СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ИЗ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/48 A61K35/14 

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической лабораторной диагностике и иммунологии, и предназначено для выделения чистой фракции нейтрофилов из периферической крови.

Существующие методики выделения нейтрофилов из периферической крови требуют предварительного получения лейкоцитарной взвеси, которая наряду с нейтрофилами содержит лимфоциты и моноциты [1]. Для этого необходимо 15 мл гепаринизированной (10-15 ЕД/мл гепарина) периферической венозной крови, которую с целью осаждения эритроцитов отстаивают в стерильной пробирке при температуре +37°С в течение 40-60 минут. Иногда для ускорения седиментации эритроцитов добавляется стерильный раствор желатина из расчета 1-2 капли на 10 мл крови. Нейтрофилы выделяют из лейкоцитарной взвеси на двойном градиенте плотности стерильных растворов фиколла-верографина. Плотность верхнего слоя градиента составляет 1,075-1,077, а нижнего - 1,093-1,095. Объем каждого градиента равняется 1,5 мл. Через 40 минут центрифугирования при 1500 об/мин на границе между градиентами появляется кольцо гранулоцитов с чистотой 98-100%. Кольцо нейтрофилов аккуратно собирают, переносят в стерильные центрифужные пробирки, трижды отмывают от градиента стерильным физиологическим раствором хлорида натрия центрифугированием при 1500 оборотах в минуту в течение 10 минут.

Предлагаемый нами способ позволяет выделять нейтрофилы из цельной крови. Для этого 2 мл цельной гепаринизированной (10-15 ЕД/мл гепарина) крови смешивается для снижения вязкости крови с 3 мл стерильного физиологического раствора и наслаивается на двойной градиент плотности стерильных растворов фиколла-верографина. Плотность верхнего слоя градиента составляет 1,075-1,077, а нижнего - 1,093-1,095. Объем каждого градиента равняется 2 мл. Через 40 минут центрифугирования при 1500 об/мин на границе между градиентами появляется кольцо гранулоцитов с чистотой 98-100%, эритроциты при этом осаждаются на дно пробирки. Кольцо нейтрофильных гранулоцитов также аккуратно собирают, переносят в стерильные центрифужные пробирки, трижды отмывают от градиента стерильным физиологическим раствором хлорида натрия центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут.

Целью заявляемого способа является уменьшение объема необходимой крови и ускорение процесса выделения нейтрофилов, позволяя повысить уровень жизнеспособных клеток, что является важным условием для изучения функциональной активности нейтрофилов.

Сущность предлагаемого способа заключается в использовании для выделения нейтрофилов малого количества цельной гепаринизированной венозной крови (2 мл) и сокращении времени методики за счет отсутствия этапа получения лейковзвеси.

Предлагаемый способ соответствует критерию «новизна», так как в отличие от имеющихся способов выделения нейтрофилов обладает следующими существенными отличительными признаками:

1. методика позволяет выделить нейтрофилы из малого объема крови (2 мл);

2. выделение нейтрофилов осуществляется из цельной крови, минуя стадию получения лейковзвеси, то есть сокращается время постановки методики;

3. увеличивается количество жизнеспособных клеток в связи с тем, что сокращается время выделения нейтрофилов и отсутствует активирующее воздействие желатина и температурного режима на этапе получения лейковзвеси.

Благодаря наличию указанных отличительных признаков в данном способе, а также использованию их в совокупности и в определенной последовательности действий можно сделать вывод о соответствии заявляемого способа изобретательскому уровню.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом:

1) 2 мл цельной гепаринизированной (10-15 ЕД/мл гепарина) крови смешивается для снижения вязкости крови с 3 мл стерильного физиологического раствора.

2) Смесь наслаивается на двойной градиент плотности стерильных растворов фиколла-верографина. Плотность верхнего слоя градиента составляет 1,075-1,077, а нижнего - 1,093-1,095. Объем каждого градиента равняется 2 мл.

3) Через 40 минут центрифугирования при 1500 об/мин на границе между градиентами появляется кольцо гранулоцитов с чистотой 98-100%, эритроциты при этом осаждаются на дно пробирки.

4) Кольцо нейтрофильных гранулоцитов аккуратно собирают, переносят в стерильные центрифужные пробирки, трижды отмывают от градиента стерильным физиологическим раствором хлорида натрия центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут.

5) Полученная клеточная взвесь состоит на 98-100% из нейтрофильных гранулоцитов и используется в исследованиях функциональной активности нейтрофилов.

При сравнении предлагаемого способа с прототипом (Долгушин И.И. Нейтрофильные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов. М.: Изд-во РАМН, 2009. С.122) имеются существенные отличия (табл.3).

Предлагаемым способом были выделены нейтрофильные гранулоциты из периферической крови 50 здоровых доноров, у которых была проведена оценка жизнеспособности при окраске трипановым синим. Полученные данные сравнили с жизнеспособностью нейтрофилов, выделенных из лейкоцитарной взвеси (табл. 1, 2).

Таблица 1 Сравнительный анализ жизнеспособности нейтрофильных гранулоцитов, выделенных различными способами (n=50, М±m) Показатель Нейтрофилы, выделенные из лейковзвеси Нейтрофилы, выделенные из цельной крови Трипанонегативные клетки, % 57,12±3,25 69,58±4,27* Трипанопозитивные клетки, % 43,12±3,29 30,68±3,41* Примечание: * - достоверность отличий сравниваемых групп, р<0,05.

Таблица 2 Сравнительный анализ абсолютного количества нейтрофильных гранулоцитов, выделенных различными способами (п=10, М±m) Показатель Нейтрофилы, выделенные из лейковзвеси, 10⁶ Нейтрофилы, выделенные из цельной крови, 10⁶ Абсолютное количество нейтрофилов в 1 мл 1,91±0,12 1,83±0,15

Таблица 3 Отличия предлагаемого способа от прототипа   Признак Предлагаемый способ Известный способ (близкий аналог) * 1. Количество крови 2 мл 15 мл 2. Время седиментации эритроцитов 0 мин 30 мин 3. Выделение чистой фракции нейтрофилов из гепаринизированной крови из лейкоцитарной взвеси 4. Общее время выделения нейтрофильных гранулоцитов 60 мин 90 мин 5. Абсолютное количество нейтрофилов в 1 мл 1,83±0,15×10⁶ 1,91±0,12×10⁶ 6. Трипанонегативные клетки (жизнеспособные), % 69,58±4,27* 57,12±3,25 Примечание: * - Долгушин И.И. Нейтрофильные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов. - М.: Изд-во РАМН. 2009. С.122)

Полученные результаты были подвергнуты статистической обработке с использованием пакетов статистических программ БИОСТАТ и Statistica for Windows 6.0. О достоверности различий показателей судили с помощью непараметрических критериев Крускала - Уоллиса и Манна - Уитни. При проведении множественных сравнений использовали поправку Бонферрони [2].

Приводим примеры использования предлагаемого способа выделения нейтрофильных гранулоцитов из периферической крови

Пример 1.

Из цельной периферической крови 20-летней здоровой женщины предложенным способом были выделены нейтрофилы. Процент трипанонегативных нейтрофилов составил 68%. Полученная чистая фракция нейтрофилов была использована для изучения их функциональной активности.

Пример 2.

Из цельной периферической крови здорового мужчины 22 лет предложенным способом из 2 мл цельной крови было выделено 2,0×10⁶ нейтрофилов, а из лейкоцитарной взвеси, полученной из 2 мл гепаринизированной крови, 1,6×10⁶ клеток. Процент трипанонегативных нейтрофилов составил 71%. Полученная чистая фракция нейтрофилов была использована для изучения их функциональной активности.

Таким образом, применение предлагаемого способа позволяет сократить объем забираемой крови у донора и время выделения чистой фракции нейтрофильных гранулоцитов, увеличивая процент жизнеспособных нейтрофилов.

Литература

1. Долгушин И.И., Бухарин О.В. Нейтрофилы и гомеостаз. / И.И.Долгушин. - Екатеринбург, 2001. - 279 с.

2. Гланц С. Медико-биологическая статистика / С.Гланц. - М.: Практика, 1999. - 450 с.

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической лабораторной диагностике и иммунологии, может быть использовано как подготовительный этап изучения функциональной активности нейтрофилов периферической крови. Способ выделения нейтрофильных гранулоцитов из периферической крови заключается в том, что 2 мл цельной гепаринизированной венозной крови соединяют со стерильным физиологическим раствором хлорида натрия в пропорции 2/3 и наслаивают на двойной градиент плотности растворов фиколл-верографина, при этом объем каждого градиента составляет 2 мл, затем проводят центрифугирование 40 минут при 1500 об/мин до появления на границе градиентов кольца нейтрофильных гранулоцитов с чистотой 98-100%. Использование заявленного способа позволяет выделить чистую фракцию нейтрофилов из меньшего объема периферической крови, сократить время выделения, а также получить больший процент жизнеспособных клеток по сравнению с существующими методами выделения нейтрофилов. 3 табл.

Способ выделения нейтрофильных гранулоцитов из периферической крови, характеризующийся тем, что 2 мл цельной гепаринизированной венозной крови соединяется со стерильным физиологическим раствором хлорида натрия в пропорции 2/3 и наслаивается на двойной градиент плотности растворов фиколл-верографина, при этом объем каждого градиента по 2 мл, затем проводится центрифугирование 40 мин при 1500 об/мин до появления на границе градиентов кольца нейтрофильных гранулоцитов с чистотой 98-100%.