Способ получения фактора некроза опухолей-α из нейтрофилов крови доноров Российский патент 2023 года по МПК A61K35/15 A61K38/19 C07K14/525 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии.

Иммуноцитокины находятся в центре внимания современной иммунологии. Одним из наиболее важных цитокинов воспаления считают фактор некроза опухолей-α (ФНО-α), относящийся к семейству молекул TNF. Основными биологическими эффектами ФНО-α является локальное воспаление, активация эндотелия, системная острая фаза (Ганковская Л.В., Намазова-Баранова Л.С., Мешкова Р., 2014; Симбирцев А.С, 2018; Хаитов P.M., 2019). Клетками-продуцентами ФНО-α являются моноциты и макрофаги, натуральные киллеры, Т-лимфоциты, нейтрофилы (Ганковская Л.В., Намазова-Баранова Л.С., Мешкова Р., 2014; Симбирцев А.С, 2018). Главными индукторами синтеза ФНО-α считаются ЛПС и другие компоненты микроорганизмов. Кроме того, роль индукторов могут взять на себя другие цитокины: ИЛ1, ИЛ2, ИФНα/β, GM-CSF. Значительно меньшие количества ФНО-α могут продуцировать некоторые опухолевые клетки в ответ на различные стимулы (Ганковская Л.В., Намазова-Баранова Л.С., Мешкова Р., 2014; Симбирцев А.С., 2018; Хаитов P.M., 2019).

Разработка методов получения цитокинов, в том числе ФНО-α, является актуальной проблемой иммунологии.

Известен способ получения ФНО-α из лейкоцитов периферической крови. Он включает пятикратное разведение средой Игла свежей гепаринизированной крови, приготовление рабочего раствора индуктора синтеза и секреции ФНО-α (продигиозана). В 96-луночный планшет для культивирования клеток вносят по 100 мкл рабочего раствора продигиозана, добавляют в лунки по 100 мкл подготовленной периферической крови и культивируют в CO₂-инкубаторе в течение 24 часов при температуре 37°С, после чего осторожно собираются супернатанты и исследуются на наличие ФНО-α (Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Иммунология для врача. - Санкт-Петербург: Гиппократ, 1998. - С. 120-121).

Недостатком описываемого способа получения ФНО-α является использование различных популяций лейкоцитов, секретирующих цитокины с разнонаправленным спектром действия, что способствует ингибированию активности клеток и снижению уровня секреции цитокинов. Этот способ требует использования дорогостоящих препаратов и по продолжительности занимает достаточно много времени.

Наиболее близким по совокупности существенных признаков к заявляемому изобретению является способ получения секреторных продуктов нейтрофилов (Долгушин И.И., Бухарин О.В. Нейтрофилы и гомеостаз. - Екатеринбург, 2001. - С. 75), заключающийся в выделении лейкоцитарной взвеси из гепаринизированной периферической крови доноров путем осаждения эритроцитов добавлением 10% раствора желатина в соотношении 10:1 при температуре 37°С в течение 30 минут, выделении нейтрофилов из лейкоцитарной взвеси на двойном градиенте плотности фиколла - верографина, доведении нейтрофилов до концентрации 5×10⁶ клеток/мл средой 199 с последующей их активацией частицами монодисперсного полистирольного латекса диаметром 1,7 мкм из расчета 50 частиц на один нейтрофил. Затем клетки и частицы латекса удаляли путем центрифугирования при скорости 3000 об/мин в течение 15 минут и последующей фильтрации через миллипоровые фильтры с диаметром пор 0,24 мкм («Millipore», USA).

У прототипа и заявляемого изобретения имеются следующие общие признаки: для выделения цитокинов используют нейтрофилы крови доноров, которые выделяют из лейкоцитарной взвеси на двойном градиенте плотности фиколла - верографина, доводят нейтрофилы до концентрации 5×10⁶ клеток/мл и активируют эти клетки.

Недостатком прототипа является:

1. Низкий уровень секреции ФНО-α;

2. Использование дорогостоящих препаратов (частиц монодисперсного полистирольного латекса, миллипоровых фильтров).

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа получения ФНО-α из нейтрофилов крови доноров.

Решение этой задачи позволяет разработать новый простой и доступный способ, обеспечивающий высокий уровень секреции ФНО-α нейтрофилами крови доноров, не требующий использования дорогостоящих препаратов.

Для достижения этого результата заявляемое изобретение «Способ получения фактора некроза опухолей-α из нейтрофилов крови доноров» включает использование лейкоцитов периферической крови доноров, выделение нейтрофилов из лейкоцитарной взвеси на двойном градиенте плотности фиколла - верографина, разведение нейтрофилов средой 199 до концентрации 5×10⁶ клеток/мл и проведение активации этих клеток. При этом нейтрофилы активируют адгезией на полистирольном пластике в течение 1 часа при температуре 37°С в среде 199 без последующей фильтрации супернатантов через миллипоровые фильтры.

По отношению к прототипу у заявляемого изобретения имеются следующие отличительные признаки: активацию нейтрофилов осуществляют адгезией их на полистирольном пластике, что обеспечивает высокий уровень секреции ФНО-α и является экономически выгодным, так как исключает использование дорогостоящих препаратов.

Заявляемый способ обеспечивает высокий уровень секреции преформированного ФНО-α и является экономически выгодным.

Для осуществления способа получения ФНО-α используют нейтрофилы крови доноров, которые активируют адгезией их на полистирольном пластике в течение 1 часа при температуре 37°С в среде 199, что обеспечивает высокий уровень секреции этого цитокина за короткий промежуток времени и является экономически выгодным.

По имеющимся у автора сведениям, совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения не известна из уровня техники, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению автора, сущность заявляемого изобретения не следует для специалиста явным образом из известного уровня техники, так как из него не выявляются вышеуказанные влияния на получаемый технический результат - новое свойство объекта - совокупности признаков, которые отличают от прототипа заявляемое изобретение, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением технического результата, заключающегося в получении ФНО-α из нейтрофилов крови доноров, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применяемость».

Данный способ осуществляют следующим образом.

У доноров производят забор 20,0 мл гепаринизированной периферической венозной крови, которую с целью осаждения эритроцитов и получения лейкоцитарной взвеси отстаивают с добавлением 10% раствора желатина в соотношении 10:1 при температуре 37°С в течение 30 минут. Выделенную лейкоцитарную взвесь однократно отмывают в среде 199 (без индикатора фенолового красного) центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут. Нейтрофилы выделяют из лейкоцитарной взвеси на двойном градиенте плотности стерильных растворов фиколла-верографина. Плотность верхнего слоя градиента составляет 1,075-1,077, а нижнего - 1,093-1,095. Объем каждого слоя градиента равняется 1,5 мл. Через 30 минут центрифугирования при 1500 об/мин на границе между плазмой и верхним слоем градиента образуется кольцо, состоящее, в основном, из мононуклеарных клеток (лимфоциты - 45-50%, моноциты - 15-20%), гранулоциты - 10-15%). В интерфазе между двумя слоями градиентов плотности располагается слой гранулоцитов с чистотой 96-98%, 2-4% составляют мононуклеары. Клетки аккуратно собирают, переносят в стерильные центрифужные пробирки, трижды отмывают стерильной средой 199 и разводят этой же средой до концентрации 5×10⁶ клеток/мл. Разливают по 1,0 мл клеточной суспензии в стерильные пластмассовые чашки Петри диаметром 40 мм. Культивируют 1 час при температуре 37°С. Сливают надосадок. Неадгезированные клетки удаляют из супернатанта центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут. В выделенном супернатанте нейтрофилов доноров определяют содержание провоспалительного цитокина ФНО-α. Для этой цели используют соответствующую тест-систему ООО «Цитокин» (г. Санкт-Петербург). Эта тест-система основана на «сендвич» - методе твердофазного ИФА с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента (Тараканова Ю.Н., Дмитриев А.Д., Дмитриев Д.А. и др. Твердофазный иммуноферментный анализ: история, теория и практическое использование. Журн. микробиол., 2019, №3, С. 117-125).

Новым в заявляемом способе является активация нейтрофилов крови доноров адгезией на полистирольном пластике.

Для определения эффективности предлагаемого способа получения ФНО-α использовали супернатанты неактивированных и активированных частицами полистирольного монодисперсного латекса диаметром 1,7 мкм (получен из НИИ синтетического каучука, Санкт-Петербург) нейтрофилов крови доноров. Культивирование нейтрофилов без индуктора секреции клеток и в его присутствии проводили в стерильных центрифужных пробирках в том же режиме, т.е. при температуре 37°С в течение 1 часа в среде 199.

Результаты исследования показали, что активированные адгезией на пластике нейтрофилы крови доноров достоверно больше по сравнению с неактивированными и активированными латексом нейтрофилами секретируют преформированный провоспалительный цитокин ФНО-α. Вероятно, адгезия нейтрофилов на пластике является наиболее раздражающим фактором, что приводит к достоверно более выраженной секреции ФНО-α по сравнению с неактивированными и активированными латексом нейтрофилами крови доноров (табл. 1).

Представленные табличные данные свидетельствуют о том, что предлагаемый «Способ получения фактора некроза опухолей-α из нейтрофилов крови доноров» является наиболее эффективным по сравнению с прототипом.

Изобретение относится к области иммунологии, а именно к способу получения фактора некроза опухолей-α из нейтрофилов крови доноров. Способ получения фактора некроза опухолей-α из нейтрофилов крови доноров, включающий выделение нейтрофилов из лейкоцитарной взвеси периферической крови доноров на двойном градиенте плотности стерильных растворов фиколла-верографина, разведение нейтрофилов до концентрации 5×10⁶ кл./мл, активацию нейтрофилов адгезией на полистирольном пластике в течение 1 часа при температуре 37°С с последующим отделением супернатанта, содержащего целевой продукт, отличающийся тем, что для выделения нейтрофилов крови доноров используют среду 199. Вышеуказанное изобретение представляет собой новый простой и доступный способ, обеспечивающий высокий уровень секреции ФНО-α нейтрофилами крови доноров. 1 табл.

Способ получения фактора некроза опухолей-α из нейтрофилов крови доноров, включающий выделение нейтрофилов из лейкоцитарной взвеси периферической крови доноров на двойном градиенте плотности стерильных растворов фиколла-верографина, разведение нейтрофилов до концентрации 5×10⁶ кл./мл, активацию нейтрофилов адгезией на полистирольном пластике в течение 1 часа при температуре 37°С с последующим отделением супернатанта, содержащего целевой продукт, отличающийся тем, что для выделения нейтрофилов крови доноров используют среду 199.