СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТАДИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ ПО СТАБИЛЬНЫМ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИМ НАРУШЕНИЯМ В ЛИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ С СОЛИДНЫМИ ОПУХОЛЕВЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии.

Многочисленные цитогенетические исследования опухолевых клеток из операционного материала и лимфоцитов крови больных с солидными опухолями в 90-е годы XX века показали возможность определять по выявляемым цитогенетическим нарушениям риск развития злокачественного процесса, степень его злокачественности, его распространенность, ранний и отдаленный прогноз, диагноз заболевания и его стадию.

1. Emerson-JC; Salmon-SE; Dalton-W; McGee-DL; Yang-JM; Thompson-FH; Trent-JM. Cytogenetics and clinical correlations in breast cancer. Adv-Exp-Med-Biol. 1993; 330:107-18.

2. Mitelman F., Heim S. Clinical-cytogenetic correlations in solid tumors. In: Challenges of modern medicine. Precancerous Lesions: A multidisciplinary approach. Ares-Serono Symp Publ, Rome. 1993, pp.91-98.

3. Hagmar L., Brogger A., Hansteen I.-L. et al.: Cancer risk in humans predicted by increased levels of chromosomal aberrations in lymphocytes: Nordic Study Group on the health risk of chromosome damage. - Cancer Res. 1994, 54, 11, 2919-2922.

4. Bonassi S., Abbondaridolo A., Camurri L. et al. Are chromosome aberrations in circulating lymphocytes predictive of future cancer onset in humans? Preliminary results of an Italian cohort study. Cancer Genetics & Cytogenetics. 79(2):133-5, 1995.

5. Brooks SE. Cancer registries and chromosomes [editorial]. West Indian Medical Journal. 43(4):111, 1994 Dec. Oncogene. 10(5):827-33, 1995, Mar 2.

6. Mertens F., Johansson В., Hoglund M., Mitelman F. Chromosomal imbalance maps of malignant solid tumors: a cytogenetic survey of 3185 neoplasms. Cancer Research, 1997, 57, 2765-2780.

7. Mitelman F. Clinical impact of solid tumor сytogenetics. // International J. of Oncology, v.11, N4, 1997, p.110.

В этих исследованиях было показано, что риск развития злокачественного заболевания солидной природы возникает при появлении в организме клеток со стабильными цитогенетическими нарушениями, которых нет у практически цитогенетическими нарушениями характеризуется 3% клеток с хромосомными (Хр) и хроматидными разрывами у людей среднего возраста и 4,8±0,4% таких клеток у людей от 80 до 113 лет. Хроматидные и Хр разрывы являются нестабильными нарушениями. К нестабильным Хр нарушениям также относят ди- и трицентрики, которые нередко индуцируются при лучевой диагностике или терапии. Нестабильные Хр нарушения либо восстанавливаются, либо клетки с такими нарушениями гибнут и элиминируются. Степень злокачественности опухолевого заболевания определяется количеством клеток со стабильными структурными Хр нарушениями: клетки с делениями (del), транслокациями (t), с гомогенно-окрашенными районами Хр (ГОР), с инсерциями (ins), с изохромосомами (i), с инверсиями (inv), с двойными маленькими хромосомами (dm) или количеством клеток с геномными нарушениями: гиперанеуплоидные (гиперанеупл.), полиплоидные (полипл.) клетки и клетки с эндоредупликацией Хр (end). Небольшое количество полиплоидных клеток (в пределах 1-3%) свидетельствует о риске развития доброкачественного процесса, но большее их количество уже указывает на переход доброкачественного процесса в злокачественный. Клетки с end являются предшественниками злокачественных гиперанеуплоидных клеток, а их количество коррелирует с плохим клиническим прогнозом. (Dutrillaux-B; Gerbault-Seureau-M; Remvikos-Y; Zafrani-B; Prieur-M. Breast cancer genetic evolution: I. Data from cytogenetics and DNA content. Breast-Cancer-Res-Treat. 1991 Nov; 19(3):245-55).

Распространенность злокачественного процесса и его метастазирование определяется количеством клеток с dm и/или количеством гиперанеуплоидных клеток. Ранний прогноз злокачественного заболевания зависит от количества клеток с критериями метастазирования и клонирования, а также от появления клеток с end. Отдаленный прогноз опухолевого заболевания зависит от количества клеток со структурными Хр нарушениями стабильного типа, специфическими для данного заболевания, и появлением клеток со стабильными Хр нарушениями, неспецифическими для данного заболевания, которые могут быть началом развития опухолевого заболевания другого типа. Диагноз заболевания определяется только по клеткам с известными специфическими стабильными Хр нарушениями, которые входят в мировую базу цитогенетических нарушений, определяющих развитие определенных злокачественных заболеваний.

1. Mitelman F., Heim S. Clinical-cytogenetic correlations in solid tumors. In: Challenges of modem medicine. Precancerous Lesions: A multidisciplinary approach. Ares-Serono Symp Publ, Rome. 1993, pp.91-98.

2. Mitelman F. Catalog of chromosome aberrations in cancer. New York: Wiley-Liss, Inc., 1994, Ed.5, p.4252.

3. Mitelman F., Mertens F., Johansson B. A breakpoint map of recurrent chromosomal rearrangements in human neoplasia. Nat. Genet. l997, 15:417-474.

В данном исследовании такие клинические показатели, как риск развития злокачественного заболевания, степень его злокачественности, вероятность его метастазирования, ранний и отдаленный прогноз, диагноз заболевания определяли по цитогенетическим критериям, выявленным в лимфоцитах периферической крови пациентов с предварительным клиническим диагнозом - меланома кожи, поставленном при первичном внешнем осмотре пациента. Затем цитогенетически определяемые клинические показатели сравнивали с показателями, полученными после полного клинического обследования: УЗИ, рентгенологическое обследование, при необходимости компьютерная томография, гистологическое исследование операционного материала.

К настоящему времени установлено (Sandberg, 1994; Ghayee, Dinney, Pathak, 1997; Paia et al., 1998), что количественные и структурные Хр нарушения, характеризующие злокачественное заболевание солидной природы и выявленные у одного и того же больного в клетках первичной опухоли и в лимфоцитах периферической крови, идентичны.

1. Sandberg AA. Cancer cytogenetics for clinicians. Ca: a Cancer Journal for Clinicians. 44(3):136-59, 1994 May-Jun.

2. Ghayee H.K., Dinney C.P., Pathak S. Do lymphocytes contain chromosomal lesions that are also stable markers in cancer cells? Lymphocyte and tumor cell karyotyping in a melanoma patient. // International J. of Oncology: 1997, v.11, N4, p.

3. Paia S.A., Cheunga Mie-Chi P., Romsdahlb M.M., Multania A.S. and Pathak S. Can genetic instability be studied at the single chromosome level in cancer cells? Evidence from Human Melanoma Cells. Received 11 May, 1998; accepted 25 June, 1998. Available online 22 January, 1999.

В то же время известно, что метод цитогенетического исследования Хр нарушений в лимфоцитах крови имеет ряд преимуществ по сравнению с цитогенетическим исследованием клеток операционного или биопсийного материала. Так для цитогенетического исследования лимфоцитов крови необходимо всего 0.5-5 мл венозной крови, которую можно взять у пациента при первичном клиническом осмотре из пальца или из вены. Затем такое взятие крови можно повторять неоднократно во время лечения без ущерба для здоровья пациента, что позволяет прослеживать изменение стадии заболевания и контролировать эффективность применяемого лечения.

Однако для установления стадии онкологического заболевания по цитогенетическим нарушениям четкого подхода пока не имеется. Наиболее близким аналогом, взятым нами в качестве прототипа изобретения, является определение стадии злокачественного заболевания по общему количеству клеток с Хр нарушениями - стабильными и нестабильными, количественными и структурными.

1. S.Bonassi, H.Norppa, M.Ceppi, U.Stromberg, R.Vermeulen, et al. Chromosomal aberration frequency in lymphocytes predicts the risk of cancer: results from a pooled cohort study of 22358 subjects in 11 countries. Carcinogenesis, June 1, 2008; 29(6): 1178-1183.

Как показывает практика наших исследований, определение стадии злокачественного заболевания по цитогенетическим критериям зависит не от общего количества клеток с Хр нарушениями, а прежде всего от количества клеток со стабильными цитогенетическими нарушениями. Действительно, если у пациента выявлено всего 2-4% клеток с цитогенетическими нарушениями, то это еще не означает, что пациент практически здоров или у него развивается злокачественное заболевание. Главное - какой вид Хр нарушений имеется в этих аномальных клетках. При выявлении 1-2% клеток со стабильными цитогенетическими нарушениями: клеток с делециями - del, транслокациями - t, с гомогенно-окрашенными районами хромосом - ГОР, с инсерциями - ins, с изохромосомами - i, с инверсиями - inv, с двойными маленькими хромосомами - dm, гиперанеуплоидных, полиплоидных клеток или клеток с эндоредупликацией хромосом - end определяют 1-ую стадию злокачественного заболевания, при 4-6% таких клеток - II-ую стадию, при 8-10% - III-ю стадию, при 12 и более % - IV-ую, а при появлении в таких клетках маркеров метастазирования определяют и критерий отдаленного метастазирования - М: при 1-2% клеток с маркерами метастазирования соответственно - M1, при 4-6% - М2, при 8-10% - М3 и при 12 и более % клеток с маркерами метастазирования - М4.

Необходимо отметить, что выявление маркеров метастазирования в лимфоцитах периферической крови определяет именно отдаленное метастазирование, так как лимфоциты периферической крови являются моделью повреждения соматических клеток отдаленной локализации.

Сложным для определения стадии заболевания является неспецифический цитогенетический критерий - end, который, в то же время, в значительной степени влияет на развитие злокачественности опухолевого процесса, так как является предшественником образования злокачественных гиперанеуплоидных клеток. Наши исследования показывают, что количество клеток с end также коррелирует со стадией злокачественного заболевания.

Таким образом, стадия злокачественного заболевания зависит не от общего количества клеток с Хр нарушениями, а от количества клеток со стабильными Хр и геномными нарушениями.

Как показано в табл.1, стадия меланомы кожи, определенная по клиническим показателям, у многих пациентов оказывается ниже стадии, определенной по цитогенетическим критериям. Это, видимо, объясняется двумя причинами. Во-первых, физические методы исследования ниже по чувствительности цитогенетического - клеточного метода. Например, при высоком уровне клеток с end физические методы их «не видят», также «не видят» эти методы и небольшое количество других клеток со стабильными цитогенетическими нарушениями. Во-вторых, операционный материал, являясь локальным, не всегда полностью отражает всю картину заболевания, поэтому и гистологическое исследование «не видит» ранние признаки отдаленного метастазирования. В то же время более точное установление стадии заболевания имеет важное значение для определения тактики лечения первично обратившихся больных.

В связи с вышеперечисленным целью данного исследования было установление способа раннего определения стадии злокачественного заболевания солидной природы.

Технический результат настоящего изобретения состоит в наиболее раннем определении стадии злокачественного заболевания солидного типа (на этапе предварительного клинического диагноза) по количеству клеток со стабильными цитогенетическими нарушениями, выявляемых среди лимфоцитов периферической крови пациента.

Это достигается при количественном и качественном исследовании стабильных Хр и геномных нарушений в метафазных пластинках из лимфоцитов периферической крови пациента.

Данное исследование проведено у 25 пациентов с предварительным клиническим диагнозом - меланома кожи. Цитогенетическое обследование пациентов проводили по общепринятому международному методу с собственными модификациями.

1. Монахов А.С., Гуляев А.В. Цитогенетическое и медико-генетическое исследование в семьях с высокой предрасположенностью к развитию рака в желудочно-кишечном тракте. Вопросы онкологии, 1993, N4-6, T.39, c.184-188.

2. A.Monakhov, V.Semiglazov, T.Bregneva. Cytogenetic markers in 100% of blood lymphocytes in three members of the family with high predisposition to cancer development. "Journal of Experimental & Clinical Cancer Research", 1995, V.14, N3. p.265-269.

Цитогенетическое исследование заключалось в количественном и качественном анализе клеток с Хр и геномными нарушениями у каждого пациента. После полного клинического обследования: УЗИ, рентген (при необходимости компьютерная томография) и гистологическое исследование операционного материала по системе TNM (1997) была определена клиническая стадия заболевания у каждого пациента.

TNM Classification of Malignant Tumours. Fifth Edition. 1997. Zeneca. Oncology. A John Wiley & Sons, INC, Publication. New York, Chichester, Weinheim, Brisbane, Singapore, Toronto. 227 p.

Затем был проведен сравнительный анализ стадий онкологического заболевания, установленных у каждого пациента по цитогенетическим и клиническим показателям (табл.1).

Для лучшего понимания сущности изобретения и подтверждения критерия «промышленная применимость» приводим клинические примеры.

Пример 1. Пациентка Б.П.А, 75 лет, с предварительным диагнозом меланома кожи спины с признаками начального регионарного метастазирования была цитогенетически обследована (N6 по табл.). У нее было выявлено 1% гиперанеупл. клеток (кл.), 1% кл. с i 1q и 4% кл. с Хр разрывами. По этим данным была определена I стадия, M1. Гистологическое исследование определило поверхностно-распространяющуюся эпителиоидноклеточную меланому с большим количеством пигмента и умеренной лимфоидной инфильтрацией. III уровень инвазии по Кларку. pT2N0M0, I стадия.

Пример 2. Пациентка Г.Н.П., 36 лет (N23 по табл.) с предварительным клиническим диагнозом меланома кожи передней брюшной стенки с начальными признаками регионарного метастазирования, цитогенетически было выявлено 2% гиперанеупл. кл. (трисомия 2 и 19 Хр) и 2% полипл. кл. По этим данным была определена II стадия, М1. При гистологическом исследовании операционного материала у нее была определена поверхностно-распространяющаяся эпителиоидноклеточная меланома, II уровень по Кларку, большое кол-во пигмента. pT1N0M0, I стадия.

Пример 3. У 20-летней пациентки С.О.В. (N19 по табл.1) с предварительным клиническим диагнозом местный рецидив меланомы кожи левого бедра с синхронно развившимися регионарными метастазами в левые паховые л/у, было выявлено 7.5% гиперанеупл. кл., 2.5% кл. со сложн. t и с Хр. разр., 10% кл. с дицентриками. По этим цитогенетическим данным была определена III стадия, М3. После операции гистологическое исследование определило у больной эпителиоидноклеточную меланому кожи левого бедра. Прогрессирование процесса с поражением подвздошных забрюшинных л/у. III уровень инвазии по Кларку. Кроме того, кожно-рубцовый фиброматоз, но в одном из срезов в глубоких отделах подкожной жировой клетчатки микрометастазы меланомы и в 1 из 2 л/у метастазы меланомы с незначительным содержанием пигмента. pT2N0M0, 1 стадия.

Пример 4. У 49-летнего пациента Ш.В.А. (N1 по табл.1) с предварительным клиническим диагнозом меланома кожи левой подключичной области с признаками метастазов в шейные л/у слева, цитогенетически было выявлено 10% полипл. кл., 4% гиперанеупл. кл., 4% кл. с t (2q; ?), 2% кл. с дицентриками и 2% кл. с эндомитозом. На основании этих данных была установлена IV стадия, М2. Гистологическое исследование операционного материала определило эпителиоидноклеточную меланому с большим количеством пигмента и метастазами в 2 л/у, IV уровень по Кларку. T3N1M0, III стадия.

Пример 5. У 37-летнего пациента А.А.А. (N7 по табл.1) с предварительным клиническим диагнозом меланома кожи левой аксциллярной области без метастазов, цитогенетически было обнаружено 14% гиперанеупл. кл. и определена IV стадия, М4. Гистологическое исследование определило эпителиоидноклеточную меланому, IV уровень инвазии по Кларку; лимфатические узлы без метастазов; меланома кожи левой аксциллярной области без метастазов. pT3N0M0, II стадия.

Табл.1 Стадии заболевания, определенные у больных меланомой кожи, по цитогенетическим и клиническим критериям Номера пациентов по порядку их обследования Значения стадии меланомы кожи у каждого пациента, определенные по стабильным цитогенетическим нарушениям после предварительного клинического диагноза Значения стадии меланомы кожи у этих же пациентов, определенные на основании полного клинического обследования по системе TNM (данные из истории болезни) Совпадения или различия показателей стадий, определенных по цитогенетическим и клиническим критериям 1 2 3 4 1 Стадия IV, М2 pT3N1M0, III стадия Выше по цитогенетическим критериям 2 Стадия III, М2 pT4N0M0, III стадия Совпадение кроме показателя М 3 Стадия IV, М4 pT4N0M0, III стадия Выше по патогенетическим критериям 4 Стадия III, М3 pT4N0M0, III стадия Совпадение кроме показателя М 5 Стадия III, М3 pT2N0Mo, I стадия Значительно выше по цитогенетическим критериям 6 Стадия I, M1 pT2N0M0, I стадия Совпадение кроме показателя М 7 Стадия IV, М4 pT3N0M0, II стадия Значительно выше по цитогенетическим критериям 8 Стадия III, М2 pT4N0M0, III стадия Совпадение кроме показателя М 9 Стадия III, М3 pT3N0M0, II стадия Выше по цитогенетическим критериям 10 Стадия I, M1 pT3N0M0, II стадия Выше по клиническим показателям кроме М 11 Стадия II, М2 pT2N0M0, I стадия Выше по цитогенетическим критериям 12 Стадия II, M1 pT2N0M0, I стадия Выше по цитогенетическим критериям 1 2 3 4 13 Стадия III, М2 pT4NlM0, III стадия Совпадение кроме показателя М 14 Стадия IV, M3 pT3N0M0, II стадия Выше по цитогенетическим критериям 15 Стадия IV, М3 pT4N0M0, III стадия Выше по цитогенетическим критериям 16 Стадия III, М3 pT2N0M0, I стадия Значительно выше по цитогенетическим критериям 17 Стадия IV, М3 pT2N0M0, I стадия Значительно выше по цитогенетическим критериям 18 Стадия IV, М3 pT2N0M0, I стадия Значительно выше по цитогенетическим критериям 19 Стадия III, М3 pT2N0M0, I стадия Значительно выше по цитогенетическим критериям 20 Стадия IV, М4 pT1N0M0, I стадия Значительно выше по цитогенетическим критериям 21 Стадия II, М2 T0N2aM0, III стадия Выше по клиническим показателям кроме М. 22 Стадия II, M1 pT1N0M0, I стадия Выше по клиническим показателям кроме М 23 Стадия I, M1 T3aN0M0, II стадия Выше по клиническим показателям кроме М 24 Стадия I, M1 pT2N0M0, I стадия Совпадение кроме показателя М 25 Стадия I, M1 T2N0M0 - I стадия Совпадение кроме показателя М

Как видно из табл.1, при цитогенетическом определении стадии меланомы кожи у всех пациентов без исключения прежде всего отмечен тот или иной уровень отдаленного метастазирования, а при клиническом определении стадии этого заболевания у каждого из тех же пациентов отдаленного метастазирования не было отмечено ни у одного. В то же время процесс отдаленного метастазирования проявился со временем на разном уровне у всех обследованных пациентов. Кроме того, показатель стадии, определенный цитогенетически у 14 пациентов из 25, был выше, чем определенный при полном клиническом обследовании, причем у 7 пациентов из этих 14 этот показатель значительно был выше, чем определенный клинически. Лишь у 4-х пациентов из 25 показатель стадии заболевания был выше по некоторым клиническим критериям, но с учетом не выявленных клинически критериев метастазирования у этих пациентов, которые были выявлены цитогенетически, показатель стадии более значим при цитогенетическом его определении. Также показатель стадии, установленный цитогенетически у 7 из 25 пациентов и совпавший с установленным клинически, тоже был более значим клинического, так как при этом исследовании, как и у других пациентов, были выявлены критерии метастазирования, которые клинически у этих 7 пациентов обнаружены не были.

Таким образом, проведенное исследование показало возможность определения стадии онкологического заболевания солидной природы по стабильным структурным Хр и геномным нарушениям, выявляемым в лимфоцитах периферической крови пациентов цитогенетическим методом на этапе предварительной диагностики до начала их полного клинического обследования. Кроме того, так как цитогенетический метод исследования Хр и геномных нарушений, используемый в данной работе, не является инвазивным, то такое исследование может проводиться неоднократно, на любом этапе лечения пациента, что позволяет прослеживать изменение стадии заболевания под влиянием лечения и определять эффективность применяемого лечения. Также это исследование подтвердило международные данные о возможности наиболее ранней характеристики злокачественного заболевания по цитогенетическим критериям: установление его злокачественности, вероятности метастазирования и его уровня, определение раннего и отдаленного прогнозов и во многих случаях - его диагноза.

Изобретение относится к области онкологии, а именно цитогенетической диагностики. Предложен способ раннего определения стадии злокачественного заболевания солидного типа (на этапе предварительного клинического диагноза) по количеству клеток со стабильными цитогенетическими нарушениями, выявляемыми среди лимфоцитов периферической крови пациента при количественном и качественном исследовании стабильных хромосомных и геномных нарушений в метафазных пластинках из лимфоцитов периферической крови пациента. Способ позволяет прослеживать изменение стадии заболевания под влиянием лечения и определять эффективность применяемого лечения. 1 табл.

Способ определения стадии злокачественного заболевания по стабильным цитогенетическим нарушениям в лимфоцитах периферической крови у больных с солидными опухолевыми заболеваниями, отличающийся тем, что при выявлении клеток со стабильными цитогенетическими нарушениями: клеток с делениями - del, транслокациями - t, с гомогенно-окрашенными районами хромосом - ГОР, с инсерциями - ins, с изохромосомами - i, с инверсиями - inv, с двойными маленькими хромосомами - dm, гиперанеуплоидных, полиплоидных клеток и клеток с эндоредупликацией хромосом - end при 1-2% таких клеток определяют 1-ю стадию злокачественного заболевания, при 4-6% таких клеток - 11-ю стадию, при 8-10% - III-ю стадию, при 12 и более % - IV-ю, а при появлении в таких клетках маркеров метастазирования определяют и критерий отдаленного метастазирования - М: при 1-2% клеток с маркерами метастазирования соответственно - M1, при 4-6% - М2, при 8-10% - М3 и при 12 и более % клеток с маркерами метастазирования - М4.