СПОСОБ ИНДИКАЦИИ ГОСПИТАЛЬНЫХ ШТАММОВ P.aeruginosa, S.aureus, E.cloacae Российский патент 2011 года по МПК C12Q1/24 C12N1/20 C12R1/185 C12R1/385 C12R1/445 

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологической лабораторной диагностике инфекционных заболеваний.

В Тюменской области за 17 лет (1993-2009 гг.) зарегистрировано 17989 (показатель 0,72 на 1000 человек) внутрибольничных инфекций (ВБИ) [Доклад о санитарно-эпидемиологической обстановке в Тюменской области в 2009 г. - Тюмень, 2010. - С.182-186]. В родовспомогательных, хирургических, педиатрических стационарах периодически возникают различные по этиологии госпитальные инфекции [М.Г.Шандала. Не вакциной единой здоров человек. Дезинфектологические аспекты профилактики и борьбы с инфекционными заболеваниями. / Экономика и медицина сегодня. - 2007. - №6; www.mee.ru. - М.Г.Шандала. // Актуальные вопросы общей дезинфектологии: избранные лекции. - М.: Медицина, 2009. - С.8-15], поэтому актуальным является дифференциация выделенных штаммов в больничных учреждениях по их эпидемиологической активности. Спорадические штаммы вызывают единичные случаи заболеваний, а госпитальные штаммы вызывают внутрибольничные инфекции, вызывающие значительное увеличение сроков пребывания больных в стационарах и увеличивают материальные затраты на лечение больных. Ущерб от таких инфекций составляет от 5 до 10 млрд долларов США в год [P.P.Ахмедова с соавт. / Микробиологический мониторинг объектов окружающей среды в обеспечении эпидемиологического надзора за внутрибольничными инфекциями. // Тез. докл. II Российск. научно-практ. конф. с межд. участием. - М., 1999. - С.28].

Для выявления циркуляции госпитальных штаммов используют методы идентификации микроорганизмов [А.С.Лабинская // Микробиология. М., 1978. - 367 с.] с дополнительной проверкой свойств выделенных микроорганизмов, позволяющих их отнести к госпитальным [С.В.Сидоров с соавт. / Госпитальные инфекции … // Антибиотики и химиотерапия. - 1999. - 44. - 3. - С.25; Х.И.Исхакова, Л.Г.Баженов. Госпитальные штаммы … в хирургической клинике. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 1991, №9. - С.27]. В микробиологической практике для выявления циркуляции госпитальных штаммов широко используют методы эпидемиологического маркирования, основанные на внутривидовой идентификации бактерий [Н.С.Прямухина, О.Т.Морозова / Оценка внутрибольничной инфекции и микробной колонизации новорожденных с использованием эпидемиологического маркирования штаммов причастных микроорганизмов. // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 1996, №3. - С.24].

В качестве аналога выбран «Способ индикации эпидемических штаммов шигелл» [Патент RU №2324936, зарегистрирован 20.05.2008. - Бюл. №14], включающий идентификацию бактерий и определение электрического сопротивления раствора в пределах 2000 кОм через 1 час и 6 часов культивирования бактерий при температуре 37°С: при увеличении показателя электрического сопротивления раствора в 4,0-6,0 раз выделенный штамм шигелл относят к эпидемическому. Основными недостатками данного метода является отсутствие эпидемиологических данных о распространении возбудителей инфекции среди восприимчивых контингентов лечебно-профилактического учреждения (ЛПУ) и отсутствие микробиологических данных по идентификации Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterobacter cloacae.

В качестве прототипа выбран «Способ выявления госпитальных штаммов» [Патент RU №2245922, зарегистрирован 10.02.2005. - Бюл. №4], согласно которому наличие госпитального штамма определяют по антибиотикограмме, позволяющей выявить антибиотикорезистентность выделенного микроорганизма. Недостатками предложенного метода является длительность проведения микробиологических исследований и не учитываются особенности биологических свойств отдельных видов микроорганизмов.

Задача настоящего изобретения - разработка нового, объективного экспресс-способа индикации госпитальных штаммов, основанного на физико-химических свойствах поверхностных структур микроорганизма.

Технический результат - простой, не требующий больших материальных затрат на проведение индикации госпитальных штаммов, основанный на изучении эпидемиологической ситуации в очаге инфекции и на данных определения электропроводности бактерий в поле постоянного электрического тока, зависящей от поверхностного электрического заряда микробных клеток. В основе данного электрокинетического процесса лежит поток электронов, что позволяет отнести данное изобретение к нанотехнологии. Использован известный способ определения электрического сопротивления в жидкой среде по новому назначению, а именно для индикации госпитальных штаммов P.aeruginosa, S.aureus, E.cloacae.

Технический результат способа индикации госпитальных штаммов P.aeruginosa, S.aureus, E.cloacae, согласно изобретению включающий выполнение ряда манипуляций: идентификацию выделенной чистой культуры бактерий, посев идентифицированных бактерий на кровяной мясопептонный агар, смыв накопленных бактерий S.aureus - через 12 часов, a E.cloacae и P.aeruginosa - через 8 часов раствором хлорида натрия и определение электрического сопротивления взвеси бактерий в растворе хлорида натрия при концентрации бактерий в количестве 500000 в 1 мл в поле постоянного электрического тока при напряжении на электродах 2,8 вольт с последующим отнесением выделенных культур бактерий к госпитальным штаммам на основании показателей электрического сопротивления для бактерий P.aeruginosa от 579 до 674 кОм, S.aureus 545-642 кОм, E.cloacae 452-584 кОм и эпидемиологических данных о регистрации от одного источника инфекции 5 и более случаев заболеваний выделенным штаммом возбудителя инфекции.

Сущность способа достигается тем, что вокруг микробных клеток, находящихся в жидкой среде, формируется двойной электрический слой типа конденсора, одна обкладка которого - заряженная поверхность микробной клетки, а другая - ионы, находящиеся в жидкости и несущие противоположный заряд. По интенсивности потока электронов определяют электропроводность и электрическое сопротивление микробной взвеси. Дополнительным критерием, позволяющим отнести выделенный возбудитель инфекции к госпитальному штамму, являются эпидемиологические данные о регистрации вспышки инфекционного заболевания от одного источника инфекции.

Показатели электрического сопротивления бактерий свидетельствуют об изменении биологических свойств микроорганизма, выделенного от больных, что позволяет отнести данный возбудитель к госпитальному штамму. Таким образом, предложен новый метод эпидемиологического маркирования микроорганизмов по электропроводности бактерий.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

В бактериологической лаборатории исследуют материал, поступивший от инфекционного больного, получают чистую культуру бактерий и на основании бактериологических исследований идентифицируют наличие одного из трех видов возбудителей: P.aeruginosa, S.aureus, E.cloacae. Затем проводят посев идентифицированных бактерий на кровяной мясопептонный агар. Через 8-12 часов размножения бактерий осуществляют смыв их с поверхности данной питательной среды раствором хлорида натрия и определяют электрическое сопротивление взвеси бактерий в растворе хлорида натрия при концентрации бактерий в количестве 500000 в 1 мл в поле постоянного электрического тока при напряжении на электродах 2,8 В. Для определения электрического сопротивления бактерий используют цифровой мультиметр (Mini digital multimeter) марки М832 в пределе измерения 2000 кОм с разрешением 1 кОм и точностью ±0,8% единиц счета. Выделенную культуру бактерий относят к госпитальному штамму на основании показателей электрического сопротивления для каждой культуры и эпидемиологических данных о регистрации от одного источника инфекции 5 и более случаев заболеваний, вызванных данным штаммом. Показатель электрического сопротивления для штаммов P.aeruginosa составляет 579-674 кОм, S.aureus - 545-642 кОм, E.cloacae - 452-584 кОм.

Предложенный способ позволяет при выявлении циркуляции в ЛПУ госпитальных штаммов планировать проведение противоэпидемических мероприятий и проведение дезинфекционных мероприятий в соответствии с этиологией выделенного возбудителя инфекции. Предложенный способ дает объективные результаты и сокращает время проведения лабораторных исследований.

Примеры конкретного выполнения предлагаемого способа

Пример 1

В бактериологическую лабораторию поступил материал для идентификации возбудителя инфекции, выделенного от больного К., 46 лет, находящегося на лечении в хирургическом отделении. После получения чистой культуры бактерий идентифицирован возбудитель инфекции - P.aeruginosa. Данную культуру бактерий посеяли на кровяной мясопептонный агар и через 8 часов роста бактерий провели смыв их с поверхности данной питательной среды раствором хлорида натрия и определили электрическое сопротивление взвеси бактерий в растворе хлорида натрия при концентрации микробных клеток в количестве 500000 в 1 мл в поле постоянного электрического тока при напряжении на электродах 2,8 В, используя цифровой мультиметр (Mini digital multimeter) марки М832 в пределе измерения 2000 кОм с разрешением 1 кОм и точностью ±0,8% единиц счета. Показатель электрического сопротивления микробной взвеси P.aeruginosa составил 612 кОм. В хирургическом отделении за последние 10 дней от одного источника инфекции зарегистрировано 6 случаев инфекционных заболеваний, вызванных P.aeruginosa.

Выделенную культуру бактерий отнесли к госпитальному штамму на основании показателей электрического сопротивления данной культуры бактерий и эпидемической вспышки в хирургическом отделении, вызванной P.aeruginosa.

Пример 2

От больной Л., 26 лет, с гнойно-септической инфекцией, находящей на стационарном лечении в роддоме №2 г.Тюмени, поступил в бактериологическую лабораторию материал для выделения и идентификации возбудителя инфекционного заболевания. После получения чистой культуры бактерий идентифицирован возбудитель инфекции - S.aureus. Данную культуру бактерий посеяли на кровяной мясопептонный агар и через 12 часов роста бактерий провели смыв их с поверхности данной питательной среды раствором хлорида натрия и определили электрическое сопротивление взвеси бактерий в растворе хлорида натрия при концентрации микробных клеток в количестве 500000 в 1 мл в поле постоянного электрического тока при напряжении на электродах 2,8 В, используя цифровой мультиметр (Mini digital multimeter) марки М832 в пределе измерения 2000 кОм с разрешением 1 кОм и точностью ±0,8% единиц счета. Показатель электрического сопротивления микробной взвеси S.aureus составил 634 кОм. В роддоме №2 за последние 12 дней от одного источника инфекции зарегистрировано 5 случаев заболеваний, вызванных S.aureus.

Выделенную культуру бактерий отнесли к госпитальному штамму на основании показателей электрического сопротивления данной культуры бактерий и эпидемической вспышки в роддоме №2, вызванной S.aureus.

Пример 3

От больного С., 36 лет, находящегося на лечении в терапевтическом отделении ОКБ г.Тюмени, поступил в бактериологическую лабораторию инфекционный материал для исследования. После получения чистой культуры бактерий идентифицирован возбудитель инфекции - E.cloacae. Данную культуру бактерий посеяли на кровяной мясопептонный агар и через 8 часов роста бактерий провели смыв их с поверхности данной питательной среды раствором хлорида натрия и определили электрическое сопротивление взвеси бактерий в растворе хлорида натрия при концентрации микробных клеток в количестве 500000 в 1 мл в поле постоянного электрического тока при напряжении на электродах 2,8 В, используя цифровой мультиметр (Mini digital multimeter) марки М832 в пределе измерения 2000 кОм с разрешением 1 кОм и точностью ±0,8% единиц счета. Показатель электрического сопротивления микробной взвеси E.cloacae составил 508 кОм. В терапевтическом отделении ОКБ г.Тюмени за последние 13 дней от одного источника инфекции зарегистрировано 5 случаев заболеваний, вызванных E.cloacae.

Выделенную культуру бактерий отнесли к госпитальному штамму на основании показателей электрического сопротивления данной культуры бактерий и эпидемической вспышки в терапевтическом отделении ОКБ г.Тюмени, вызванной E.cloacae.

Приведенные примеры иллюстрируют возможность применения предложенного способа для индикации госпитальных штаммов P.aeruginosa, S.aureus, E.cloacae. Способ апробирован на базе отделения общей микробиологии ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Тюменской области». Исследование 12 культур спорадических и госпитальных штаммов вышеперечисленных микроорганизмов (табл.1). Установлено, что различия в показателях электрического сопротивления спорадических и госпитальных штаммов существенны (Р<0,05). Сравнительная характеристика предлагаемого способа и прототипа дана в таблице 2.

Предложенный экспресс-способ индикации госпитальных штаммов не требует больших материальных затрат, легко воспроизводим, объективен, позволяет сократить сроки выявления циркуляции госпитальных штаммов в больничных учреждениях, экономить расход материальных средств на проведение лабораторных исследований и сокращает время проведения лабораторных исследований, не требуется внутривидовой идентификации бактерий до вида по общепринятым методикам. При проведении 100 лабораторных исследований экономия составит 49,1 тыс. рублей. Достоверность индикации госпитальных штаммов данных микроорганизмов составляет 100%.

Способ индикации госпитальных штаммов P.aeruginosa, S.aureus, E.cloacae

Таблица 1 Показатели электрического сопротивления исследуемых микробных взвесей (в кОм) Вид микроорганизма Период роста бактерий (в часах) Электрическое сопротивление Достоверность результатов Спорадических штаммов Госпитальных штаммов P.aeruginosa 8 852,4±81,6 626,1±47,5 Р<0,05 S.aureus 12 740,5±50,9 593,1±48,5 Р<0,05 E.cloacae 8 739,8±66,0 518,0±66,0 Р<0,05

Способ индикации госпитальных штаммов P.aeruginosa, S.aureus, E.cloacae

Таблица 2 Отличительные признаки предложенного способа по сравнению с прототипом и экономические затраты по сравнению с общепринятыми методами лабораторных исследований Признаки Прототип Предлагаемый способ 1. Анализ эпидемической ситуации в ЛПУ Не проводился Проводился 2. Изучение электропроводности бактерий, зависящей от поверхностного электрического заряда микробных клеток Не проводилось Проводилось 3. Изучение культуральных, морфологических и тинкториальных свойств бактерий Проводилось Проводилось 4. Определение рода и вида возбудителя госпитальной инфекции Проводилось Не проводилось 5. Проведение внутривидовой идентификации бактерий Проводилось Не проводилось 6. Стоимость проведения лабораторных исследований по выявлению данных госпитальных штаммов, используя общепринятые методы лабораторных исследований 1005 руб 257 руб

Примечание: Для подтверждения достоверности индикации госпитального штамма по предложенному способу проводилась идентификация выделенного возбудителя до вида.

Способ индикации госпитальных штаммов Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterobacter cloacae предусматривает идентификацию выделенной чистой культуры бактерий, посев идентифицированных бактерий на кровяной мясопептонный агар, смыв накопленных бактерий S.aureus - через 12 часов, a E.cloacae и P.aeruginosa - через 8 часов раствором хлорида натрия. Определяют электрическое сопротивление взвеси бактерий в растворе хлорида натрия при концентрации бактерий в количестве 500000 в 1 мл в поле постоянного электрического тока при напряжении на электродах 2,8 вольт. На основании показателей электрического сопротивления для бактерий P.aeruginosa от 579 до 674 кОм, S.aureus 545-642 кОм, E.cloacae 452-584 кОм и эпидемиологических данных о регистрации 5 и более случаев заболеваний от одного источника инфекции, выделенный возбудитель инфекции относят к госпитальным штаммам. Изобретение позволяет сократить время проведения лабораторных исследований и выявления циркуляции госпитальных штаммов в больничных учреждениях. При использовании изобретения не требуется осуществлять внутривидовую идентификацию бактерий. 2 табл.

Способ индикации госпитальных штаммов Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterobacter cloacae, включающий выполнение ряда манипуляций: идентификацию выделенной чистой культуры бактерий, посев идентифицированных бактерий на кровяной мясопептонный агар, смыв накопленных бактерий S.aureus - через 12 ч, a E.cloacae и P.aeruginosa - через 8 ч раствором хлорида натрия и определение электрического сопротивления взвеси бактерий в растворе хлорида натрия при концентрации бактерий в количестве 500000 в 1 мл в поле постоянного электрического тока при напряжении на электродах 2,8 В с последующим отнесением выделенных культур бактерий к госпитальным штаммам на основании показателей электрического сопротивления бактерий P.aeruginosa от 579 до 674 кОм, S.aureus 545-642 кОм, E.cloacae 452-584 кОм и эпидемиологических данных о регистрации от одного источника инфекции 5 и более случаев заболеваний выделенным штаммом возбудителя инфекции.