования антиоксидантного и гепатопротекторного эффектов была использована стандартная экспериментальная модель токсического CCl₄ гепатита у мышей. Модель воспроизводилась согласно методическим рекомендациям [9]. Раствор CCl₄ в растительном масле (25%) вводился внутрижелудочно мышам самцам. Соединения (Iа, б) вводили в желудок в дозе 100 мг/кг в виде водно-твиновой взвеси за 1 час до гепатотоксина. Референсное соединение - дигидрокверцетин (ДКВ) - вводили аналогичным образом. Через сутки в сыворотке крови мышей определяли активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), щелочной фосфатазы (ЩФ) и концентрацию малонового диальдегида (МДА) общепринятыми методами [10]. Установлено, что соединения (Iа) и (Iб) при внутрижелудочном введении в дозе 100 мг/кг обладают гепатопротекторным действием, снижая выраженность цитолитических и холестатических процессов на фоне токсического гепатита. Агент (Iа) снижает активность трансаминаз в крови в 1,3, агент (Iб) - в 1,7-1,9 раз по сравнению с контролем. Оба агента не уступают дигидрокверцетину по влиянию на уровень АЛТ, при этом агент (Iб) превосходит референс-соединение в 1,7 раз по влиянию на активность ACT. По величине антихолестазного эффекта соединение (Iа) не уступает, а соединение (Iб) в 1,5 раза превосходит ДКВ.

Изучение гепатопротекторного, антиоксидантного и гемостимулирующего действия соединений (Iа, б) в условиях поражения циклофосфаном (ЦФ) изучали на крысах самках Вистар. ЦФ вводился однократно внутрибрюшинно в дозе 125 мг/кг в растворе 0,9% NaCl всем животным. Соединения (Iа, б) вводились в виде водно-твиновой взвеси двум группам крыс (по 10 шт.) в желудок в дозе 50 мг/кг в течение трех дней после введения ЦФ. Референсное соединение - дигидрокверцетин (ДКВ) - вводили в той же дозе аналогичным образом отдельной группе крыс (10 шт.). Контрольной группе вводили только циклофосфан (10 шт.). В конце опыта определяли состав периферической крови и лейкоцитарную формулу. В сыворотке крови с помощью стандартных наборов реактивов исследовали активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), щелочной фосфатазы (ЩФ), концентрацию общего белка, глюкозы. Концентрацию малонового диальдегида (МДА) исследовали методом [10].

Результаты изучения биологической активности приведены в табл.2-4. Установлено, что на фоне интоксикации циклофосфаном антицитолитический эффект соединений (Iа) и (Iб) ниже, а антиоксидантный в 1,3-1,4 раза выше, чем у ДКВ. Показано, что соединение (Iб) на фоне гемодепрессии, вызванной введением циклофосфана, уменьшает лейкопению и превосходит ДКВ по стимулирующему влиянию на лейкоцитарный росток крови. Агент (Iа) в тех же условиях не проявляет значимого гемостимулирующего эффекта.

Таким образом, предлагаемое изобретение обладает следующими преимуществами, а именно:

- Высокая гепатопротекторная активность соединений (Iа) и (Iб) при токсическом гепатите.

- Антиоксидантный и гемостимулирующий эффекты соединения (Iб) на фоне введения цитостатика циклофосфана.

- Использование для синтеза соединений (Iа, б) исходного, получаемого из доступного растительного сырья - хвои или живицы кедра сибирского Pinus sibirica R. Mayr.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение (Z)-Метил-16-{2-бензоиламино-2-[2-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-этилкарбамоил]-винил}-15,16-эпокси-8 (17), 13(16), 14-лабдатриен-18-оата (Ia).

К раствору 1.00 г (2.79 ммоль) 16-формилметилламбертианата (V) [7] в 15 мл уксусного ангидрида при перемешивании добавили 0.50 г (2.79 ммоль) гиппуровой кислоты и 0.38 г (2.79 ммоль) карбоната калия. Реакционную смесь перемешивали в течение 5 ч и оставили на ночь. Выпавший осадок отфильтровали, промыли водой, сушили под вакуумом и перекристаллизовывали из смеси петролейный эфир: серный эфир =2:1. Получили 1.06 г (выход 76%) Z-(1S,4aR,5S)-метил-1.4а-диметил-6-метилен-5-{2-[2-(5-оксо-2-фенил-4-оксазолилиденметил)-фур-3-ил1этил}-декагидронафталин-1-карбоксилата (VI). Т_пл 112-115°С. 1.16 (с 7.68, CHCl₃). ИК спектр, см^-1: 702, 780, 883 (Ph); 883 (C=C); 983, 1551 (фуран); 1173, 1380, 1720 (СО₂Ме); 1645, 1759, 1789 (азлактон). УФ спектр, λ_макс, нм (lg ε) 232 (3.41), 266 (3.75), 392 (4.18), 409 (4.17). Спектр ЯМР ¹H (δ, м.д., J, Гц): 0.43 с (3Н, С^20,H₃), 0.82 т.д. (1Н, Н^1', J 12, 3), 0.90 т.д. (1H, Н³', J 12, 3), 1.06 с (3Н, С^19, Н₃), 1.13 д.д. (1Н, Н⁵', J 11, 2.4), 1.38 д.м. (1Н, Н²', J 12), 1.48 д (1Н, Н^9', J 9), 1.60-1.80 м (6Н, н^{7',2',6',11',11',1'}), 1.89 д.м (1Н, Н^6' J 12), 2.05 д.м. (1Н, Н^3', J 11), 2.36 т.д. (1Н, Н^7', J 11, 3), 2.51 м (1Н, Н^12'), 2.66 м (1Н, Н^12'), 3.51 с (3Н, ОСН₃), 4.53 с, 4.92 с (2Н, Н^17',17'), 6.40 д (1Н, Н^14', J 1.8), 6.92 с (1Н, Н⁶), 7.41 т (2Н, Н^3",5", J 7), 7.48 т.т. (1Н, Н^4", J 7, 1), 7.68 д (1Н, Н¹⁵, J 1.8), 8.07 д.д. (2Н, Н^2",6", J 7, 1). Спектр ЯМР С¹³ (CDCl₃, δ_с м.д.): 12.36 к (С^20'), 19.54 т (С^2'), 23.49 т (С^12'), 23.89 т (С^11'), 25.90 т (С^6'), 28.39 к (С^19'), 37.74 т (С^3'), 38.19 т (С^7'), 38.65 т (С^1'), 39.78 с (С^4'), 43.87 с (С^10'), 50.81 к (ОСН₃), 54.17 д (С^9'), 55.77 д (С^5'), 106.58 т (С^17'), 113.67 д (С^14'), 115.00 д (С⁶), 125.32 с (С^1"), 127.86 д (С^2",6"), 128.18 с (С⁴), 128.49 д (С^3",5"), 132.64 д (С^4"), 137.80 с (С^13'), 146.80 с (С^16'), 147.14 с (С^8'), 147.71 д (С^15'), 162.14 с (С²), 167.53 с (С⁵), 177.27 с (С^18'). Найдено: С 74.03, Н 7.11, N 2.7. С₃₁O₅МН₃₅ Вычислено: С 74.25, Н 6.99, N 2.79.

К раствору 0.50 г (1.0 ммоль) азлактона (VI) в 7 мл бензола добавили 0.27 г (1.1 ммоль) 3,5-дитретбутил-4-гидроксифенилэтиламина, реакционную массу нагревали (70°С) в течение 6 ч. Растворитель удалили в вакууме, остаток хроматографировали на силикагеле (элюент: хлороформ). Кристаллизацией из диэтилового эфира выделили 0.57 г (выход 76%) соединения (Iа). Т_пл 91-93°С. [α]₅₈₀ 9.40° (с 1.90, CHCl₃). ИК спектр, см^-1: 713, 750, 769 (Ph); 890 (фуран); 1122, 1188, 1722 (CO₂Me); 1516, 1665 (CONH), 3426 (ОН). УФ спектр, λ_макс, нм (lg ε) 316 (3.26). Спектр ЯМР ¹Н (δ, м.д., J, Гц): 0.48 с (3Н, С²⁰Н₃), 0.94 т.д. (1Н, Н¹, J 12, 3), 0.99 т.д. (1Н, H³, J 12, 3), 1.14 с (3Н, С¹⁹Н₃), 1.25 д.д. (1Н, Н⁵, J 11, 3), 1.37 с (18Н, 2С(СН₃)₃), 1.48 д (1Н, H², J 12), 1.56 с (2Н, H^9,11), 1.68-1.80 м (4Н, H¹'⁶'^2,11), 1.87 т.д. (1Н, Н⁷, J 10, 3), 1.96 д.м. (1Н, Н⁶, J 12), 2.12 д.м. (1Н, Н³, J 11), 2.33 м (2Н, H^12,7), 2.58 м (1Н, Н¹²), 2.79 т (2Н, CH₂Ar, J 6), 3.58 с (3Н, ОСН₃), 3.61 м (2Н, NHCH₂), 4.56 с, 4.91 с (2Н, H^17,17), 5.07 с (1Н, ОН), 6.32 д (1Н, Н¹⁴, J 1.8), 6.54 т (1Н, CONH, J 6), 6.83 с (1Н, Н^1'), 7.00 с (2Н, Н^2",6"), 7.34 д (1Н, Н¹⁵, J 1.8), 7.46 т (2Н, H^7',9', J 7), 7.54 т (1Н, Н^8', J 7), 7.91 д (2Н, H^6',10',J 8), 8.55 ш.с. (1Н, Н^3'). Спектр ЯМР С¹³ (CDCl₃, δ_с м.д.): 12.44 к (С²⁰), 19.69 т (С²), 23.21 т (С¹²), 24.12 т (С¹¹), 26.07 т (С⁶), 28.56 к (С¹⁹), 30.09 к 34.06 с 35.58 т 37.93 т (С³), 38.43 т (С⁷), 38.86 т (С¹), 39.98 т (CH₂N), 41.56 с (С⁴), 44.07 с (С¹⁰), 50.96 к (ОСН₃), 54.70 д (С⁹), 55.90 д (С⁵), 106.48 т (С¹⁷), 110.72 д (С^1'), 112.78 д (С¹⁴), 125.11 д (С^2",6"), 126.31 с (С^2'), 127.32 д (С^6',10'), 128.58 д (С^7',9'), 129.33* с (С¹³), 129.81* с (С^5'), 132.05 д (С^8'), 133.19 с (С^1"), 135.76 с (С^3",5"), 143.14 д (С¹⁵), 146.24 с (С¹⁶), 147.50 с (С⁸), 152.10 с (С^4"), 164.80 с (CONH), 166.22 с (С^4'), 177.58 с (С¹⁸). Найдено: С 74.61, N 3.68, Н 8.73. C₄₇O₆N₂H₆₂ Вычислено: С 75.20, N 3.73, Н 8.28.

Пример 2. Получение (Z)-Метил-16-{2-бензоиламино-2-[3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-пропилкарбамоил]-винил}-15,16-эпокси-8(17), 13(16), 14-лабдатриен-18-оата (Iб).

К раствору 0.50 г (1.0 ммоль) азлактона (VI), полученного по примеру 1, в 7 мл бензола добавили 0.27 г (1.1 ммоль) 3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенилпропиламина, реакционную массу нагревали (70°С) в течение 6 ч. Растворитель удалили в вакууме, остаток хроматографировали на силикагеле (элюент: хлороформ). Кристаллизацией из диэтилового эфира выделили 0.69 г (выход 91%) соединения (Iб). Т_пл 85-87°С. [α]₅₈₀ 11.06° (с 3.23, CHCl₃). ИК спектр, см^-1: 713, 747, 769 (Ph); 890 (фуран); 1155, 1231, 1723 (CO₂Me); 1514, 1665 (CONH). 3325 (ОН). УФ спектр, λ_макс, нм (lg ε) 315 (3.24). Спектр ЯМР ¹Н (δ, м.д., J, Гц): 0.48 с (3Н, С²⁰Н₃), 0.93 т.д. (1Н, H¹, J 12, 3), 0.98 т.д. (1Н, Н³, J 12, 3), 1.14 с (3Н, С¹⁹Н₃), 1.25 д.д. (1Н, Н⁵, J 11, 3), 1.40 с (18Н, 2С(СН₃)₃, 1.45 м (1Н, Н²), 1.55 с (2Н, Н^9,11), 1.66-1.80 м (4Н, H¹'⁷-²'¹¹), 1.86 м 1.96 д.м. (1Н, Н⁶ J 12), 2.12 д.м. (1Н, Н³, J 11), 2.38 м (2Н, H^12,7), 2.58 т (3Н, СН₂Ar, Н¹², J 6), 3.41 д.д. 3.58 с (3Н, ОСН₃), 4.56 с, 4.92 с (2Н, H^17,17), 5.03 с (1Н, ОН), 6.33 д (1Н, Н¹⁴, J 1.8), 6.52 т (1Н, CONH, J 6), 6.81 с (1Н, H^1'), 6.97 с (2Н, H^2",6"), 7.35 д (1Н, Н¹⁵, J 1.8), 7.47 т (2Н, Н^7',9', J 7), 7.55 т (1Н, Н^8', J 7), 7.93 д (2Н, Н^6',10'; J 8), 8.59 ш.с. (1Н, H^3'). Спектр ЯМР С¹³ (CDCl₃, δ_с м.д.): 12.50 к (С²⁰), 19.76 т (С²), 23.27 т (С¹²), 24.21 т (С¹¹), 26.13 т (С⁶), 28.61 к (С¹⁹), 30.21 к (С(СН₃)₃), 31.59 т 35.09 т 34.14 с 37.99 т (С³), 38.51 т (С⁷), 38.92 т (С¹), 39.69 т (CH₂N), 40.04 с (С⁴), 44.13 с (С¹⁰), 51.03 к (ОСН₃), 54.74 д (С⁹), 55.95 д (С⁵), 106.55 т (С¹⁷), 110.60 д (С^1'), 112.87 д (С¹⁴), 124.76 д (С^2",6"), 126.53 с (С^2'), 127.38 д (С^6''^10'), 128.65 д (С^7',9'), 129.79 с (С¹³), 132.03 с (С^5'), 132.14 д (С^8'), 133.25 с (С^1"), 135.62 с (С^3",5"), 143.17 д (С¹⁵), 146.36 с (С¹⁶), 147.57 с (С⁸), 151.74 с (С⁴"), 164.88 с (CONH), 166.22 с (С^4'), 177.65 с (С¹⁸). Найдено: С 75.32, N 3.62, Н 8.63. C₄₈O₆N₂H₆₄ Вычислено: С 75.39, N 3.66, Н 8.38.

Пример 3. Исследование гепатопротекторных свойств на модели острого токсического гепатита

Острый токсический гепатит вызывали у беспородных мышей самцов путем однократного внутрижелудочного введения 25% раствора CCl₄ в подсолнечном масле (по 0,1 мл на 10 г массы тела). Соединения (Iа) или (Iб) вводили внутрижелудочно мышам (по 9 шт. в каждой группе) в дозе 100 мг/кг в виде водно-твиновой взвеси за 1 час до воспроизведения гепатита. Контрольным животным (9 шт.) аналогично вводили водно-твиновую взвесь в эквивалентном объеме, группе сравнения (9 шт.) - дигидрокверцетин в дозе 100 мг/кг. Через сутки в сыворотке крови мышей определяли с помощью стандартных наборов реактивов («Biocon», «Ольвекс Диагностикум») активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT) и щелочной фосфатазы (ЩФ). Уровень малонового диальдегида (МДА) определяли методом [10]. Результаты обрабатывали статистически с помощью пакета программ «STATISTIKA 6».

Результаты эксперимента представлены в таблице 1. Установлено, что соединения (Iа) и (Iб) проявляют достоверный антицитолитический эффект. Агент (Iа) снижает активность трансаминаз в крови в 1,3, агент (Iб) - в 1,7-1.9 раз по сравнению с контролем. Оба агента не уступают дигидрокверцетину по влиянию на уровень АЛТ (различия между группами не достоверны), а агент (Iб) превосходит референс-соединение в 1,7 раз по влиянию на активность ACT. Под действием соединений (Iа) и (Iб) достоверно уменьшается активность ЩФ, что свидетельствует о их антихолестазном действии. Агент (Iа) снижает активность ЩФ в крови в 1,5, а агент (Iб) - в 2 раза по сравнению с контролем. По выраженности антихолестазного эффекта соединение (Iа) не уступает, а соединение (Iб) достоверно превосходит ДКВ в 1,5 раза. Оба агента, так же как и референс соединение, в условиях данного опыта не оказали влияния на интенсивность процессов перекисного окисления: концентрация МДА в соответствующих группах не имела достоверных различий с контролем (табл.1).

Таблица 1
Влияние соединений (Iа) и (Iб) на биохимические показатели сыворотки крови мышей с индуцированным CCl₄ гепатитомГруппаБиохимические показателиАЛТ, мккат/лACT, мккат/лЩФ, мккат/лМДА, мкмоль/лконтроль880,80±37,12554,00±48,342,91±0,263,56±0,35(Iа)655,80±55,46**411,07±43,58*1,99±0,12*3,75±0,12"(Iб)515,58±60,41***290,14±46,17**1,41±0,16**3,07±0,24ДКВ577,24±25,81***480,47±41,142,18±0,14*3,28±0,11*Р<0,05; **Р<0,01; ***Р<0,001 - различия с контролем достоверны.^#P<0,05 различия с ДКВ достоверны.

Таким образом, показано, что соединения (Iа) и (Iб) при внутрижелудочном введении в дозе 100 мг/кг обладают гепатопротекторным действием, снижая выраженность цитолитических и холестатических процессов на фоне токсического гепатита. По величине эффекта соединение (Iа) не уступает, а соединений (Iб) превосходит ДКВ.

Пример 4. Исследование гепатопротекторных и антиоксидантных свойств на фоне токсического поражения крыс циклофосфаном

Эксперимент проводили на крысах самках Вистар, которым вводился однократно внутрибрюшинно циклофосфан в дозе 125 мг/кг (в растворе 0.9% NaCl). Соединения (Ia) и (Iб) вводилось в желудок крысам (по 10 шт. в группе) в виде водно-твиновой взвеси в дозе 50 мг/кг в течение трех дней после введения ЦФ. Референсное соединение - дигидрокверцетин (ДКВ) - вводили в той же дозе аналогичным образом отдельной группе крыс (10 шт.). Контролем являлись животные с введением только ЦФ (10 шт.). В конце опыта в сыворотке крови исследовали с помощью стандартных наборов реактивов («Biocon», «Ольвекс Диагностикум») активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), щелочной фосфатазы (ЩФ), концентрацию общего белка и глюкозы. Результаты представлены в табл.2. Установлено, что на фоне циклофосфана соединения (Iа) и (Iб) не проявили антицитолитического действия: активность обеих трансаминаз не имела статистических различий с контролем. Соответствующий эффект ДКВ проявился только в отношении ACT, активность которой в референс группе снизилась в 1,4 раза относительно контроля. Оба агента и ДКВ в данном опыте не оказали антихолестазного действия. Соединения (Iа) и (Iб) не повлияли заметно на концентрацию МДА в крови, в отличие от ДКВ, который достоверно усилил интенсивность перекисного окисления относительно контроля. Различия между ДКВ и соединениями (Iа) и (Iб) по концентрации МДА составили соответственно 1,3 и 1,4 раза. Значимой разницы между агентами и референс-соединением по влиянию на показатели общего обмена (белок, глюкозу) не обнаружено.

Таблица 2
Влияние соединений (Iа) и (Iб) на средние значения биохимических показателей сыворотки крови крыс на фоне интоксикации циклофосфаномГруппаАЛТ. мкат/г белкаACT. мкат/г белкаШФ. мкат/г белкаМДА, мкмоль/лОбщий белок, г/лГлюкоза, ммоль/лконтроль54,3±6,873,9±7,9129,0±9,51,93±0,0963,1±2,3416,43±1,02(Iа)67,3±3,869,5±4,7^#122,8±15,11,98±0,0559,89±2,3213,53±0,55*(Iб)65,3±4,386,4±9,2^#146,2±16,71,86±0,1758,73±2,9214,64±0,36ДКВ55,2±5,253,7±3,9*146,3±13,62,57±0,09*63,14±1,5214,19±0,70*Р<0,05 - различия с контролем достоверны;^#Р<0,05 различия с ДКВ достоверны.

Таким образом, показано, что при внутрижелудочном введении в дозе 50 мг/кг на фоне интоксикации циклофосфаном антицитолитический эффект соединений (Iа) и (Iб) ниже, а антиоксидантный выше, чем у ДКВ.

Пример 5. Исследование гемостимулирующего действия на фоне токсического поражения крыс циклофосфаном

Эксперимент проводили на крысах самках Вистар, которым вводился однократно внутрибрюшинно циклофосфан в дозе 125 мг/кг (в растворе 0.9% NaCl). Соединение (I) вводилось в желудок 12 крысам в дозе 50 мг/кг в течение трех дней после введения ЦФ (в виде водно-твиновой взвеси). Референсное соединение - дигидрокверцетин (ДКВ) - вводили в той же дозе аналогичным образом отдельной группе крыс (10 шт.). Контролем являлись животные с введением только ЦФ (10 шт.). В конце опыта с помощью гемоанализатора MEDONIC определяли морфологический состав периферической крови. Лейкоцитарную формулу подсчитывали под микроскопом в мазках крови, окрашенных гематоксилин-эозином.

Результаты представлены в табл.3. Установлено, что на фоне гемодепрессии, вызванной циклофосфаном, соединение (Iб) вызывает однонаправленные с ДКВ сдвиги в показателях периферической крови. Соединение (Iб) достоверно снижает лейкопению, повышая в 1,9 раза количество лейкоцитов в крови относительно контроля, что превышает аналогичный эффект ДКВ (1,6 раз). У агента (Iб) выявлено небольшое (в 1,2 раза) снижение количества эритроцитов по сравнению с контролем, которое коррелирует с таким же снижением гематокрита. Относительное уменьшение эритроцитарной массы у животных этой группы компенсируется небольшим достоверным повышением количественных показателей гемоглобина в эритроцитах (МСН, МСНС). Соединение (Iа) не вызвало достоверных сдвигов в показателях периферической крови и, таким образом, не проявило гемостимулирующего эффекта.

Таблица 3
Влияние соединений (Ia) и (Iб) на средние значения показателей периферической крови крыс на фоне интоксикации циклофосфаномГруппаRBCНСТWBCHGBPLTMCVRDW%MPVМСНМСНСКонтроль5,06±0,2128,0±1,20,9±0,115,5±0,893,9±8,455,3±1,010,2±0,48,8±0,0130,6±0,655,5±0,6(Iа)5,25±0,3128,4±1,21,1±0,216,3±0,397,4±8,853,9±0,810,7±0,68,6±0,05*31,1±0,657,7±0,5*(Iб)4,33±0,24*23,7±1,4*1,7±0,3*14,2±0,6101,1±17,258,5±1,910,6±0,38,5±0,1*33,0±0,8*57,4±0,3*ДКВ4,19±0,20*22,6±0,9*1,4±0,214,2±0,688,3±8,955,3±0,810,2±0,68,3±0,1*33,9±0,3*61,3±0,8*Норма6,87±0,1438,7±0,717,0±0,919,7±0,6257,0±21,257,1±0,913,3±0,79,0±0,129,7±0,552,0±0,4*Р<0,05 - различия с контролем достоверны.RBC - количество эритроцитов, НСТ - гематокрит, WBC - количество лейкоцитов, НОВ - гемоглобин, PLT - тромбоциты, MCV - средний объем эритроцитов, RDW% - процент распределения по абсолютному весу красной крови, MPV - объем тромбоцитов, МСН - среднее содержание гемоглобина в эритроците, МСНС - средняя концентрация гемоглобина.

На фоне нейтропении, вызванной циклофосфаном, наблюдалась тенденция к увеличению количества гранулоцитарных клеток под действием соединений (Iа) и (Iб). В этих же группах в крови животных выявлен относительный моноцитоз. Отмеченная тенденция к стимуляции клеток лейкоцитарного ряда была более выраженной у соединения (Iб), чем у ДКВ (табл.4).

Таблица 4
Влияние соединений (Iа) и (Iб) на средние значения показателей лейкоцитарной формулы крови крыс на фоне интоксикации циклофосфаномГруппаэозинофилып/ядерныес/ядерныемоноцитылимфоцитыконтроль001,43±0,482,43±0,8196,14±0,51(Iа)0,29±0,1803,43±0,844,57±0,5791,86±0,99(Iб)0,43±0,2001,29±0,685,71±1,0492,57±1,64ДКВ000,71±0,294,71±0,4794,57±0,48Норма0,86±0,46019,29±1,447,14±1,0672,61±1,44

Таким образом, показано, что соединение (Iб) при внутрижелудочном введении в дозе 50 мг/кг на фоне гемодепрессии, вызванной введением циклофосфана, уменьшает лейкопению и превосходит ДКВ по стимулирующему влиянию на лейкоцитарный росток крови. Агент (Iа) в тех же условиях не проявляет значимого гемостимулирующего эффекта.

Источники информации

1. М.Д.Машковский. Лекарственные средства, изд.15. М.: «Новая Волна», 2005, 471.

2. М.Д.Машковский. Лекарственные средства, изд.15. М.: «Новая Волна», 2005, 731.

3. Е.Г.Гольдберг, Зуева Е.П., Препараты из растений в комплексной терапии злокачественных новообразований. Томск. Изд-во Томского университета. 2000, 128 с.

4. М.Б.Плотников, Н.А.Тюкавкина, Т.М.Плотникова. Лекарственные препараты на основе диквертина. Томск. Изд-во Томского университета. 2005, 228 с.

5. Лекарственные препараты, разрешенные к применению в СССР./Под ред. М.А.Клюева, Э.А.Бабаяна. М., Медицина, 1979, с.61-65.

6. Т.Г.Толстикова, И.В.Сорокина, Т.В.Воевода, С.В.Чернов, Э.Э.Шульц, Г.А.Толстиков. Доклады академии наук. 2001. Т.376. №2. С.271-273.

7. Клок Д.А., Шакиров М.М., Гришко В.В., Ралдугин В.А. Известия АН. Серия химическая. 1995. №11. С.2514-2517.

8. Т.Г.Толстикова, И.В.Сорокина, М.П.Долгих., Ю.В.Харитонов, С.В.Чернов, Э.Э.Шульц, Г.А.Толстиков. Химико-фармацевтический журнал. 2004. Т. 38, №10. С.13-15.

9. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: Медицина, 2000, 832 с.

10. Камышников B.C. Справочник по клинико-химической лабораторной диагностике, Минск: Беларусь, 2000, Т.2, с.207.

Изобретение относится к новым соединениям, конкретно к 16-{2-бензоиламино-2-[(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-алкилкарбамоил]винил}-лабдатриенам формулы (I)

обладающим антиоксидантными, гепатопротекторными и гемостимулирующими свойствами, позволяющими использовать их при токсическом гепатите и для коррекции побочных эффектов цитостатических препаратов (например, циклофосфана). Соединения формулы I получают из растительного сырья - хвои или живицы кедра сибирского. 4 табл.

16-{2-Бензоиламино-2-[(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-алкилкарбамоил]винил}-лабдатриены формулы (I)

обладающие антиоксидантными, гепатопротекторными и гемостимулирующими свойствами.