СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ НАСТУПЛЕНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ В ПРОГРАММЕ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ И ПЕРЕНОСА ЭМБРИОНОВ В СТАНДАРТНОМ ДЛИННОМ ПРОТОКОЛЕ СТИМУЛЯЦИИ СУПЕРОВУЛЯЦИИ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/74 

Изобретение относится к медицине, в частности к гинекологии.

Несмотря на разрабатываемые более 30 лет методы вспомогательных репродуктивных технологий, эффективность даже наиболее действенного метода экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов (ЭКО и ПЭ) оставляет желать лучшего: частота имплантации достаточно низка - 25-35% по данным European IVF-Monitoring Program, 2005.

Общепринятые прогностические факторы успеха экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов хорошо известны и включают в себя:

- Возраст пациентки. Большое количество работ демонстрируют резкий спад эффективности программы с каждым годом после 35 лет (Centers for Disease Control and Prevention, ASRM, 2003).

- Фолликулярный резерв яичников, оцениваемый по числу антральных фолликулов в яичниках при ультразвуковом исследовани или по уровню антимюллеровского гормона. Во многих исследованиях показано снижение результативности программы в 2-3 раза у пациенток с бедным ответом яичников на стимуляцию гонадотропинами (Hendriks DJ et al., Reproductive biomedicine online 2008 Nov; 17(5):727-36).

- Курение. Для курильщиц требуется примерно в 2 раза больше попыток экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов для достижения желаемого результата (Freour T et al., Reproductive Biomedicine Online 2008 Jan; 16(1):96-102).

- Ожирение. Пациенткам, страдающим ожирением, для достижения беременности в среднем требуется проведение большего количества циклов экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов (Orvieto R et al., Reproductive Biomedicine Online 2009 Mar; 18(3):333-6).

Для некурящих пациенток моложе 35 лет, не страдающих ожирением и имеющих нормальный фолликулярный резерв, прогнозировать результаты экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов также весьма затруднительно. В связи с этим разрабатываются более сложные методы прогнозирования, которые нуждаются в дальнейших исследованиях и доработке.

Известны способы прогнозирования результатов ЭКО и ПЭ, включающие определение уровня интерлейкинов 12, 15, 18 и клеток-натуральных киллеров CD56+ в биоптате эндометрия или смывах из полости матки (Ledee-Bataille et al., Fertility Sterility 2005 Mar; 83(3):598-605), определение уровня интегрина αVβ3 в биоптате эндометрия (Tei et al., Journal of Assistant Reproduction and Genetics 2003 Jan; 20(1):13-20), определение уровня матриксных металлопротеиназ 2 и 9, интерлейкинов 1 и 10, а также гамма-интерферона в смывах из полости матки (Inagaki et al., Human Reproduction 2003 Mar; 18(3):608-15). Также было предложено определение уровня матриксной РНК эндометриальной ароматазы Р450 в биоптате эндометрия (Brosens et al., Human Reproduction 2004 Feb; 19(2):352-6). Недостатками методов являются их инвазивность, а именно забор биоптата или смыва из полости матки, а также сложность интерпретации результатов при проведении анализа смыва из полости матки.

Известно также, что по содержанию рецепторов эстрадиола и прогестерона в мононуклеарной фракции клеток периферической крови может быть проведена диагностика эстроген- и прогестеронзависимой патологии гениталий (RU 2312354 С1, 10.12.2007). Однако сведения о значении этих показателей для прогнозирования наступления беременности при экстракорпоральном оплодотворении в литературе отсутствуют.

В качестве прототипа нами выбран способ прогнозирования наступления беременности в длинном протоколе ЭКО и ПЭ путем определения экспрессии цитокинов Т-хелперного звена лимфоцитами периферической крови пациенток (Kwak-Kim JY et al., Increased Т helper 1 cytokine responses by circulating Т cells are present in women with recurrent pregnancy losses and in infertile women with multiple implantation failures after IVF, Human Reproduction 2003 Apr; 18(4):767-73). Недостатком метода является его многокомпонентность: необходимость отдельного определения фракций лимфоцитов, а затем их функциональной активности по уровню экспресии ими различных цитокинов и, как следствие, его высокая стоимость, а также невысокая точность.

Нами была поставлена задача: создать информативный неинвазивный способ прогнозирования наступления беременности в программе ЭКО и ПЭ в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции.

Технический результат заключается в обеспечении простоты исследования, снижении его стоимости, повышении достоверности прогнозирования за счет учета объективного показателя, косвенно характеризующего гормональный статус эндометрия пациенток, путем определения уровня рецепторов прогестерона в мононуклеарной фракции клеток периферической крови перед началом лечения.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Перед программой ЭКО и ПЭ в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции у пациентки выполняют исследование гормонального статуса - определяют содержание рецепторов прогестерона в мононуклеарной фракции клеток периферической крови. При этом содержание рецепторов прогестерона в мононуклеарной фракции клеток периферической крови определяют в середине лютеиновой фазы менструального цикла пациентки, перед назначением агониста гонадотропин-релизинг гормона при проведении лечения по стандартному длинному протоколу стимуляции суперовуляции. При величине более 700 рецепторов прогестерона на клетку прогнозируют наступление беременности в результате проведения программы ЭКО и ПЭ в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции.

Нами эмпирически установлено, что данный показатель оказался информативным прогностическим показателем наступления беременности в программе ЭКО и ПЭ в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции. Установленный нами показатель косвенно, но объективно оценивает гормональный статус эндометрия пациентки, который представляет собой фактор, определяющий наступление беременности. Данный показатель позволяет с большой долей вероятности прогнозировать готовность эндометрия организма женщины к имплантации эмбриона.

Предлагаемый способ прост, так как предполагает учет только одного показателя, причем получение исследуемого материала (периферическая кровь) не связано с проведением инвазивных процедур.

Способ осуществляется следующим образом.

Для определения содержания рецепторов прогестерона в мононуклеарной фракции клеток периферической крови может быть использована методика, приведенная в описании к патенту (RU 2312354 С1, 10.12.2007).

Мононуклеарные клетки периферической крови выделяют стандартным методом [Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Lab. Investig. - 1968. - Vol.21 - Suppl. 97. p.1-9] из гепаринизированной крови (7-10 ME гепарина/мл) с модификациями. Кровь разводят физиологическим раствором (pH 7,2) в соотношении 1:2. Разведенную физиологическим раствором кровь (5 мл) наслаивают на подогретый до комнатной температуры фиколл (Pharmacia Fine Chemicals, Швеция, плотность 1, 077 г/мл, 3 мл в центрифужной пробирке) и центрифугируют при 400g в течение 30 мин 4°C [Хейфиц Л. Б., Абалкин В.А. Разделение форменных элементов крови человека. // Ж. Лаб. дело, 1973. - 10. - с.579-581].

Интерфазу отбирают стерильной стеклянной пипеткой и полученную мононуклеарную фракцию трижды отмывают бесцветным раствором Хенкса (клетки ресуспендируют в десятикратном объеме раствора Хенкса и центрифугируют 5 минут при 250 g). Последний осадок поднимают в 1 мл среды и подсчитывают в камере Горяева. После подсчета разводят средой до концентрации клеток 500 млн /100 мкл. Жизнеспособность клеток, определяемая по методу окрашивания с трипановым синим (Ланг Н.Р. Стимуляция лимфоцитов. // М.: Медицина, 1976. - 288 с.), составила 96%.

Методика определения рецепторов прогестерона в мононуклеарных клетках крови основана на известном методе определения указанных рецепторов в цитозольной фракции миоутероцитов [Бассалык. «Рецепторы стероидных гормонов в опухолях человека». М.: Медицина, 1987, стр.198-202]. Временные и концентрационные параметры насыщения связывания метки подобраны экспериментально. Для количественного определения рецепторов прогестерона в мононуклеарных клетках готовят стерильный пластиковый планшет (96 круглодонных лунок): во все рабочие лунки вносят по 10 мкл спиртового раствора ³Н-прогестерона или ³Н-эстрадиола («Amersham» GB) из расчета получения в инкубационной среде конечных концентраций 20 и 5 нМ соответственно. С целью ингибирования специфического связывания стероидов используют двухсоткратный избыток немеченого прогестерона («Merck» Германия), который в спиртовом растворе вносят в лунки по стандартной схеме. 200-кратный избыток дексаметазона («Merck» Германия) добавляют в рабочие лунки с целью подавления перекрестного связывания глюкокортикоидов с рецепторами прогестерона. После внесения в лунки спиртовых растворов указанных стероидов спирт выпаривают в токе азота. За 30 минут до инкубации в лунки вносят по 50 мкл среды Хенкса. Во все подготовленные лунки планшета вносят по 50 мкл суспензии мононуклеарных клеток (500 млн клеток/100 мкл) и инкубируют 60 минут - для рецепторов прогестерона при комнатной температуре. Для отделения несвязанной метки ресуспендированные клетки фильтруют через стеклянные фильтры (Whatman Glass Micro Fiber Filter GF/B - 25 mm dia.), которые отмывают 100-кратным избытком ледяного Хенкса и помещают в сцинтилляционные флаконы. После выпаривания фильтры заливают 5 мл сцинтилляционной жидкости и через 60 минут радиометрируют. Все исследования проводят в триплетах.

Подсчет специфического связывания производят по формуле:

[(T-NSB)*k/n]*N,

где T - общее связывание, NSB - неспецифическое связывание, n - количество клеток в лунке, k - коэффициент пересчета cpm в фемтомоли ³H-стероида, N - число Авагадро.

Определение рецепторов прогестерона осуществляют в середине лютеиновой фазы менструального цикла пациентки, непосредственно перед назначением агониста гонадотропин-релизинг гормона, предусмотренным при проведении лечения по стандартному длинному протоколу стимуляции суперовуляции в программе ЭКО и ПЭ. В соответствии с данным протоколом стимуляции суперовуляции могут быть использованы, например, следующие агонисты гонадотропин-релизинг гормона: трипторелин, гозерелин, бусерелин.

При содержании рецепторов прогестерона более 700 рецепторов прогестерона на клетку прогнозируют наступление беременности в результате проведения программы ЭКО и ПЭ в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции.

Представляем данные, подтверждающие возможность реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата.

Приводим конкретные примеры осуществления заявленного способа.

Пример №1. Больная В. 27 лет повторно обратилась в отделение экстракорпорального оплодотворения Центра планирования семьи и репродукции №1 в октябре 2006 г. с диагнозом: бесплодие вторичное длительностью 5 лет, мужской фактор, трубно-перитонеальный фактор для проведения второй попытки экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов. В анамнезе 1 неудачная попытка экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов по короткому протоколу с антагонистами гонадотропин релизинг гормонов в августе 2006 г. При ультразвуковом исследовании органов малого таза констатирован нормальный фолликулярный резерв, в последующем при пункции было получено 14 ооцитов. На 21-й день менструального цикла (в середине лютеиновой фазы), перед назначением пациентке агониста гонадотропин-релизинг гормона - ежедневных подкожных инъекций Диферелина 0,1, был произведен забор периферической крови из кубитальной вены для определения уровня рецепторов прогестерона в мононуклеарной фракции клеток периферической крови, который составил 20545 рецепторов на клетку.

Таким образом, результаты исследования рецепторного профиля клеток мононуклеарной фракции периферической крови, позволили нам предположить благоприятный для данной пациентки прогноз на наступление беременности в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции в программе ЭКО и ПЭ, что подтвердилось в последующем: после переноса в полость матки двух эмбрионов хорошего качества наступила одноплодная беременность, завершившаяся срочными родами и рождением живой доношенной девочки.

Аналогичные положительные результаты были получены у 18 (из 24 забеременевших) пациенток.

Пример №2. Больная К. 31 года первично обратилась в отделение экстракорпорального оплодотворения Центра планирования семьи и репродукции №1 в октябре 2007 г. с диагнозом: бесплодие вторичное длительностью 7 лет, трубно-перитонеальный трубный фактор для проведения первой попытки экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов. При ультразвуковом исследовании органов малого таза констатирован нормальный фолликулярный резерв, в последующем при пункции было получено 16 ооцитов. На 20-й день менструального цикла (в середине лютеиновой фазы), перед назначением пациентке агонистов гонадотропин-релизинг гормона: ежедневных подкожных инъекций Диферелина 0,1, был произведен забор периферической крови из кубитальной вены для определения уровня рецепторов прогестерона в мононуклеарной фракции клеток периферической крови, который составил 574 рецептора на клетку. Таким образом, результаты исследования рецепторного профиля в мононуклеарной фракции клеток периферической крови позволили нам предположить неблагоприятный для данной пациентки прогноз на наступление беременности в длинном стандартном протоколе стимуляции суперовуляции в программе ЭКО и ПЭ. Это подтвердилось в последующем: беременность не наступила, несмотря на селективный перенос на 5-е сутки 2-х эмбрионов хорошего качества в полость матки.

Аналогичные отрицательные результаты были получены у 13 (из 16 не забеременевших) пациенток.

Таким образом, при использовании предложенного способа у 40 пациенток моложе 39 лет была подтверждена его высокая точность и возможность использования для целей прогнозирования наступления беременности. Прогноз был подтвержден у 31 пациенки, т.е. в 77,5% случаев.

Изобретение относится к медицине, в частности к гинекологии, и касается способа прогнозирования наступления беременности в результате лечения пациенток в стандартном длинном протоколе ЭКО и ПЭ. Сущность способа заключается в том, что перед программой ЭКО и ПЭ в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции у пациентки выполняют исследование гормонального статуса - определяют содержание рецепторов прогестерона в мононуклеарной фракции клеток периферической крови. При этом содержание рецепторов прогестерона в мононуклеарной фракции клеток периферической крови определяют в середине лютеиновой фазы менструального цикла пациентки, перед назначением агониста гонадотропин-релизинг гормона при проведении лечения по стандартному длинному протоколу стимуляции суперовуляции. При величине более 700 рецепторов прогестерона на клетку прогнозируют наступление беременности в результате проведения программы ЭКО и ПЭ в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции. Способ обеспечивает простоту исследования, снижение его стоимости, повышение достоверности прогнозирования за счет учета объективного показателя, косвенно характеризующего гормональный статус эндометрия пациенток, путем определения уровня рецепторов прогестерона в мононуклеарной фракции клеток периферической крови перед началом лечения.

Способ прогнозирования наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции, отличающийся тем, что исследуют гормональный статус пациентки, для чего в середине лютеиновой фазы менструального цикла пациентки, перед назначением агониста гонадотропин-релизинг гормона при проведении лечения по стандартному длинному протоколу стимуляции суперовуляции, определяют содержание рецепторов прогестерона в мононуклеарной фракции клеток периферической крови и при величине более 700 рецепторов прогестерона на клетку прогнозируют наступление беременности в результате проведения программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции.