СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ МОНОНУКЛЕАРОВ ИЗ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1996 года по МПК G01N33/53 G01N33/483 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии.

Известен способ выделения мононуклеаров (лимфоцитов и моноцитов) из периферической крови человека, заключающийся в осаждении (седементации) эритроцитов желатином. Данный способ осуществляется следующим образом: 3%-ный раствор желатина в физиологическом растворе смешивается с кровью в соотношении 1: 3, после чего инкубируют при 37^oС в течение 30-40 мин, собирают надосадочную жидкость, полученные клетки осаждают центрифугированном (Понякина И. Д. Лебедев В.К. Метод розеткообразования для выделения Т- и В- иммунокомпетентных клеток. Возможности и ограничения. //Иммунология, 1983, N4, с. 10-20, Лебедев К. А. Понякина И.Д. Иммунограмма в клинической практике. М. 1990, c.65.)
Этот способ имеет ряд недостатков:
Выделяются не только мононуклеары (лимфоциты и моноциты), но и гранулоциты (нейтрофилы, зозинофилы, базофилы), т.е. вся популяция лейкоцитов периферической крови;
Популяционный состав выделяемых лейкоцитов зависит от времени расслаивания крови;
В выделенной популяции лейкоцитов почти всегда присутствуют эритроциты.

Выход мононуклеаров соответствующим способом составляет 31-43% (Лимфоциты: Методы: Пер. с англ. /Под ред. Дж.Клауса. М. Мир, 1990, с.29-30), что указывает на недостаточную эффективность способа.

Известны также способы выделения мононуклеаров из периферической крови человека путем дифференциального центрифугирования в градиенте плотности (Boyum A.Separation of leucocytes from blood and bone marrow //Scand.S.Clin. lob. Invest. 1968.Vol.21, N1,p.90-109).

Один из таких способов выделения мононуклеаров состоит в следующем. На 3 мл смеси гипак-фиколла (10 ч 34%-ного гипака и 24 ч 8-9%-ного раствора фиколла на дистиллированной воде, плотность смеси доводится до 1,077 г/см³) наслаивают 3 мл стабилизированной антикоагулянтом крови, разведенной физиологическим раствором в 2-3 раза, до объема 6-12 мл. Центрифугируют при 400g в течение 30-40 мин. После чего отсасывают пастеровской пипеткой слой клеток над смесью. Выделенные клетки отмывают (Лебедев К.А.Понякина И.Д.Там же стр. 66).

Данный способ, несмотря на высокую эффективность (выход мононуклеаров 90-97%), обладает рядом недостатков:
Использование полисахарида бактериального происхождения фиколла является стимулирующим иммунологические реакции фактором (Amlot P.L. et all. Human immune responsee in viva to protein and polyccaride (DNP-Ficoll) neoantigens: normal subjects compared with bone marrow transplantant paients on cyclosporine //Clin. and Ehp. Immunol. 1986.Vol.64.N1.P.125). В частности, фиколл стимулирует экспрессию М-рецепторов лимфоидных клеток (Eremin О. Binns R. M. Moise red blood cell rosetes: human В and some Т lymphocytes express receptor for mouse erithrocytes in the presence of ficoll //Immuno- logy. -1982. -Vol. 47, N2. -P.34-327) что приводит к активизации какой-то части лимфоцитов.

Фиколл обладает недостаточной вязкостью, что не позволяет эффективно проводить выделение мононуклеаров из цельной крови, а разведение крови в 2-3 раза во столько же раз уменьшает исходную концентрацию клеток и соответственно выход мононуклеаров.

Фиколл относительно дорогостоящий и дефицитный препарат, производимый фирмой Pharmacia.

Нами предложен способ выделения мононуклеаров из периферической крови путем дифференцированного центрифугирования цельной крови на градиенте верографин-поливинилпиролидона.

Сущность изобретения на 3 мл смеси (1 ч 76%-ного верографина и 4 ч 3,75% -ного поливинилпиролидона) наслаивают 6 мл цельной стабилизированной антикоагулянтом крови, затем проводят центрифугирование при 400g в течение 30 мин. После центрифугирования отсасывают пастеровской пипеткой слой мононуклеаров (плотное облачко над смесью). Выделенные клетки отмывают 1 раз не менее четырехкратным избытком питательной среды, затем мононуклеары концентрируют центрифугированием при 400g в течение 10 мин. При осуществлении способа заменен импортный реактив фиколл, сокращена одна операция разведение крови физиологическим раствором.

Предложенный способ осуществляется следующим образом.

Готовят градиент. 1 ч 76% -ного раствора верографина смешивают с 4 ч 3,75%-ного раствора поливинилпиралидона (производство объединения "Мосхимфармпрепараты"им. И.Л.Семашко). После тщательного перемешивания смесь готова к употреблению (для длительного хранения смесь помещают в холодильник при 4^oС). В бактериологическую пробирку наливают 3 мл смеси (высота столба смеси 2-2,5 см). Пробирку оставляют на столе до тех пор, пока смесь не примет комнатную температуру.

Берут кровь. Для предотвращения свертывания в кровь при взятии добавляют антикоагулянты: гепарин (20 единиц на 1,0 мл крови или 0,1 мл 5%-ного этилендиаминтетрацетат натрия ЭДТА на 1,0 мл крови).

С помощью пастеровской пипетки аккуратно наслаивают цельную стабилизированную антикоагулянтом кровь в объеме 6 мл на градиент. Необходимо при наслаивании избегать смешивания градиента и крови.

Центрифугируют при 400g в течение 30 мин.

Эритроциты и гранулоциты оседают на дно пробирки, а на границе раздела находятся мононуклеарные клетки. По всей площади сечения пробирки на границе раздела фаз отсасывают пастеровской пипеткой слой мононуклеаров (плотное облачко над смесью). Клетки, прилипшие к стенке собирают кончиком пипетки. Мононуклеары переносят в чистую центрифужную пробирку.

Выделенные клетки отмывают 1 раз, для чего взвесь мононуклеаров разбавляют не менее четырехкратным избытком питательной среды (РПМИ-1640, раствор Хенкса, среда 199), тщательно перемешивают. Центрифугируют при 400g в течение 10 мин. Надосадок отбрасывают, а мононуклеары ресуспендируют раствором питательной среды.

Примечание. Возможен микрометод выделения мононуклеаров в центрифужной пробирке (объем 10-15 мл). При этом на 1 мл градиента наслаивают 2 мл цельной стабилизированной антикоагулянтом крови. Далее, как описано выше.

Основные сравнительные исследования проводили в группе здоровых лиц (20 человек).

Выделение мононуклеаров из крови проводили тремя способами: осаждением эритроцитов 3% -ным раствором желатина (аналог), на градиенте гипак-фиколл (прототип) и на градиенте верографин-поливинилпиролидон (предлагаемый способ).

Определяли выход мононуклеаров в процентах по сравнению с их содержанием в 1 мл крови. Для чего выделенные и осажденные на дно пробирки клетки ресуспендируют в 1,0 мл питательной среды. 0,01 мл данной клеточной взвеси разводят в 0,3 мл раствора Тюрка (3%-ный раствор уксусной кислоты, подкрашенной генциановым фиолетовым,) тщательно перемешивают. Немного взвеси вносят в одну из половинок заранее приготовленной камеры Горяева. Через 1-2 мин подсчитывают мононуклеарные клетки. Общее число мононуклеаров подсчитывается в 25 больших квадратах камеры Горяева, умножаются на 10, затем еще раз умножается на фактор разведения клеточной взвеси и получают число мононуклеаров, содержащихся в 1 мл взвеси, внесенной в камеру (Лимфоциты:Методы: Пер. с англ. /Под ред. Дж. Клауса. -М. 1990,c. 62) Затем определяли содержание мононуклеаров в 1 мл крови по общепринятым методам (Лебедев К.А.Понякина И.Д. Иммунограмма в клинической практике. -М:1990,с.90) После чего определяли выход мононуклеаров в по сравнению с их содержанием в крови по формуле:

Результаты представлены в табл.1.

Как видно из данных табл. 1, по проценту выхода клеток предлагаемый способ выделения мононуклеаров на градиенте плотности верографин-поливинилпиролидон не уступает прототипу и незначительно эффективнее аналога.

Также проведен клеточный анализ по числу эритроцитов и нейтрофилов на 100 клеточных элементов в выделяемой суспензии. При этом приготовленные мазки (для чего каплю суспензии переносят на предметное стекло) сушат на воздухе и фиксируют в этаноле в течении 5 мин, окрашивают по Романовскому-Гимза в течение 5 мин, промывают водой, высушивают на воздухе и проводят подсчет при иммерсионном увеличении объектива Х90 светового микроскопа (Лебедев К.А.Понякина И.Д. Иммунограмма в клинической практике.-М. с.90).

Результаты представлены в табл.2.

Как видно из табл.2, в выделенной аналогом суспензии мононуклеаров содержится большое количество гранулоцитов и немного эритроцитов, в то же время в выделенной прототипом и предлагаемым способом суспензии мононуклеаров содержится ничтожное малое количество эритроцитов и гранулоцитов, что практически не отражается на результатах последующих работ с мононуклеарами. Следовательно, по сравниваемому показателю предлагаемый способ не уступает прототипу и намного эффективнее аналога.

Также проводили анализ трех способов по жизнеспособности выделенных клеток по поглощению ими трипанового синего на 100 клеток с выведением жизнеспособных клеток. Для чего к выделенным клеткам добавляли трипановый синий, тщательно перемешивали, инкубировали 2-3 мин, затем проводили подсчет клеток в камере Горяева.

Результаты представлены в таблице 3.

Как видно из табл.3, жизнеспособность клеток, выделенных как аналогом и прототипом, так и предлагаемым способом высокая и приближается к 100% что говорит почти о полной сохранности и целостности выделенных клеток.

Примеры реализации способа.

Пример 1. Оптимальный вариант вязкости смеси был подобран экспериментально. Смесь, состоящая из 4 ч 3,75%-ного раствора поливинилпиролидона и 1 ч 76%-ного верографина дает оптимально положительный эффект. Расчеты показывают, что в 1 мл такой смеси содержится 0,03 г поливинилпиролидона и 0,152 г верографина, при этом данное содержание верографина обеспечивает заданную плотность смеси 1,077 г/см³, а содержание поливинилпиролидона оптимальную вязкость.

Пример 2. Выделяли мононуклеары непосредственно из крови донора, при этом соотношение кровь-смесь было 3:1 2:1 1:1. После окончания разделения образцы выглядели следующим образом: для соотношения кровь-смесь 3:1 при четко сформированном слое мононуклеаров в интерфазе толщина слоя составляла около 1-2 мм, что привело к загрязнению эритроцитами отобранного слоя мононуклеаров. При соотношении кровь-смесь 2:1 четко сформировался слой мононуклеаров, толщина интерфазы составила 5-6 мм, что позволило легко отобрать лимфоциты из интерфазы. При соотношении кровь-смесь 1:1 слой мононуклеаров был нечетко сформирован, толщина интерфазы составляла 10-12 мм, не было четкой границы между слоем мононуклеаров и разделяющей смесью, что привело к загрязнению плазмой и разделяющий смесью мононуклеаров. Таким образом, соотношение кровь-смесь 2:1 является оптимальным.

Пример 3. Донор М.21 год. Выделяли мононуклеары из крови тремя способами (аналогом, прототипом и предлагаемым способом), как описано выше. Определяли выход мононуклеаров в по сравнению с их содержанием в 1,0 мл крови, число эритроцитов и нейтрофилов на 100 клеточных элементов в выделенной суспензии, жизнеспособность выделенных клеток по поглощению ими трипанового синего на 100 клеток.

Результаты представлены в табл.4.

Как видно из примера 3, предлагаемый способ выделения мононуклеаров по основным показателям не уступает прототипу и эффективнее аналога.

Таким образом, предлагаемый способ отличатся от прототипа:
По новизне: выделение мононуклеаров из крови человека в градиенте плотности разделяющей смеси, содержащей поливинилпиролидом в отличие от смеси, содержащей фиколл по прототипу.

По существеннным отличиям: при осуществлении способа сокращена одна операция разведение цельной крови физиологическим раствором, а также заменен дефицитный реактив Ficoll Pague производства фирмы Pharmacia на доступный реактив отечественного производства поливинилпиролидон. Возможность выделения мононуклеаров из цельной крови обеспечивается более высокой вязкостью смеси с поливинилпиролидоном по сравнению со смесью с фиколлом и упрощается процедура выделения. Кроме того, цельная кровь, обладая собственной высокой вязкостью, препятствует взаимной диффузии двух жидких фаз в процессе выделения, что улучшает все характеристики процесса. Использование неиммуногенного вещества поливинилпиролидон (вместо полисахарида бактериального происхождения фиколл, являющегося стимулирующим фактором для моноцитов и лимфоцитов) имеет положительные стороны для последующей работы с выделенными клетками.

По положительному эффекту: выделение мононуклеаров в градиенте плотности верографин-поливинилпиролидон по основным показателям (по выходу мононуклеаров, по содержанию гранулоцитов и эритроцитов на 100 выделенных клеток, по жизнеспособности выделенных клеток) не уступает выделению в смеси гипак-фиколл.

Выход мононуклеаров предлагаемым способом составляет 91,8 + 3,2% а по прототипу 92,4 + 4,2%
Суммируя вышеизложенное, необходимо отметить, что предлагаемый способ выделения мононуклеаров из крови человека обладает высоким положительным эффектом. Данный способ может быть применен наряду с традиционными методами в медицине, в частности в иммунологии. ТТТ1 ТТТ2 ТТТ3

Сущность изобретения: на 3 мл смеси (1 ч 76%-ного верографина и 4 ч 3,75%-ного поливинилпиролидона) наслаивают 6 мл цельной стабилизированной антикоагулянтом крови, затем проводят центрифугирование при 400g в течение 30 мин. После центрифугирования отсасывают пастеровской пипеткой слой мононуклеаров (плотное облачко над смесью). Выделенные клетки отмывают 1 раз не менее четырехкратным избытком питательной среды, затем мононуклеары концентрируют центрифугированием при 400 g в течение 10 мин.

Способ выделения мононуклеаров из крови человека, включающий отбор крови, добавление антикоагулянта, нанесение пробы на градиент и центрифугирование в градиенте плотности в растворах, содержащих высокомолекулярное вещество, отличающийся тем, что цельную кровь наслаивают на градиент в соотношении кровь градиент 2:1, центрифугируют при 400 g в течение 30 мин, при этом градиент представляет собой смесь верографина с поливинилпирролидоном, взятых в соотношении 1:4 (по объему).