Способ прогнозирования наступления беременности у женщин с «бедным» ответом с использованием сыворотки крови Российский патент 2024 года по МПК G01N33/50 A61B5/00 

Область применения

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования исхода экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и переноса эмбрионов (ПЭ) в свежем цикле у женщин с «бедным» ответом на овариальную стимуляцию. Способ позволяет прогнозировать возможность зачатия в текущем цикле ЭКО и целесообразность проведения повторных программ ЭКО с использованием собственных ооцитов пациентки.

Уровень техники

Согласно современной классификации, женщины старше 35 лет относятся к категории позднего репродуктивного возраста. В указанный период наблюдается естественное снижение фертильности и, как следствие, сокращение вероятности наступления беременности посредством экстракорпорального оплодотворения. Среди причин ухудшения исходов ЭКО - снижение овариального резерва и «бедный» ответ яичников на контролируемую овариальную стимуляцию и гиперстимуляцию [1].

Данные, опубликованные в международных источниках литературы, свидетельствуют о том, что среди всех пациенток, включенных в программы вспомогательных репродуктивных технологий, диагноз «бедный овариальный ответ» имеет порядка трети женщин [2]. Частота наступления беременности в таком случае составляет от 7,6 до 20%, при этом от 12% до 30% программ может быть прекращено из-за отсутствия ооцитов или пригодных к переносу эмбрионов [3].

Поскольку низкая эффективность протоколов ЭКО в когорте пациенток с низким овариальным резервом (и, соответственно, «бедным» ответом на контролируемую стимуляцию овуляции) связана с получением малого количества ооцитов, проведение последующих программ ЭКО с собственным биологическим материалом таких женщин далеко не всегда становится целесообразным. Использование общепринятых прогностических факторов успешной имплантации, таких, как возраст, овариальный резерв, наличие очагов эндометриоза, оперативные вмешательства на органах малого таза, онкологические заболевания в анамнезе и т.п., не всегда позволяют определить результативность конкретного используемого протокола, что диктует необходимость разработки новых методов прогнозирования наступления беременности, включающих маркеры нарушения процессов роста фолликулов и созревания яйцеклетки [4]. В связи с этим проведение исследований, направленных на разработку методов прогнозирования эффективности программ ВРТ у пациенток с бедным ответом на стимуляцию овуляции имеет высокую медико-экономическую и социальную значимость.

По данным отечественных и зарубежных авторов, негативное влияние на рост фолликулов, созревание яйцеклеток, оплодотворение и развитие эмбриона оказывает среди прочего окислительный стресс, снижение антиоксидантного потенциала различных биологических жидкостей, нарушение регуляции сосудистого тонуса и процессов ангиогенеза [5]. Оценка овариального резерва в совокупности с определением уровня отдельных регуляторных факторов в различных биологических жидкостях дают возможность прогнозировать результат лечебных циклов вспомогательных репродуктивных технологий и определять дальнейшую тактику преодоления бесплодия.

В настоящее время имеется большое количество способов, позволяющих прогнозировать вероятность исхода ЭКО и ПЭ посредством инвазивных и малоинвазивных процедур и лабораторных исследований разного уровня сложности. В качестве предикторов наступления беременности при «бедном» ответе яичников на стимуляцию в цикле ЭКО рассматриваются различные молекулярно-биологические факторы, среди которых в результате патентного и научного поиска выделены следующие.

1. Известен способ прогноза результата ЭКО и ПЭ, при котором сначала производят сбор анамнестических данных, затем выполняют гинекологическое ультразвуковое исследование. Далее производят соскоб буккального эпителия для выявления мутации гена метилентетрагидрофолатредуктаза (MTFHR) в позиции С677Т. Полученные результаты вводят в формулу для вычисления прогностического индекса: Р = 0,06×Х1 + 0.58×Х2 + 0.66×Х3 - 1.12×Х4 + 1.1×Х5 + 1.0×Х6-2,31, где X1 - возраст - полных лет, Х2 - заболевания, передающиеся половым путем, в анамнезе (если было - 1, если не было - 0), Х3 - удаление одной или обеих труб в анамнезе (если было - 1, если не было - 0), Х4 - прерывание беременности в анамнезе (если было - 1, если не было - 0), Х5 - снижение овариального резерва по данным УЗИ (если есть - 1, если нет - 0), Х6 - мутация гена MTFHR С677Т (если есть - 1, если нет - 0). В случае, если значение Р более 0,11, прогнозируют отсутствие беременности. При значении Р менее -0,21 судят о благоприятном исходе ЭКО и ПЭ. При значении Р в интервале значений [-0,21 … 0,11] прогноз неопределенный.

Недостатки указанного способа заключаются, в первую очередь, в необходимости наличия специализированного оборудования для изучения полиморфизмов отдельно взятых генов. Кроме того, данный способ предполагает отсутствие априорной информации о состоянии овариального резерва пациенток, поэтому включает в себя дополнительно этап ультразвукового исследования [патент RU 2476142].

2. Известен способ прогнозирования наступления беременности, при котором осуществляется трансвагинальная пункция преовуляторных фолликулов (от 2 до 11 у одной пациентки) под контролем УЗИ с последующим исследованием полученной ФЖ, в которой обнаружен ооцит. Определяют свободнорадикальную активность образцов: при показателях общей антиоксидантной активности ниже 0,05 вероятность наступления беременности - более 50%, при показателях общей антиоксидантной активности 0,05 и выше - прогнозируется неблагоприятный исход [патент РФ № 2357673].

К недостаткам метода относится невысокая предикторная ценность способа. Метод является трудозатратным в силу того, что оценивается ФЖ. Кроме того, непонятно, оценивается ли пул ФЖ или биоматериал отдельных фолликулов.

3. Известен способ прогнозирования наступления беременности в протоколе ЭКО и ПЭ, который заключается в определении уровня экспрессии прогестерон-индуцированного блокирующего фактора (PIBF) в клетках мононуклеарной фракции периферической крови пациенток с бесплодием перед лечением. В случае значений мРНК PIBF в мононуклеарах крови более 0,4 у.е. прогнозируется высокая вероятность наступления беременности после ЭКО и ПЭ в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции [патент RU 2670450].

Недостаток метода заключается в возможности его применения только в стандартном длинном протоколе стимуляции. Кроме того, такой метод может выполняться только в специализированных лечебно-профилактических учреждениях, оснащенных оборудованием для выделения различных фракций клеток и оптикой высокого разрешения.

4. Известен также способ прогнозирования степени риска отрицательных результатов ЭКО, в ходе которого выявляют уровень титра антител иммуноглобулина G к токсоплазменному антигену (IgGTOXO) в сыворотке крови женщины (в ед/мл) и количество предшествующих неудачных попыток (КПНП) ЭКО, а затем по формуле определяют коэффициент степени риска (КСР): КСР=IgGTOXO × (КПНП+1); и при КСР, равном 7-507, считают риск невынашивания беременности и отрицательных результатов ЭКО низким, при КСР 508-1647 - средним, а при КСР более 1648 - высоким [патент RU 2773798].

Недостаток метода заключается, главным образом, в его специфичности и ориентированности на клиническую группу пациенток, инфицированных токсоплазмозом и планирующих ЭКО.

Наиболее близким к патентуемому является способ определения готовности системы гемостаза женщин к наступлению беременности, при котором проводят дополнительные исследования: определение в сыворотке венозной крови на 20-24 день менструального цикла уровня сосудисто-эндотелиального фактора роста (СЭФР), гомоцистеина, эндотелина, ингибитора активации плазминогена первого типа (PAI-1), тканевого активатора плазминогена (t-PA). При нахождении показателей СЭФР в пределах 30-600 пг/мл, гомоцистеина 5-12 мкмоль/л, эндотелина 8-14 фмоль/мл, PAI-1 7-40 нг/мл, t-PA 5-12 нг/мл делают вывод о готовности системы гемостаза женщины для включения в программу ЭКО [патент RU № 2449274].

Недостатками способа являются его стоимость и трудозатратность, как следствие, недоступность во многих лабораториях. Кроме того, указанный метод позволяет определить лишь готовность пациентки к программе ЭКО, но не прогнозирует исход беременности.

Сущность изобретения

Задача изобретения заключается в разработке способа прогнозирования наступления беременности у женщин с «бедным» ответом в программах ЭКО и ПЭ.

Технический результат: сказанный способ позволяет прогнозировать возможность зачатия в текущем цикле ЭКО и целесообразность проведения повторных программ ЭКО с использованием собственных ооцитов пациентки.

Указанный технический результат достигается путем оценки данных анамнеза пациенток, показателей концентрации эндогенного нитрита (NO₂) и нитрата (NO₃) в сыворотке венозной крови, полученной в день трансвагинальной пункции и метода математического моделирования.

Заявляется способ прогнозирования наступления беременности у женщин с «бедным» ответом с использованием сыворотки крови, отличающийся тем, что на первом этапе осуществляется сбор анамнестических данных, включающих в себя сведения о предшествующих беременностях и родах, заболеваниях и оперативных вмешательствах, на втором этапе производят измерение концентрации оксида азота (NO₂(энд.) и NO₃) в сыворотке венозной крови, полученной на этапе пункции фолликулов.

Далее на основании полученных сведений рассчитывают прогностический индекс d по формуле:

d = 0,542 × X1 - 0,154 × X2 - 4,125 × X3 + 10,337 × X4 - 8,762 × X5 - 4,637, где значения Х соответствуют параметрам: X1 - концентрация NO₂( энд.) в сыворотке венозной крови, мкмоль/л; X2 - концентрация NO₃ в сыворотке венозной крови, мкмоль/л; X3 - роды в анамнезе (если были - 1, если не было - 0); X4 - спаечный процесс в полости малого таза в анамнезе (если был - 1, если не было - 0); X5 - гистероскопия в анамнезе (если была - 1, если не было - 0).

В случае, если d>0 прогнозируется наступление беременности в результате ЭКО и ПЭ, если d<0 прогнозируется невозможность наступления беременности с использованием собственных ооцитов пациентки в результате текущего и последующих циклов ЭКО и ПЭ.

На первом этапе исследования производится подробный сбор и изучение анамнеза пациенток, включающего в себя возраст, индекс массы тела, характер менструального цикла, сведения о перенесенных заболеваниях, беременности и родах, оперативных вмешательствах на органах малого таза (ОМТ).

На втором этапе исследования в день пункции фолликулов осуществляется забор венозной крови пациенток с целью иммунологического исследования. Для получения сыворотки используют стандартный протокол проведения процедуры центрифугирования (3000 об/мин в течение 15 мин). Сыворотку отделяют от эритроцитарной массы.

Содержание эндогенного нитрита (NO₂) и нитрата (NO₃) в сыворотке венозной крови определяли спектрофотометрическим методом, основанном на ферментном превращении нитрата в нитрит с участием нитрат-редуктазы в реакции Грисса, с помощью тест-систем «R&D Systems» (США).

С использованием полученных данных вычисляют прогностический индекс:

d = 0,542 × X₁ - 0,154 × X₂ - 4,125 × X₃ + 10,337 × X₄ - 8,762 × X₅ - 4,637,

где X₁ - измерение концентрации эндогенного нитрита NO₂ в сыворотке венозной крови, мкмоль/л;

X₂ - измерение концентрации эндогенного нитрата NO₃ в сыворотке венозной крови, мкмоль/л;

X₃ - роды в анамнезе (если были - 1, если не было - 0);

X₄ - спаечный процесс в полости малого таза в анамнезе (если был - 1, если не было - 0);

X₅ - гистероскопия в анамнезе (если была - 1, если не было - 0);

-4,637 = const.

При значениях d>0 - благоприятный прогноз, вероятно наступление беременности в результате ЭКО и ПЭ. Если d< - прогноз неблагоприятный, невозможность наступления беременности с использованием собственных ооцитов пациентки в результате текущего и последующих циклов ЭКО и ПЭ.

Чувствительность метода - 83,9% Специфичность - 93,5%, Эффективность - 88,7%.

Пример 1

Пациентка О., 38 лет. Проходила обследование и лечение по поводу вторичного бесплодия трубного генеза. Длительность бесплодия - 3 года. В анамнезе 2 цикла ЭКО, одна успешная беременность (роды в срок), спаечный процесс органов малого таза, тубэктомия в анамнезе, диагностическая лапароскопия и операции на яичниках. Пациентке была предложена процедура ЭКО и ПЭ. По результатам иммунологического исследования сыворотки венозной крови в день пункции фолликула получены следующие значения: концентрация NO₂(энд.) - 8,26 мкмоль/л; концентрация NO₃ - 2,42 мкмоль/л. Прогностический индекс: d = 10,312 (d>0 - благоприятный прогноз). В результате контролируемой овариальной стимуляции при трансвагинальной пункции получено 14 ооцит-кумулюсных комплексов (из них 11 зрелые). При ЭКО нормально оплодотворилось 8 ооцитов. Для дальнейшего переноса был использован 1 эмбрион, для заморозки и последующего криопереноса сохранены еще два. Спустя 14 дней после ПЭ выполнен анализ β-хорионического гонадотропина, положительный результат. Через 21 день после переноса зафиксирована клиническая беременность.

Пример 2

Пациентка Н., 39 лет. Проходила обследование и лечение по поводу первичного бесплодия (сочетанный фактор). Длительность бесплодия - 3 года. В анамнезе одна благополучная беременность (роды в срок), одна неразвивающаяся беременность до 12 недель с самопроизвольным выкидышем, спаечный процесс органов малого таза, гистероскопия- полипэктомия. Пациентке была предложена процедура ЭКО и перенос эмбриона. По результатам иммунологического исследования сыворотки венозной крови в день пункции фолликулов получены следующие значения: концентрация NO₂(энд.) - 2,8 мкмоль/л; концентрация NO₃ - 8,26 мкмоль/л. Прогностический индекс: d = - 2,812 (d<0 - прогноз неблагоприятный; невозможно наступление беременности в данном цикле ЭКО). При трансвагинальной пункции получено два зрелых ооцита, после оплодотворения 1 яйцеклетки, на 3-е сутки развития эмбрион был перенесен в полость матки - беременность не состоялась.

Таким образом, способ позволяет прогнозировать возможность наступления беременности в текущем цикле ЭКО и целесообразность проведения повторных программ ЭКО с использованием собственных ооцитов пациентки. Преимущество способа заключается в скорости, простоте и доступности процедур анализа сыворотки венозной крови, отсутствии необходимости забора ФЖ.

Источники информации:

1. Рудакова Е.Б. Можно ли помочь пациенткам старшей возрастной группы с реализацией репродуктивной функции в программах ЭКО и ПЭ в рамках государственной поддержки? / Е.Б. Рудакова, Е.А. Федорова, И.В. Сергеева // Медицинский совет. - 2018. - № 7. - С. 116-124.

2. Чайка В.К. Изменение качества ооцитов и состояние овариального резерва у женщин позднего репродуктивного периода. / В.К. Чайка, А.А. Железная, М.В. Попова // Медико-социальные проблемы семьи. - 2020. - Т. 25. - № 1.

3. Мальгина Г.Б. Особенности метаболизма и клеточного энергообмена у беременных старшего репродуктивного возраста при спонтанной и индуцированной беременности. / Г.Б. Мальгина [и др.] // Лечение и профилактика. - 2018. - № 2. - С. 38-43.

4. Ashrafi M., Arabipoor A., Yahyaei A., Zolfaghari Z., Ghaffariet F. Does the "delayed start" protocol with gonadotropin-releasing hormone antagonist improve the pregnancy outcome in Bologna poor responders? a randomized clinical trial. Reproductive Biology and Endocrinology. 2018; 16(1): 124. https://doi.org/10.1186/s12958-018-0442-y

5. Карбышев М.С., Абдуллаев Ш.П. Биохимия оксидативного стресса: учеб.-методич. пособие. - М.:ХХ. - 2018. – 60 с.

6. Бутин В.С., Немчинова О.В., Онищенко А.Ю. Некоторые аспекты регуляции фолликулогенеза в яичнике //Бюллетень Северного государственного медицинского университета. - 2018. - №. 1. - С. 285-286.

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования наступления беременности у женщин с «бедным» ответом яичников на контролируемую овариальную стимуляцию. На первом этапе осуществляется сбор анамнестических данных, включающих в себя сведения о предшествующих беременностях и родах, заболеваниях и оперативных вмешательствах. На втором этапе производят измерение концентрации оксида азота (NO₂(энд.) и NO₃) в сыворотке венозной крови, полученной на этапе пункции фолликулов. Далее на основании полученных сведений рассчитывают прогностический индекс d по формуле. Если d>0, прогнозируется наступление беременности в результате ЭКО и ПЭ. Если d<0, прогнозируется невозможность наступления беременности с использованием собственных ооцитов пациентки в результате текущего и последующих циклов ЭКО и ПЭ. Изобретение позволяет прогнозировать возможность зачатия в текущем цикле ЭКО и целесообразность проведения повторных программ ЭКО с использованием собственных ооцитов пациентки. 2 пр.

Способ прогнозирования наступления беременности у женщин с «бедным» ответом яичников на контролируемую овариальную стимуляцию, включающий забор и исследование сыворотки венозной крови, отличающийся тем, что на первом этапе осуществляют сбор анамнестических данных, включающих в себя сведения о предшествующих беременностях и родах, заболеваниях и оперативных вмешательствах, на втором этапе производят измерение концентрации эндогенного нитрита NO₂ и нитрата NO₃ в сыворотке венозной крови, полученной на этапе пункции фолликулов, далее на основании полученных сведений рассчитывают прогностический индекс d по формуле:
d = 0,542 × X1 − 0,154 × X2 − 4,125 × X3 + 10,337 × X4 − 8,762 × X5 − 4,637, где:

X1 – концентрация эндогенного нитрита NO₂ в сыворотке венозной крови, мкмоль/л;

X2 – концентрация нитрата NO₃ в сыворотке венозной крови, мкмоль/л;

X3 − роды в анамнезе, если были – 1, если не было – 0;

X4 − спаечный процесс в полости малого таза в анамнезе, если был – 1, если не было – 0;

X5 − гистероскопия в анамнезе, если была – 1, если не было – 0;

− 4,637 – постоянная величина;

если d>0, то прогнозируют наступление беременности с использованием собственных ооцитов пациентки в результате экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов,

если d<0, то прогнозируют невозможность наступления беременности в результате экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов.