Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для получения пробиотического препарата, применяемого в ветеринарии при лечении и профилактике желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы и рыб.
Известен штамм Bacillus subtilis 534 - продуцент пробиотика "Споро-бактерин", который предназначен для профилактики и лечения желудочно-кишечного тракта, дисбактериозов. SU 1708350, кл. А 61 К 35/66.
Недостатками являются небольшие сроки хранения, т.к. содержит живые бактерии, которые не могут длительное время сохранять свои свойства, низкая чистота препарата, что имеет узкую область применения - как кормовая добавка для животных. Штамм также чувствителен к антибиотикам за исключением полимиксина, что ограничивает сферу применения препарата.
Известен штамм Bacillus subtilis 3Н (ГИСК 248), несущий свойство антибиотикорезистентности, используемый для получения пробиотического препарата "Бактиспорин", который применяют совместно с антибиотиками для лечения и профилактики дисбактериоза, ферментной недостаточности органов пищеварения, гнойных инфекций, пищевой аллергии. RU 2067616 С1, кл. А 61 К 35/74, 10,10.1996.
Известен штамм Bacillus subtilis TPAXC-KM-117, проявляющий ингибирующую активность по отношению к патогенным видам микроорганизмов и обладающий множественной лекарственной устойчивостью. Штамм резистентен к тетратциклину, рифампицину, аленициллину, хлорамфениколу, апректомицину. На его основе готовят антибиотикорезистентный пробиотик для лечения и профилактики инфекционных заболеваний при одноименной антибиотикотерапии (RU 2118364 С1, кл. С 12 N 1/20, 27.08.1988).
Задачей, на решение которой направлено изобретение, является выявление нового эффективного штамма-продуцента пробиотического препарата "Субтилис" для ветеринарных целей и рыбного хозяйства.
Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в повышении эффективности лечения, увеличения усвояемости кормов, продуктивности и привесов животных, птицы, рыб за счет использования "Субтилис", стабильности препарата при хранении в широком диапазоне температур внешней среды.
Штамм Bacillus subtilis В-1601Д депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ИБФМ им. К.Г.Скрябина) под ВКМ В-2250Д.
Штамм Bacillus subtilis ВКМ В-2250Д выделен из почвы.
Условия хранения: штамм может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет или на косяках с агаризованной средой на основе мясопептонного бульона с обязательным пересевом не реже 1 раза в 2 месяца на эту же среду.
Характеристики штамма.
Культурально-морфологические признаки. Палочки. Величина клеток односуточной агаровой культуры 3-5 мкм. Клетки окрашиваются положительно по Грамму, образуют круглые споры, одиночные, центральные диаметры меньше диаметра клетки. Колонии на МПА белые, пигмент в среду не выделяют.
Физиологические признаки. Аэроб, оптимальная температура роста 37oС и рН 4,0-8,0. Возможен рост в диапазоне температур 4-60oС. Отношение к NaCl - рост при 2-5%.
Биохимические признаки. Расщепляет глюкозу, маннит. Несбраживаемые соединения углерода: сахароза, инозит, сорбит, мальтоза, лактоза. Утилизирует цитрат и ацетат. При сбраживании не образует газа. Продуцирует оксидазу, каталазу.
Антагонистические признаки. Подавляет рост стафилококков, протея, клебсиелл, кишечной палочки, энтеробактерий, нитробактерий, аэромонас, дрожжевых грибов.
Штамм не является патогенным для растений, животных, рыб и человека.
Данные таблицы показывают антагонистическую активность тестовых штаммов микроорганизмов (метод отсроченного антагонизма).
Для культивирования штамма Bacillus subtilis BKM В-2250Д используют жидкую питательную среду на основе 3% ФГМС, рН 6,8-7,0, содержащую 0,2% глюкозу (по сухому веществу), 0,005% аминопептидазу или 0,02% сыворотку крови.
Предварительно сухую биомассу микроорганизмов высевают в пробирку с бульоном. При появлении видимого роста колонии пересевают на мясопептонный агар в пробирки.
Отбирают типичные колонии, которые пересевают на жидкую среду во флаконах. Через 24 ч всю выросшую массу переносят в 15-литровую бутыль с 9 л питательной среды и культивируют 22 ч при 37-40oС, получая посевной материал.
Питательную среду на основе ФГМС помещают в реактор, стерилизуют при 1 атм 60 мин, охлаждают до 39oС и засевают посевным материалом из бутыли в соотношении 1:9.
В процессе аэробного культивирования рН среды поддерживают в пределах 6,8-7,2, подпитывая среду 40% глюкозой до конечной концентрации 0,1-0,2%. При достижении концентрации 20 млрд. бактериальных клеток прекращают добавление глюкозы до снижения рН 4,5 и отключают подачу воздуха. Затем отключают обогрев реактора, среду охлаждают до 20oС. Полученную охлажденную культуру перекачивают в емкости или расфасовывают во флаконы.
При указанном способе культивирования получают препарат в виде жидкой лекарственной формы, названной "Субтилис", с содержанием 80-90% спор бактерий Bacillus subtilis BKM В-2250Д и живых вегетативных клеток.
Препарат "Субтилис" безвреден, не содержит посторонней микрофлоры. Безвредность проверена на белых мышах массой тела 18-20 г, которым перорально вводили препарат в объеме 1,0 мл.
"Субтилис" обладает специфической активностью: количество клеток в одной дозе препарата (15-20) млрд. кл/мл, антагонистическая активность - зона задержки роста тестовых микроорганизмов составляет от 6 до 34 мм.
Таким образом предлагаемый штамм Bacillus subtilis BKM В-2250Д может быть использован как производственный для получения препарата пробиотического действия, рекомендуемого для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы, рыбы.
Изобретение поясняется примерами.
Пример 1. Бактериальная геморрагическая септицемия карпа.
В прудовом хозяйстве заболели двухлетки карпа с клиническими признаками бактериальной геморрагической септицемии. Количество больных рыб достигало 43%. Лабораторный анализ патматериала подтвердил наличие поливидовой патогенной микрофлоры во внутренних органах рыб. Назначено лечение с добавлением в корм путем его смачивания 2,5 млн. микробных клеток (спор) "Субтилис" на 1 кг живой массы тела рыбы. Корм с "Субтилис" давали рыбе 1 раз в день в течение 5 дней. Через 10 дней после окончания курса лечения установлено, что количество больных рыб уменьшилось до 4%, а признаки острого воспаления остались лишь у отдельных экземпляров. Поверхность тела рыб стала равномерно ослизнена.
Пример 2. Аэромоноз (краснуха) карпа.
В прудовом хозяйстве при резком изменении условий внешней среды трехлетки карпа заболели аэромонозом (краснухой) с наличием ярких признаков острой стадии болезни и гибелью рыбы. Ежедневная гибель рыб составила 5% от общего количества. Бактериологически установлено преобладание аэромонад, составивших более 80% от общего количества выделенных из рыбы патогенов. Назначен курс лечения кормом, смоченным "Субтилис", в дозировке 2,5 млн. спор на 1 кг живой массы тела рыбы. В связи с пониженной поедаемостью курс дачи корма был определен 1 раз в день в течение 7 суток. Уже на 5-е сутки кормления гибель рыбы уменьшилась до 0,3-06% от общего количества, на 20-е сутки после окончания курса наступило общее оздоровление стада.
Пример 3. Некроз плавников форели.
В форелевом хозяйстве наблюдалось поражение форелей острой формой некроза плавников. Микробиологическое исследование патматериала выявило наличие в нем патогенов кишечной палочки, энтеробактера, цитробактера и аэромонас (Aeromonas verenii, Aeromonas caviae). Совместное культивирование "Субтилис" с этой ассоциацией микроорганизмов показало его антагонистическую активность и вызвало полную гибель патогенов на 4-е сутки. Дозировка "Субтилис" составляла 1-2 млрд. спор.
Пример 4. Сохранность цыплят в первые недели.
На крупной птицефабрике проведены производственные испытания эффективности "Субтилис" на сохранность цыплят в первые две недели после их посадки. Программа испытаний предусматривала уточнение оптимальных дозировок "Субтилис", а также его применение в жидком и лиофильно высушенном видах. Отход цыплят контрольной группы составил 2,38%. Усредненный отход в опытных группах составил: при даче лиофильно высушенного "Субтилис" с кормом - 1,33%, при выпаивании жидкого "Субтилис" - 0,33%. В опытных группах цыплята более интенсивно набирали вес. Результаты взвешивания после первых трех дней дали для контрольной группы 61 г, для опытной - 70 г.
Пример 5. Заболевания новорожденных поросят.
На крупном комплексе по выращиванию свиней в течение продолжительного времени наблюдался значительный (до 70-80%) отход поросят в связи с заболеваниями желудочно-кишечного тракта. Проведенные микробиологические и патологоанатомические исследования выявили у поросят несколько видов заболеваний ЖКТ бактериальной этиологии, среди которых наиболее существенным были признаки гастроэнтерополита. Назначен курс лечения: применение "Субтилис" внутрь сразу после рождения из расчета 1 доза на 5 поросят на 10% глюкозе в течение 4-5 дней. Курс профилактики: применение "Субтилис" внутрь из расчета 1 доза на 10 новорожденных поросят на 10% глюкозе в течение 3 дней. Сохранность поросят поднялась до 92,5% и стабильно поддерживается профилактикой на этом уровне.
Проведенные исследования показали эффективность приведенных количеств пробиотического препарата, добавляемого в корм.
Изобретение относится к биотехнологии, ветеринарии и может быть использовано для получения препарата из группы пробиотиков. Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКМ В-2250Д выделен из почвы. Клетки грамположительны, капсулы не образуют, образуют круглые споры, тип дыхания аэробный. Гидролизует глюкозу, маннит. Не сбраживает сахарозу, инозит, сорбит, мальтозу, лактозу. Не образует газа при сбраживании. Подавляет рост стафилококков, кишечной палочки, энтеробактерий, цитробактерий, аэромонас. Штамм используют как производственный для получения пробиотического препарата "Субтилис". Препарат нормализует деятельность желудочно-кишечного тракта животных, птицы, рыб; перспективен в лечении и профилактике бактериальных инфекций. 1 табл.
Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКМ В-2250Д, используемый для получения пробиотического препарата "Субтилис", предназначенного для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы и рыбы.
