(Z)-МЕТИЛ-16-(5-ОКСО-2-ФЕНИЛ-ОКСАЗОЛ-4-ИЛИДЕНМЕТИЛ)-15,16-ЭПОКСИ-8(17),13(16),14-ЛАБДАТРИЕН-18-ОАТ, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ, ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОЙ И ГЕМОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2009 года по МПК C07D413/06 A61K31/421 A61P39/06 A61P1/16 A61P7/00 

Изобретение относится к медицине, конкретно к новому химическому соединению Z-метил-16-(5-оксо-2-фенил-оксазол-4-илиденметил)-15,16-эпокси-8(17),13(16),14-лабдатриен-18-оату формулы (I),

обладающему антиоксидантной, гепатопротективной и гемостимулирующей активностью.

Указанное свойство позволяет предполагать возможность использования соединения в медицине в качестве фармацевтического препарата.

В современной медицинской практике используются антиоксиданты синтетического и природного (растительного) происхождения. Среди антиоксидантов растительного происхождения применение нашли преимущественно флавоноиды, например рутин, кверцетин [1, 2], дигидрокверцетин [3]. Аналогом по фармакологическим свойствам заявляемого соединения является дигидрокверцетин [(2R,3R)-3,5,7,3',4'-пентагидроксифлаванон] формулы (II).

Дигидрокверцетин является основным биофлавоноидом (90% и выше) препарата диквертин, производство которого из древесины лиственницы налажено в последние годы. Дигидрокверцетин обладает антирадикальной и антиоксидантной активностью, противовоспалительными, капилляропротективными, гастро- и гепатопротекторными свойствами [3]. Основным недостатком препаратов на основе флавоноидов является возможное побочное действие на желудочно-кишечный тракт, проявляющееся в основном в виде тошноты, изжоги [1, 2].

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является создание на основе отечественного растительного сырья антиоксиданта нового структурного типа с высокой гепатопротекторной активностью. Важным элементом поставленной задачи служит получение агента с улучшенными фармакологическими свойствами, направленными на коррекцию системных побочных эффектов, возникающих при применении высокотоксичных лекарственных препаратов, таких как цитостатики. Препараты данной группы, широко используемые при противоопухолевой терапии, вызывают тяжелые расстройства в виде миело- и гемодепрессии, иммунологических нарушений, функциональных и морфологических повреждений различных органов и т.д. [4, 5]. Анализ литературных данных показывает, что синтез новых соединений из растительного сырья с целью расширения ассортимента нетоксичных антиоксидантов с дополнительными (помимо антиоксидантной активности) протекторными свойствами, является актуальной задачей.

Поставленная задача решается новым химическим соединением - Z-метил-16-(5-оксо-2-фенил-оксазол-4-илиденметил)-15,16-эпокси-8(17), 13(16),14-лабдатриен-18-оатом формулы (I), обладающим выраженной антиоксидантной, гепатопротекторной и гемостимулирующей активностью, в том числе на фоне введения в организм цитостатических препаратов.

Структурным аналогом указанного соединения является 16-аминометилпроизводное ламбертиановой кислоты, формулы (III), обладающее ноотропной активностью [6].

Способ получения соединения (I), имеющего строение азлактона лабданового типа, реализуется по приведенной схеме 1. Формилирование метилового эфира ламбертиановой кислоты (IV) приводит к 16-формилпроизводному (V) [7], выделяемому кристаллизацией. Взаимодействие альдегида (V) с бензоилглицином (гиппуровой кислотой) приводит к образованию лабданоидного 5(4Н)-оксазолона (I). Соединение (I) образуется с выходом до 76% в виде индивидуального изомера с (Z)-конфигурацией двойной связи. К достоинствам изобретения следует отнести способ получения соединения (I) путем химической модификации доступного растительного метаболита кедра сибирского Pinus sibirica R.Mayr. - метилового эфира ламбертиановой кислоты (IV). Последний легко выделяется из лесопромышленного продукта - кедровой живицы или из хвои кедра, являющейся многотоннажным отходом лесосеки [8]. Физико-химические константы нового, впервые полученного соединения (I) приведены в примере 1.

Схема 1

Биологическая активность соединения (I) изучалась путем определения антиоксидантной и гепатопротекторной активности на модели токсического CCl₄ гепатита у мышей, а также при поражении крыс, вызванном введением циклофосфана. В качестве препарата сравнения использовали антиоксидант дигидрокверцетин (II).

Предварительно в эксперименте на беспородных мышах массой 18-23 г определяли острую токсичность при однократном внутрижелудочном способе введения. Установлено, что LD₅₀ соединения (I) превышает максимально возможную для разового введения дозу 1000 мг/кг.

Для исследования антиоксидантного и гепатопротекторного эффектов была использована стандартная экспериментальная модель токсического CCl₄ гепатита у мышей. Модель воспроизводилась согласно методическим рекомендациям [9]. Раствор CCl₄ в растительном масле (25%) вводился внутрижелудочно мышам самцам. Соединение (I) вводили в желудок в дозе 100 мг/кг в виде водно-твиновой взвеси за 1 час до гепатотоксина. Референсное соединение - дигидрокверцетин (ДКВ) - вводили аналогичным образом. Через сутки в сыворотке крови мышей определяли активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), щелочной фосфатазы (ЩФ) и концентрацию малонового диальдегида (МДА) общепринятыми методами [10]. Установлено, что соединение (I) достоверно снижает активность трансаминаз в крови на фоне токсического гепатита, не уступая дигидрокверцетину по антицитолитическому и превосходя его по антихолестатическому эффекту (табл.1).

Изучение протекторного действия соединения (I) в условиях поражения циклофосфаном (ЦФ) изучали на крысах самках Вистар. ЦФ вводился однократно внутрибрюшинно в дозе 125 мг/кг в растворе 0.9% NaCl всем животным. Соединение (I) в виде водно-твиновой взвеси вводилось группе крыс (12 шт.) в желудок в дозе 50 мг/кг в течение трех дней после введения ЦФ. Референсное соединение - дигидрокверцетин (ДКВ) - вводили в той же дозе аналогичным образом отдельной группе крыс (10 шт.). Контрольной группе вводили только циклофосфан (10 шт.). В конце опыта определяли состав периферической крови и лейкоцитарную формулу. В сыворотке крови с помощью стандартных наборов реактивов исследовали активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), щелочной фосфатазы (ЩФ), концентрацию общего белка, глюкозы. Концентрацию малонового диальдегида (МДА) исследовали общепринятым методом [10].

Результаты изучения биологической активности приведены в табл.2-4. Установлено, что соединение (I) на фоне циклофосфана значительно уменьшает активность ЩФ. Отмеченный антихолестазный эффект в 1,7 раз превышает соответствующий эффект ДКВ. Соединение (I) также в 1,3 раза снижает концентрацию МДА по сравнению с ДКВ, что указывает на его антиоксидантную активность. Установлено, что при поражении циклофосфаном соединение (I) проявляет гемостимулирующий эффект, достоверно повышая количество лейкоцитов в периферической крови (в 1,7 раз относительно контроля), а также в 1,2-1,3 раза увеличивает количество эритроцитов, тромбоцитов и гемоглобина по сравнению с ДКВ.

Таким образом, новое соединение - Z-метил-16-(5-оксо-2-фенил-оксазол-4-илиденметил)-15,16-эпокси-8(17),13(16),14-лабдатриен-18-оату формулы (I) - обладает следующими преимуществами, а именно:

- Оно обладает высокой антиоксидантной и гепатопротекторной активностью, а также гемостимулирующим действием на фоне введения цитостатика циклофосфана.

- Использование для синтеза соединения (I) исходного, получаемого из доступного растительного сырья - хвои или живицы кедра сибирского Pinus sibirica R.Mayr.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Z-метил-16-(5 -оксо-2-фенил-оксазол-4-илиденметил)-15,16-эпокси-8(17),13(16),14-лабдатриен-18-оат (I).

К раствору 1.00 г (2.79 ммоль) 16-формилметилламбертианата (V) [7] в 15 мл уксусного ангидрида при перемешивании добавили 0.50 г (2.79 ммоль) гиппуровой кислоты и 0.38 г (2.79 ммоль) карбоната калия. Реакционную смесь перемешивали в течение 5 ч и оставили на ночь. Выпавший осадок отфильтровали, промыли водой, сушили под вакуумом и перекристаллизовывали из смеси петролейный эфир:серный эфир = 2:1. Получили 1.06 г (выход 76%) соединения (I). Т_пл 112-115°С. [α]²⁰ _D 1.16 (с 7.68, CHCl₃). ИК спектр, см^-1: 702, 780, 883 (Ph); 883 (C=C); 983, 1551 (фуран); 1173, 1380, 1720 (CO₂Ме); 1645, 1759, 1789 (азлактон). УФ спектр, λ_макс., нм (lg ε) 232 (3.41), 266 (3.75), 392 (4.18), 409 (4.17). Спектр ЯМР ¹Н (δ, м.д., J, Гц): 0.43 с (3Н, С^20'H₃), 0.82 т.д. (1Н, Н^1', J 12, 3), 0.90 т.д. (1Н, H^3', J 12, 3), 1.06 с (3Н, С^19'H₃), 1.13 д.д. (1Н, Н^5', J 11, 2.4), 1.38 д.м. (1Н, H^2', J 12), 1.48 д (1Н, H^9', J 9), 1.60-1.80 м (6Н, H ^{7',2',6',11',11',1'}), 1.89 д.м. (1Н, H^6' J 12), 2.05 д.м. (1Н, H^3', J 11), 2.36 т.д. (1Н, H^7', J 11, 3), 2.51 м (1Н, H^12'), 2.66 м (1Н, H^12'), 3.51 с (3Н, ОСН₃), 4.53 с, 4.92 с (2Н, H^17',17'), 6.40 д (1Н, Н^14', J 1.8), 6.92 с (1Н, Н⁶), 7.41 т (2Н, H^3'',5'', J 7), 7.48 т.т. (1Н, H^4'', J 7, 1), 7.68 д (1Н, H¹⁵, J 1.8), 8.07 д.д. (2Н, H^2'',6'', J 7, 1). Спектр ЯМР С¹³ (CDCl₃, δ_С м.д.): 12.36 к (С^20'), 19.54 т (С²¹), 23.49 т (С^12'), 23.89 т (С^11'), 25.90 т (С^6'), 28.39 к (С^19'), 37.74 т (С^3'), 38.19 т (С^7'), 38.65 т (С^1'), 39.78 с

(С^4'), 43.87 с (С^10'), 50.81 к (ОСН₃), 54.17 д (С^9'), 55.77 д (С^5'), 106.58 т (С^17'), 113.67 д (С^14'), 115.00 д (С⁶), 125.32 с (С1^''), 127.86 д (С^2'',6''), 128.18 с (С⁴), 128.49 д (С^3'',5''), 132.64 д (С^4''), 137.80 с (С^13'), 146.80 с (С^16'), 147.14 с (С^8'), 147.71 д (С^15'), 162.14 с (С²), 167.53 с (С⁵), 177.27 с (С^18'). Найдено: С 74.03, Н 7.11, N 2.7. C₃₁O₅NH₃₅. Вычислено: С 74.25, Н 6.99, N 2.79.

Пример 2. Исследование гепатопротекторных свойств на модели острого токсического гепатита

Острый токсический гепатит вызывали у беспородных мышей самцов путем однократного внутрижелудочного введения 25% раствора CCl₄ в подсолнечном масле из расчета по 0,1 мл на 10 г массы тела. Соединение (I) вводили внутрижелудочно в дозе 100 мг/кг в виде водно-твиновой взвеси за 1 час до воспроизведения гепатита. Контрольным животным аналогично вводили водно-твиновую взвесь в эквивалентном объеме, группе сравнения - дигидрокверцетин в дозе 100 мг/кг. Через сутки в сыворотке крови мышей определяли с помощью стандартных наборов реактивов («Biocon», «Ольвекс Диагностикум») активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT) и щелочной фосфатазы (ЩФ). Уровень малонового диальдегида (МДА) определяли общепринятым методом [10]. Результаты обрабатывали статистически с помощью пакета программ «STATISTIKA 6».

Установлено, что соединение (I) в условиях токсического гепатита оказывает антицитолитический эффект, достоверно снижая активность трансаминаз в крови (в 1,3-1,5 раз по сравнению с контролем). По антицитолитическому действию агент (I) не уступает дигидрокверцетину, о чем свидетельствует отсутствие статистически значимых различий в показателях между соответствующими группами. Обнаружено, что под действием соединения (I) заметно понижается уровень ЩФ (в 1,9 раза по сравнению с контролем), что свидетельствует о антихолестазном действии агента. По выраженности антихолестазного эффекта соединение (I) превосходит ДКВ в 1,4 раза. Оба агента в условиях данного опыта не проявили влияния на интенсивность процессов перекисного окисления: концентрация МДА в соответствующих группах не имела достоверных различий с контролем (табл.1).

Таблица 1 Влияние соединения (I) на биохимические показатели сыворотки крови мышей с индуцированным CCl₄ гепатитом Группа Биохимические показатели АЛТ, мккат/л ACT, мккат/л ЩФ, мккат/л МДА, мкмоль/л контроль 880,80±37,12 554,00±48,34 2,91±0,26 3,56±0,35 (I) 701,50±61,29* 373,16±49,00* 1,57±0,21** 4,55±0,46^# ДКВ 577,24±25,81*** 480,47±41,14 2,18±0,14* 3,28±0,11 * Р<0,05; ** Р<0,01; *** Р<0,001 - различия с контролем достоверны
^# Р<0,05 различия с ДКВ достоверны

Таким образом, показано, что соединение (I) при внутрижелудочном введении в дозе 100 мг/кг обладает гепатопротекторным действием, снижая выраженность цитолитических и холестатических процессов на фоне токсического гепатита.

Пример 3. Исследование гепатопротекторных и антиоксидантных свойств на фоне токсического поражения крыс циклофосфаном

Эксперимент проводили на крысах самках Вистар, которым вводился однократно внутрибрюшинно циклофосфан в дозе 125 мг/кг (в растворе 0.9% NaCl). Соединение (I) вводилось в желудок 12 крысам в дозе 50 мг/кг в течение трех дней после введения ЦФ (в виде водно-твиновой взвеси). Референсное соединение - дигидрокверцетин (ДКВ) - вводили в той же дозе аналогичным образом отдельной группе крыс (10 шт.). Контролем являлись животные с введением только ЦФ (10 шт.). В конце опыта в сыворотке крови исследовали с помощью стандартных наборов реактивов («Biocon», «Ольвекс Диагностикум») активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), щелочной фосфатазы (ЩФ), концентрацию общего белка и глюкозы.

Результаты представлены в табл.2. Установлено, что соединение (I) достоверно уменьшает активность ЩФ относительно контроля и референс соединения. Отмеченный антихолестазный эффект в 1,7 раз выше, чем у ДКВ. Соединение (I) также достоверно снизило (в 1,3 раза) концентрацию МДА относительно ДКВ, который в условиях данного опыта усилил интенсивность перекисного окисления. На фоне ЦФ соединение (I) не оказало влияние на активность трансаминаз, тогда как ДКВ достоверно снизило активность одной из них - ACT. Действия обоих соединений на показатели общего обмена (белок, глюкозу) не наблюдалось.

Из данных таблицы 2 видно, что соединение (I) при внутрижелудочном введении в дозе 100 мг/кг на фоне циклофосфанового поражения превосходит ДКВ по антихолестатическому и антиоксидантному эффекту.

Таблица 2 Влияние соединения (I) на средние значения биохимических показателей сыворотки крови крыс на фоне интоксикации циклофосфаном Группа АЛТ. мкат/г белка ACT. мкат/г белка ЩФ, мкат/г белка МДА, мкмоль/л Общий белок, г/л Глюкоза, ммоль/л контроль 54,3±6,8 73,9±7,9# 129,0±9,5 1,93±0,09# 63,1±2,34 16,43±1,02 (I) 62,6±2,9 81,4±7,1## 87,1±14,2* 1,92±0,07# 60,26±4,17 14,93±0,64 ДКВ 55,2±5,2 53,7±3,9* 146,3±13,6 2,57±0,09* 63,14±1,52 14,19±0,70 * Р<0,05 - различия с контролем достоверны;
^# Р<0,05 различия с ДКВ достоверны.

Пример 4. Исследование гемостимулирующего действия на фоне токсического поражения крыс циклофосфаном

Эксперимент проводили на крысах самках Вистар, которым вводился однократно внутрибрюшинно циклофосфан в дозе 125 мг/кг (в растворе 0.9% NaCl). Соединение (I) вводилось в желудок 12 крысам в дозе 50 мг/кг в течение трех дней после введения ЦФ (в виде водно-твиновой взвеси). Референсное соединение - дигидрокверцетин (ДКВ) - вводили в той же дозе аналогичным образом отдельной группе крыс (10 шт.). Контролем являлись животные с введением только ЦФ (10 шт.). В конце опыта с помощью гемоанализатора MEDONIC определяли морфологический состав периферической крови. Лейкоцитарную формулу подсчитывали под микроскопом в мазках крови, окрашенных гематоксилин-эозином.

Результаты представлены в табл.3. Установлено, что соединение (I) проявляет гемостимулирующий эффект, достоверно повышая количество лейкоцитов в периферической крови (в 1,7 раз относительно контроля). Соответствующий эффект ДКВ был менее значимым (1,5 раз относительно контроля). В отношении остальных показателей крови отмечена тенденция к их нормализации под действием соединения (I), положительный эффект которого превышал эффект ДКВ. Так под действием агента (I) количество эритроцитов и тромбоцитов увеличилось соответственно в 1,3 и 1,2 раза; гематокрит и гемоглобин повысился в 1,3-1,2 раза по сравнению с ДКВ (хотя среднее содержание и концентрация гемоглобина в эритроците были достоверно выше, чем в контроле).

Таблица 3 Влияние соединения (I) на средние значения показателей периферической крови крыс на фоне интоксикации циклофосфаном Группа RBC НСТ WBC HGB PLT MCV RDW% MPV МСН МСНС контроль 5,06±0,21 28,0±1,2 0,9±0,1 15,5±0,8 93,9±8,4 55,3±1,0 10,2±0,4 8,8±0,01 30,6±0,6 55,5±0,6 (I) 5,34±0,20 30,2±1,0 1,5±0,1* 16,6±0,7 107,9±9,6 55,0±0,5 10,8±0,6 8,7±0,04 31,3±0,3 56,4±0,6 ДКВ 4,19±0,20* 22,6±0,9* 1,4±0,2 14,2±0,6 88,3±8,9 55,3±0,8 10,2±0,6 8,3±0,1* 33,9±0,3* 61,3±0,8* Норма 6,87±0,14 38,7±0,7 17,0±0,9 19,7±0,6 257,0±21,2 57,1±0,9 13,3±0,7 9,0±0,1 29,7±0,5 52,0±0,4 * Р<0,05 - различия с контролем достоверны
RBC - количество эритроцитов, НСТ - гематокрит, WBC - количество лейкоцитов, HGB - гемоглобин, PLT - тромбоциты, MCV - средний объем эритроцитов, RDW% - процент распределения по абсолютному весу красной крови, MPV - объем тромбоцитов.

На фоне вызванной циклофосфаном нейтропении в группах наблюдался умеренный лимфоцитоз. Под действием соединения (I) и ДКВ у животных развился относительный (статистически недостоверный) моноцитоз, который был более выражен в референс-группе.

Таблица 4 Влияние соединения (I) на средние значения показателей лейкоцитарной формулы крови крыс на фоне интоксикации циклофосфаном Группа эозинофилы п/ядерные с/ядерные моноциты лимфоциты контроль 0 0 1,43±0,48 2,43±0,81 96,14±0,51 (I) 0 0 1,14±0,51 3,71±0,42 95,14±0,40 ДКВ 0 0 0,71±0,29 4,71±0,47 94,57±0,48 Норма 0,86±0,46 0 19,29±1,44 7,14±1,06 72,61±1,44

Таким образом, показано, что соединение (I) при внутрижелудочном введении в дозе 100 мг/кг на фоне гемодепрессии, вызванной введением циклофосфана, превосходит ДКВ по гемостимулирующему действию.

Источники информации

1. М.Д. Машковский. Лекарственные средства, в двух томах, изд. «Торсинг», Харьков, 1998, т.2, 55.

2. Лекарственные препараты, разрешенные к применению в СССР. Под ред. М.А. Клюева, Э.А. Бабаяна. М.: Медицина, 1979, с.61-65.

3. М.Б. Плотников, Н.А. Тюкавкина, Т.М. Плотникова. Лекарственные препараты на основе диквертина. Томск. Изд-во Томского университета. 2005, 228 с.

4. М.Л. Гершанович, В.А. Филов, М.А. Акимов, А.А. Акимов. Введение в фармакотерапию злокачественных опухолей. СПб. Изд-во Сатис, 1999, 152 с.

5. В.А. Тутельян, М.М. Гаппаров, Л.Ю. Телегин, В.М. Девиченский, Л.А. Певницкий, Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003. Т.136. №12. С.604-607.

6. Т.Г. Толстикова, И.В. Сорокина, Т.В. Воевода, С.В. Чернов, Э.Э. Шульц, Г.А.Толстиков. Доклады академии наук. 2001. Т.376. №1. С.271-273.

7. Клок Д.А., Шакиров М.М., Гришко В.В., Ралдугин В.А. Известия АН. Серия химическая. 1995. №11. С.2514-2517.

8. Т.Г. Толстикова, И.В. Сорокина, М.П. Долгих, Ю.В. Харитонов, С.В. Чернов, Э.Э. Шульц, Г.А. Толстиков. Химико-фармацевтический журнал. 2004. Т.38. №10. С.13-15.

9. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: Медицина, 2005, 832 с.

10. Камышников B.C. Справочник по клинико-химической лабораторной диагностике. Минск: Беларусь, 2000. Т.2, с.207.

Изобретение относится к (Z)-метил-16-(Z-оксо-2-фенил-оксазол-4-илиденметил)-15,16-эпокси-8(17),13(16),14-лабдатриен-18-оату формулы (I),

Соединение (I) обладает высокой антиоксидантной, гепатопротекторной и гемостимулирующей активностью и может быть использовано для коррекции системных побочных эффектов, возникающих при применении высокотоксичных лекарственных препаратов, используемых в противоопухолевой терапии. 4 табл.

(Z)-Метил-16-(5-оксо-2-фенил-оксазол-4-илиденметил)-15,16-эпокси-8(17),13(16),14-лабдатриен-18-оат формулы (I),

обладающий антиоксидантной, гепатопротекторной и гемостимулирующей активностью.