НОВЫЙ КОМПЛЕКС БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ИЗ КОРЫ ЛИСТВЕННИЦЫ-ПИКНОЛАР Российский патент 2005 года по МПК A61K35/78 

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, и касается разработки и применения нового природного препарата пикнолар с широким спектром биологической активности.

В настоящее время для профилактики и лечения многих заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом, широко применяются антиоксиданты. При этом предпочтение отдается растительным препаратам, обладающим широким спектром фармакологической активности. Наиболее близким по фармакологическим свойствам к заявленному агенту является дигидрокверцетин, обладающий антиоксидантной, противовоспалительной, ангио- и гепатопротекторной активностью. Источником получения дигидрокверцетина является древесина лиственницы [1]. Кора также является ценным сырьем для выделения биологически активных соединений. Из коры сосны приморской получают известный препарат Picnogenol® [2], проявляющий противовоспалительные, антигистаминные, антипротеолитические и ангиопротекторные свойства.

Цель предлагаемого изобретения состоит в разработке нового препарата пикнолар из комплекса биологически активных соединений, получаемых из коры лиственницы сибирской, и расширения спектра его действия за счет проявления антиоксидантных, капилляропротекторных, гастро- и гепатозащитных свойств.

Комплекс веществ из коры лиственницы, лежащий в основе пикнолара, получают по известному способу [3]. По химическому составу пикнолар представляет собой смесь природных фенолокислот, мономерных флавоноидов, олигомерных и полимерных проантоцианидинов в соотношении 1:1:3:5 соответственно.

Разработка нового фитокомплекса пикнолар из коры лиственницы, обладающего антиоксидантной, капилляроукрепляющей, гастро- и гепатозащитной активностью, способствует решению задачи замещения на рынке России дорогостоящих импортных препаратов аналогичными дешевыми отечественными средствами. Одновременно решаются экологические проблемы, связанные с утилизацией отходов коры лиственницы.

Биологическая активность пикнолара изучалась путем определения капилляроукрепляющей, антиоксидантной, гастро- и гепатозащитной активности. Полученные данные обрабатывались статистически с помощью стандартного пакета программ “STATISTICA”.

Предварительно методом Кербера [4] определялась острая токсичность на белых беспородных мышах массой 22-25 г при однократном внутрижелудочном способе введения. Показано, что пикнолар относится к IV классу токсичности, ЛД₅₀ свыше 5000 мг/кг.

Влияние пикнолара на проницаемость сосудов кожи определяли по методу Ойвина и Монаковой на мышах массой 20-22 г. Препаратом сравнения являлся дигидрокверцетин в соответствующих дозах. Тестируемый комплекс вводили внутрижелудочно в дозах 100 и 300 мг/кг. Результаты, представленные в таблице 1, свидетельствуют о наличии прямого дозозависимого капилляроукрепляющего эффекта. При этом активность пикнолара в 1,2-1,4 раза выше, чем у дигидрокверцетина.

Гастрозащитные свойства пикнолара изучали на модели индометациновой язвы желудка в остром и хроническом опытах. Острый опыт проводили на 40 беспородных крысах-самцах массой 180-200 г. Язвообразование вызывали внутрижелудочным введением натощак индометацина в дозе 20 мг/кг. Исследуемые агенты вводили за час до введения индометацина в дозах 100 и 300 мг/кг, контрольным - воду в эквивалентном объеме. Препаратом сравнения являлся дигидрокверцетин в соответствующих дозах. Через сутки подсчитывали количество язвенных поражений в контрольной и опытных группах, определяли индекс Паулса и противоязвенную активность [5].

Результаты, представленные в таблице 2, показывают, что при однократном введении оба агента проявляют противоязвенный эффект в дозе 300 мг/кг, при этом у пикнолара он был выражен несколько сильнее, чем у дигидрокверцетина.

Изучение гастропротекторных свойств пикнолара при хроническом введении проводилось на 24 беспородных крысах массой 180-200 г. Опытным животньм в течение 7 дней вводили внутрижелудочно пикнолар в дозе 300 мг/кг, контрольным - воду в эквивалентном объеме. После этого животных на сутки лишали корма. На следующий день последний раз вводили пикнолар, после чего через час всем животным вводили внутрь индометацин в дозе 20 мг/кг. Через сутки подсчитывали количество язвенных деструкций в группах, определяли индекс Паулса и противоязвенную активность. Препаратом сравнения служил дигидрокверцетин.

Результаты, представленные в таблице 3, свидетельствуют о том, что при хроническом 8-кратном введении оба агента проявляют гастрозащитный эффект, однако пикнолар по активности почти в 2 раза уступает дигидрокверцетину.

Изучение антиоксидантных и гепатопротекторных свойств пикнолара проводили на моделях токсического ССЦ -гепатита при профилактическом [6] и лечебном [7] введении, а также на модели лекарственного (парацетамолового) [8] гепатита.

Для исследования брали 40 беспородных крыс-самцов массой 160-200 г пикнолар вводили в желудок в течение 9 дней в дозе 100 мг/кг. Отдельной группе крыс аналогично вводили препарат сравнения - дигидрокверцетин, контрольным животным - воду. Токсический гепатит у контрольных и опытных животных вызывали путем подкожного введения в область спины 20% раствора ССl₄ на 4-й, 6-й и 8-й дни опыта за 15 мин до введения агентов. Через 24 часа после последнего введения пикнолара всех крыс декапитировали под легким эфирным наркозом, брали для исследования сыворотку крови и печень. В сыворотке крови с помощью стандартных наборов реактивов фирмы Biocon определяли активность трансаминаз (АЛТ, ACT), щелочной фосфатазы (ЩФ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), каталазы (КАТ), уровень общего билирубина, малонового диальдегида [9]. В печени исследовали концентрацию малонового диальдегида. Результаты биохимического анализа, представленные в таблице 4, свидетельствуют о том, что профилактическое введение пикнолара уменьшает гепатотоксическое действие ССl₄, снижает интенсивность ПОЛ в крови и печени. По отдельным показателям (ЛДГ, БИЛ, МДА крови) фитокомплекс коры незначительно уступает дигидрокверцетину, по другим (АЛТ, ЩФ, МДА печени) превосходит его. Сделан вывод, что пикнолар обладает антиоксидантными и гепатопротекторными свойствами. Наблюдаемые сдвиги в показателях свидетельствуют о превалирующем гепатотропном характере его действия на организм.

Изучение антиоксидантной и гепатопротекторной активности пикнолара при лечебном введении проводили на модели ССl₄-гепатита, который вызывали у крыс путем подкожного введения 5% раствора ССl₄ в подсолнечном масле в течение 4-х дней. После этого крысам в течение 5 дней, вводили внутрь пикнолар в дозе 100 мг/кг. На 9-й день животных декапитировали под легким эфирным наркозом. В сыворотке крови определяли активность трансаминаз, щелочной фосфатазы, лактатдегидрогеназы, каталазы, уровень общего билирубина, малонового диальдегида, в печени - концентрацию малонового диальдегида.

В результате анализа данных, представленных в таблице 5, сделано заключение, что при лечебном способе введения пикнолар по антиоксидантной активности в целом уступает дигидрокверцетину, а по антихолестазным свойствам превосходит его в 1,8 раза.

Модель парацетамолового гепатита воспроизводили у крыс путем введения в желудок в течение двух дней водного раствора парацетамола в дозе 1 г/кг (из расчета по 0,2 мл на 100 г массы тела). Изучаемые агенты вводили внутрь за 1 час до парацетамола. Через сутки после последнего введения гепатотоксина животных забивали путем декапитации под легким эфирным наркозом. В сыворотке крови определяли активность трансаминаз, щелочной фосфатазы, каталазы, уровень общего билирубина, малонового диальдегида, в печени - концентрацию малонового диальдегида. Согласно данным, приведенным в таблице 6, на фоне лекарственного гепатита пикнолар проявляет антиоксидантные свойства, снижая концентрацию вторичных продуктов перекисного окисления в крови и печени аналогично дигидрокверцетину. При этом гепатопротекторные свойства у пикнолара выражены сильнее, что проявляется в увеличении в 2,8 раза антихолестазного эффекта по сравнению с ДКВ. Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Изучение влияния пикнолара на проницаемость сосудов кожи.

Изучение влияния пикнолара на проницаемость сосудов кожи проводили на мышах массой 20-22 г. Критерием сосудистой проницаемости служило время выхода трипановой сини в очаг воспаления, вызываемого нанесением на депилированную поверхность кожи 0,05 мл ксилола. За 1 час до внутрибрюшинного введения 0,25 мл 1% раствора трипановой сини опытным мышам вводили внутрижелудочно пикнолар в 1,5% крахмальной взвеси в дозах 100 и 300 мг/кг. Эталоном сравнения служил дигидрокверцетин, вводимый в аналогичных дозах. Регистрировали время выделения трипановой сини в секундах. Результаты, представленные в таблице 1, свидетельствуют, что у обоих препаратов проявляется прямой дозозависимый эффект, при этом капилляроукрепляющая активность пикнолара превосходит активность дигидрокверцетина в 1,2- 1,4 раза.

Пример 2. Изучение гастрозащитных свойств пикнолара на модели индометациновой язвы в остром эксперименте.

Опыт проводили на 40 беспородных крысах-самцах массой 180-200 г. За сутки до начала эксперимента животных лишали пищи при свободном доступе к воде, после чего вводили внутрижелудочно индометацин в дозе 20 мг/кг. Опытным животньм за час до введения индометацина вводили внутрижелудочно пикнолар в дозах 100 и 300 мг/кг, контрольным - воду в эквивалентном объеме. Препаратом сравнения являлся дигидрокверцетин в соответствующих дозах. Подсчитывали количество язвенных поражений во всех группах, рассчитывали индекс Паулса по формуле ИП=АВ/100, где А- среднее количество язв на одно животное; В - количество животных с язвами в группе. Противоязвенную активность определяли (ПА) как отношение ИП контрольной группы к ИП опытных. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Согласно приведенньм данным дигидрокверцетин и пикнолар обладают выраженной активностью в дозе 300 мг/кг. В этой дозе гастрозащитный эффект пикнолара незначительно превышает эффект дигидрокверцетина.

Пример 3. Изучение гастрозащитных свойств пикнолара на модели индометациновой язвы в хроническом эксперименте

Для изучения гастрозащитной активности в хроническом эксперименте было взято 5 групп беспородных крыс-самцов массой 180-200г по 8 особей в каждой группе.

Опытным крысам в течение 7 дней вводили внутрижелудочно препараты в дозе 300 мг/кг, контрольной группе вводили воду по 0,2 мл/100 г веса. После этого на сутки всех крыс лишали пищи при свободном доступе к воде. Последнее введение препарата проводили за час до воспроизведения язвы. Язвообразование индуцировали путем внутрижелудочного введения индометацина в дозе 20 мг/кг. Через сутки животных подвергали эвтаназии под эфирным наркозом. Подсчитывали количество язвенных поражений во всех группах, рассчитывали индекс Паулса по формуле ИП=АВ/100, где А-среднее количество язв на одно животное; В - количество животных с язвами в группе. Противоязвенную активность (ПА) определяли как отношение ИП контрольной группы к ИП опытных. Результаты исследований представлены в таблице 3. Согласно приведенным данным при хроническом введении оба агента также проявили высокий гастрозащитный эффект, однако пикнолар уступал по активности дигидрокверцетину.

Пример 4. Изучение антиоксидантных и гепатопротекторных свойств пикнолара на модели острого ССl₄ гепатита при профилактическом введении.

Для исследования влияния профилактического введения пикнолара брали 40 беспородных крыс-самцов массой 160-200 г. Пикнолар вводили в желудок в течение 9 дней в виде раствора в крахмальном геле в дозе 100 мг/кг. Отдельной группе крыс аналогично вводили препарат сравнения - дигидрокверцетин, контрольным животным -воду. Токсический гепатит у контрольных и опытных животных вызывали путем подкожного введения в область спины 20% раствора ССl₄ по 0,4 мл/100 г массы тела на 4-й, 6-й и 8-й дни опыта за 15 мин до введения агентов. Через 24 часа после последнего введения пикнолара всех крыс декапитировали под легким эфирным наркозом, брали для исследования сыворотку крови и печень. В сыворотке крови определяли следующие показатели: активность трансаминаз (АЛТ, ACT), щелочной фосфатазы (ЩФ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), каталазы (КАТ), уровень общего билирубина, малонового диальдегида с помощью стандартных наборов реактивов фирмы “Biocon” на автоматическом фотометре 5010 фирмы (Boehringer Mannheim, Германия). В печени исследовали концентрацию малонового диальдегида. Результаты биохимического анализа представлены в таблице 4. Они свидетельствуют о том, что профилактическое введение пикнолара уменьшало гепатотоксическое действие ССl₄, снижало интенсивность ПОЛ в крови и печени. По отдельным показателям (ЛДГ, БИЛ, МДА крови) пикнолар незначительно уступал дигидрокверцетину, по другим (АЛТ, ЩФ, МДА печени) превосходил его.

На основании полученных данных была рассчитана в процентах величина антиоксидантного и гепатопротекторного эффектов относительно контроля, принятого за 100%. Результаты представлены в таблице 4.

Таким образом, установлено, что пикнолар проявляет антиоксидантную и гепатопротекторную активность при профилактическом введении. Показано, что по величине антиоксидантного эффекта изученный агент незначительно уступает, а по гепатопротекторному превосходит дигидрокверцетин.

Пример 5. Изучение антиоксидантных и гепатопротекторных свойств пикнолара на модели острого ССl₄ гепатита при лечебном введении.

Изучение антиоксидантной и гепатопротекторной активности пикнолара при лечебном введении проводили на модели ССl₄, который вызывали у крыс путем подкожного введения 5% раствора ССl₄ в подсолнечном масле из расчета по 0,4 мл на 100 г массы тела в течение 4-х дней. После этого, начиная с 4-го дня опыта, крысам в течение 5 дней вводили внутрь пикнолар в крахмальном геле в дозе 100 мг/кг. На 9-й день животных забивали, собирали кровь, отделяли сыворотку и печень. В сыворотке крови определяли активность трансаминаз, щелочной фосфатазы, лактатдегидрогеназы, каталазы, уровень общего билирубина, малонового диальдегида, в печени - концентрацию малонового диальдегида. Исходя из полученных данных была рассчитана величина антиоксидантного и гепатопротекторного эффектов в процентах относительно контроля, принятого за 100%. Результаты представлены в таблице 5.

В результате исследования установлено, что при лечебном способе введения пикнолар по антиоксидантной активности в целом уступал ДКВ, но по антихолестазным свойствам превосходил его в 1,8 раза.

Пример 6. Изучение антиоксидантных и гепатопротекторных свойств пикнолара на парацетамоловой модели гепатита.

Модель парацетамолового гепатита воспроизводили у крыс путем введения в желудок в течение двух дней водного раствора парацетамола в дозе 1 г/кг (из расчета по 0,2 мл на 100 г массы тела). Изучаемые агенты вводили внутрь за 1 час до парацетамола. Через сутки после последнего введения гепатотоксина животных забивали путем декапитации под легким эфирным наркозом, забирали кровь и печень. В сыворотке крови определяли активность трансаминаз, щелочной фосфатазы, каталазы, уровень общего билирубина, малонового диальдегида, в печени - концентрацию малонового диальдегида. Исходя из полученных данных была рассчитана в процентах величина антиоксидантного и гепатопротекторного эффектов относительно контроля, принятого за 100%. Результаты представлены в таблице 6. Они свидетельствуют о том, что на фоне лекарственного гепатита пикнолар проявляет антиоксидантные свойства аналогично ДКВ, однако его антихолестазные свойства выражены в 2,8 раза сильнее, чем у ДКВ.

Таким образом, на основании проведенного исследования установлено, что пикнолар, так же как и дигидрокверцетин, обладает капилляроукрепляющим, антиоксидантным, гастро- и гепатопротекторным действием. У пикнолара в отличие от дигидрокверцетина в большей степени выражен гепатопротекторный эффект, чем антиоксидантный.

ЛИТЕРАТУРА

1. Патент РФ №2014841, приоритет от 21.04.98, выдан 06.2000.

2. Pat. USA №4698360.

3. Патент РФ № 2188031, БИ № 24, 27.08.2002.

4. Беленький М.Л. Элементы количественного фармакологического эффекта. - М.: Медицина. - 1963. - 151 с.

5. Аничков С.В., Заводская И.С. Фармакотерапия язвенной болезни. - Л.; 1965. - 187 с.

6. Убашеев И.О. Природные лекарственные средства при повреждениях органов и тканей. - Улан-Удэ; 1998. - С.58-59.

7. Венгеровский А.И., Головина Е.Л., Буркова В.Н., Саратиков А.С. Энтеросорбенты усиливают гепатозащитное действие эплира при экспериментальном токсическом гепатите.// Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2001. - Т.64. - №1. - С.46-43.

8. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Методические указания по изучению гепатозащитной активности фармакологических веществ. М.; 2000. - С.228.

9. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты./ Современные методы в биохимии. - М.; 1977. - С.66-68.

Таблица 1Влияние пикнолара на проницаемость сосудов кожи мышейПрепарат;Доза, мг/кгВремя выхода трипановой сини, секКапилляроукрепляющий эффект, % от контроляКонтроль 33,3±3,3-Дигидрокверцетин10042,5±2,3*27,6 30051,7±1,3*55,2Пикнолар10044,6±2,6*33,9 30059,2±2,8*77,7* Р<0,05 по отношению к контролю

Таблица 2Гастрозащитные свойства пикнолара в остром экспериментеГруппыДоза, мг/кгКоличество всех пораженийКоличество язв на одно животноеИндекс ПаулсаПротивоязвен-ная активностьКонтроль 466,0±0,50,46-Дигидрокверцетин100566,5±1,30,520,9300444,5±0,9*0,361,3Пикнолар100536,6±1,20,900,9300364,0±0,5*0,311,5Р<0,05 по отношению к контролю

Таблица 3Гастрозащитные свойства пикнолара в хроническом экспериментеГруппыДоза, мг/кгКоличество всех пораженийКоличество язв на одно животноеИндекс ПаулсаПротивоязвен-ная активностьКонтроль 11313,5±2,51,06-Дигидрокверцетин300343,25±0,4*0,344,08Пикнолар300415,1±1,5*0,412,58* Р< 0,05 по отношению к контролю

Таблица 4Величина антиоксидантного и гепатопротекторного эффектов пикнолара при профилактическом введении крысам в сравнении с дигидрокверцетиномАгентАнтиоксидантный и гепатопротекторный эффекты,%АЛТACTБИЛЩФлдгКАТМДА_КМДА_ПДКВ1704112145290ПК2103127601216ДКВ – дигидрокверцетин, ПК –пикнолар

Таблица 5Величина антиоксидантного и гепатопротекторного эффектов фитокомплекса коры лиственницы при лечебном введении в сравнении с дигидрокверцетиномАгентАнтиоксидантный и гепатопротекторный эффекты.% iАЛТACTБИЛЩФЛДГКАТМДА_КМДА_ПДКВ2610011014464ПК25302000314ДКВ - дигидрокверцетин, ПК - пикнолар.

Таблица 6Величина антиоксидантного и гепатопротекторного эффектов пикнолара на модели лекарственного гепатитаАгентАнтиоксидантный и гепатопротекторный эффекты,%АЛТАСТБИЛЩФМДА_КМДА_ПКАТДКВ465712154700ПК000435680ДКВ - дигидрокверцетин, ПК - пикнолар

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к созданию средства с широким спектром фармакологического действия на основе лекарственного сырья. Средство, обладающее гепатопротекторным, антиоксидантным, капилляропротекторным и гастрозащитным действиями, представляет фитокомплекс из коры лиственницы, включающее смесь фенолокислот, флавоноидов, олигомерных и полимерных проантоцианидинов при соотношении 1:1:3:5 соответственно. Средство может быть использовано для профилактики и лечения многих заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом. 6 табл.

Средство, обладающее гепатопротекторным, антиоксидантным, капилляропротекторным и гастрозащитным действиями, характеризующееся тем, что оно представляет фитокомплекс из коры лиственницы, включающее смесь фенолокислот, флавоноидов, олигомерных и полимерных проантоцианидинов при соотношении 1:1:3:5 соответственно.