СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ИЗ КРОВИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДВУХСТУПЕНЧАТОГО ГРАДИЕНТА ПЛОТНОСТИ ЙОГЕКСОЛА Российский патент 2020 года по МПК G01N33/48 A61K35/15 

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической лабораторной диагностике, иммунологии и микробиологии, и предназначено для выделения чистой фракции нейтрофилов из крови. Выделение нейтрофилов может быть использовано в качестве предварительного этапа для последующего выполнения различных иммунологических, биохимических, молекулярно-генетических методов при проведении клинических и фундаментальных научных исследований.

Нейтрофилы являются преобладающей популяцией лейкоцитов в крови человека в норме, и известны как клетки, обеспечивающие первичный иммунный ответ в местах травм и при проникновении инфекционных агентов. Осуществление защиты от вторжения патогенных микроорганизмов опосредовано способностью нейтрофилов к фагоцитозу, продукцией и выделением ими активных форм кислорода, протеаз и внеклеточных ловушек. Помимо хорошо известного участия нейтрофилов в реализации врожденных форм иммунитета, в настоящее время появляются сведения, свидетельствующие о ранее недооцененном вкладе нейтрофилов в формирование адаптивного иммунитета. Многочисленные исследования в этой области выявили вовлеченность нейтрофилов в патогенетические механизмы при различных состояниях, включая стерильное воспаление, атеросклероз, онкологические и аутоиммунные заболевания.

В настоящее время существуют несколько способов получения нейтрофилов из крови, которые можно разделить на два основных направления: методы, использующие экспрессию клетками специфических поверхностных антигенов, и методы, основанные на различии физических свойств клеток. К первой группе относят такие методы, как выделение клеток с помощью проточной цитометрии и иммуномагнитная сепарация. Данные методики обеспечивают высокий уровень чистоты клеточных фракций, но их широкое распространение ограничено требованиями технической оснащенности лаборатории и значительной стоимостью не только оборудования, но и расходных материалов. Кроме того, взаимодействие антител, применяемых для иммунофенотипирования, с белками-мишенями на мембране лейкоцитов способно инициировать процессы хемотаксиса, фагоцитоза, адгезии, вызывая активацию клеток.

Ко второй группе методов относится центрифугирование клеток в градиенте плотности - методика, получившая наибольшее распространение ввиду относительной простоты выполнения, невысоких технических требований и малой стоимости. В подавляющем большинстве случаев в качестве основных компонентов градиентов плотности используются фиколл-400 и амидотризоат натрия (урографин). Известен метод выделения нейтрофилов при помощи двухступенчатого градиент фиколла-урографина [Долгушин И.И., Рыжкова А.И., Савочкина А.Ю., Шишкова Ю.С. Способ выделения нейтрофильных гранулоцитов из периферической крови: Патент RU 2431836 С1 // № заявки 2010105891/15; заявл. 18.02.2010; опубл. 20.10.2011, Бюл. №29]. Данный метод ниже обозначается как прототип. Согласно этой процедуре, нейтрофилы получают из цельной гепаринизированной крови, смешанной с полуторакратным объемом физиологического раствора, которую наслаивают на двойной градиент плотности стерильных растворов фиколла-урографина. Плотность верхнего слоя градиента составляет 1075-1077 кг/м³, а нижнего - 1093-1095 кг/м³. Через 40 минут центрифугирования при 1500 об/мин на границах между плазмой и верхним слоем градиента, а также между верхним и нижним слоями последнего, появляются кольца мононуклеарных клеток и гранулоцитов, соответственно; эритроциты при этом оседают на дно пробирки. Кольцо, содержащее нейтрофильные гранулоциты, аккуратно собирают и отмывают от градиента центрифугированием.

Помимо этого, для выделения нейтрофилов некоторыми авторами используется центрифугирование на однослойном градиенте плотности фиколл-урографина с плотностью 1077 кг/м³ [Ковальчук Л.В. Иммунология. Практикум. / Под ред. Л.В. Ковальчука, Г.А. Игнатьевой, Л.В. Ганковской. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 176 с.]. В этом случае нейтрофилы переходят в осадок под градиентом вместе с эритроцитами; последние затем лизируют. Данный способ позволяет выделять смесь гранулоцитов, но не чистые нейтрофилы. Кроме того, гипотонический шок, вызывающий лизис эритроцитов, также негативно влияет на жизнеспособность и активационный статус нейтрофилов.

Несмотря на вышеупомянутые преимущества, использование градиентов на основе фиколла-урографина в любом варианте имеет серьезные недостатки. Прежде всего, фиколл вследствие своей полисахаридной природы способен при определенных условиях индуцировать повышение функциональной активности нейтрофилов и приводить к генерации кислородзависимых факторов бактерицидности. Данное обстоятельство делает невозможным исследование полученных нейтрофилов в условиях, приближенных к физиологическим. Кроме того, натрия амидотризоат, входящий в состав урографина, в растворе диссоциирует на ионы и, следовательно, оказывает существенное влияние на осмолярность градиента плотности, приводя к выходу ее из диапазона оптимальных для клетки значений. Поскольку именно натрия амидотризоат является основным компонентом градиента, определяющим плотность последнего, возможности достижения точного значения осмолярности ввиду этого ограничены. Также определенную сложность представляет стерилизация градиентов плотности такого состава из-за разрушения компонентов градиента при воздействии высоких температур и ультрафиолета. Помимо этого, использование градиентов со значениями плотности 1077 кг/м³ и менее в качестве верхнего слоя, и более 1093 кг/м³ в качестве нижнего слоя приводит к загрязнению выделенной нейтрофильной фракции мононуклеарными лейкоцитами и эозинофильными гранулоцитами соответственно. Данное обстоятельство обусловлено тем, что диапазон плотности нейтрофилов сходен с плотностью мононуклеаров в области наименьших значений и эозинофилов - в наибольших.

Устранение вышеуказанных недостатков методики может быть достигнуто путем замены компонента градиентов, обеспечивающего плотность, и изменением значений плотности двухступенчатого градиента по сравнению с прототипом. Альтернативой раствору фиколла-урографина, в большей степени удовлетворяющей вышеприведенным требованиям, является раствор йогексола - неионного и низкоосмолярного рентгеноконтрастного вещества. Йогексол позволяет получать изоосмолярные градиенты любой плотности и, соответственно, предотвращать изменение морфологии клеток. Отсутствие активирующего влияния на нейтрофилы обусловлено тем, что клетки не поглощают йогексол, а также тем обстоятельством, что не происходит связывание специфических антител с клеточными рецепторами, как при использовании первой группы методов. Данное вещество более стабильно при нагревании, что делает возможным стерилизацию его растворов автоклавированием [Rickwood D., Ford Т., Graham J. Nycodenz: a new nonionic gradient medium. Analytical biochemistry, 1982, vol. 123, pp. 23-31].

В результате анализа ранее опубликованных [ Tresland L., Nordlie E.M. Separation of leucocytes: improved cell purity by fine adjustments of gradient medium density and osmolality. Scand. J. Immunol, 1991, vol. 34, pp. 697-712] и собственных экспериментальных данных было установлено, что значением плотности верхней ступени градиента, обеспечивающим наиболее полное разделение фракций мононуклеаров и нейтрофилов, является 1080 кг/м³. Значение плотности нижней ступени градиента, позволяющее избежать попадания эозинофильных гранулоцитов в выделенные нейтрофилы, составило, согласно тем же источникам, 1090 кг/м³.

При изучении уровня техники данных об использовании йогексола в качестве основного компонента двухступенчатого градиента с плотностями 1080 кг/м³ и 1090 кг/м³ найдено не было.

Решаемая задача состоит в разработке способа выделения жизнеспособных и неактивированных нейтрофилов с более высокой степенью чистоты клеточной суспензии путем использования усовершенствованного двухступенчатого градиента плотности. Увеличение плотности верхнего слоя по сравнению с прототипом способно предотвратить попадание мононуклеарных лейкоцитов в выделяемые клетки; уменьшение плотности нижнего слоя также не позволяет задерживаться эозинофилам и эритроцитам. Замена фиколла-амидотризоата на йогексол обеспечивает упрощение доведения основных параметров градиента плотности до целевых значений.

Технический результат заявляемого изобретения состоит в уменьшении контаминации выделяемой суспензии нейтрофильных гранулоцитов другими видами клеток при сохранении достаточной доли жизнеспособных клеток и предотвращении их активации. Технический результат достигается путем выбора оптимальной плотности градиентов, а также использованием йогексола в качестве основного компонента градиентов плотности.

В предлагаемом нами способе нейтрофилы выделяются из лейкоцитарной взвеси. Для этого необходимо 6 мл крови инкубировать в стерильной пробирке при температуре 37°С в течение 20-30 минут. Отобрать формирующуюся лейкоцитосодержащую пленку до конечного объема 1 мл. Затем последнюю смешивают с 2 мл стерильного раствора Хэнкса и наслаивают на двойной градиент плотности стерильных растворов йогексола. Плотность верхнего слоя градиента составляет 1080 кг/м³, а нижнего - 1090 кг/м³. Объем каждого градиента равняется 2 мл. Через 15 минут центрифугирования при 700g на границе между градиентами появляется опалесцирующее кольцо, содержащее нейтрофильные гранулоциты с чистотой 99-100%. Нейтрофилсодержащее кольцо аккуратно собирают, переносят в стерильные центрифужные пробирки, трижды отмывают от градиента стерильным раствором Хэнкса центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут.

Сущность предлагаемого способа заключается в использовании для выделения нейтрофилов двойного градиента плотности йогексола, при этом значения плотности слоев оптимизированы для достижения более высокой чистоты клеточной фракции.

Пример 1 Приготовление градиентов

Отбирали 76,6% раствор йогексола из флакона и переносили в цилиндры. Добавляли в цилиндры дистиллированную воду, перемешивая содержимое цилиндров до визуальной однородности. Добавляли в цилиндры 0,94% раствор NaCl. Расчет требуемого количества всех компонентов градиента производили, используя определяемые нами значения плотности и осмолярности коммерческого 76,6% раствора йогексола, изменяющиеся в различных партиях реагента. Плотность градиентов определяли с помощью ареометров, осмолярность - методом криоскопии.

Пример 2 Выделение нейтрофилов и оценка их основных характеристик

Инкубировали пробирку с периферической венозной кровью и К₂-ЭДТА при 37°С в течение 20-30 минут до осаждения эритроцитов. Отбирали из пробирки лейкоцитарную взвесь объемом 1 мл и разводили раствором Хэнкса в соотношении 1:2. В силиконированную пробирку помещали 2 мл градиента с плотностью 1090 кг/м³, наслаивали на него градиент с плотностью 1080 кг/м³ при помощи шприца с иглой диаметром 1,3 мм и длиной 45 мм. Наслаивали на двухступенчатый градиент лейкоцитарную взвесь, смешанную с раствором Хэнкса, силиконированной стеклянной пипеткой. Центрифугировали 15 минут при 700g и 18-22°С, не используя торможение. Отобрали и отбросили верхний слой плазмы с тромбоцитами, верхнее опалесцирующее кольцо и градиент с плотностью 1080 кг/м³. Отобрали нижнее опалесцирующее кольцо дозатором с силиконированным наконечником и перенесли в пробирку. Отмывали раствором Хэнкса трехкратным центрифугированием в течение 20 минут при 1500 об/мин и комнатной температуре.

Эффективность предлагаемого способа оценивалась путем сравнения с прототипом по следующим параметрам: чистота выделенной фракции нейтрофилов, жизнеспособность клеток и степень их активации. Определение чистоты выделения нейтрофилов проводилось с помощью окрашивания мазка клеточной суспензии по Май-Грюнвальду. Жизнеспособность нейтрофилов устанавливалась по общепринятому методу, основанному на способности погибших лейкоцитов окрашиваться в 0,2% растворе трипанового синего, с последующим подсчетом как абсолютного числа клеток, так и процентного содержания жизнеспособных нейтрофилов. Степень активации нейтрофилов выявлялась при помощи теста с нитросиним тетразолием.

Результаты сравнения заявляемого способа и прототипа по вышеупомянутым параметрам представлены в таблице 1. Заявляемый метод продемонстрировал существенно более высокую долю жизнеспособных и неактивных нейтрофилов по сравнению с прототипом; чистота нейтрофильной фракции также была выше при использовании заявляемого метода.

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической лабораторной диагностике, иммунологии и микробиологии, и представляет собой способ выделения чистой фракции нейтрофильных гранулоцитов человека из крови. Для этого лейкоцитарная взвесь, разбавленная раствором Хэнкса, наслаивается на двойной градиент плотности растворов йогексола. Плотность верхнего слоя градиента составляет 1080 кг/м³, а нижнего - 1090 кг/м³. После центрифугирования при 700g на границе между этими градиентами появляется кольцо, содержащее нейтрофилы с чистотой 99-100%. Способ обеспечивает уменьшение контаминации выделяемой суспензии нейтрофилов другими видами клеток при сохранении достаточной доли жизнеспособных нейтрофилов и предотвращении их активации. 1 табл., 2 пр.

Способ выделения нейтрофильных гранулоцитов из крови человека, включающий центрифугирование крови, нанесенной поверх двух различных слоев градиента плотности, отличающийся тем, что, во-первых, компонентом градиентов, обеспечивающим необходимую плотность, является йогексол, и, во-вторых, используются йогексол-содержащие градиенты с плотностями 1080 кг/м³ и 1090 кг/м³.