СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАТОГЕННЫХ СТАФИЛОКОККОВ ПО ПЛАЗМОКОАГУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ Российский патент 2008 года по МПК C12Q1/14 C12R1/44 

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологической лабораторной диагностике инфекционных заболеваний.

Плазмокоагулирующая активность является одним из основных признаков патогенности стафилококков (Staphylococcus aureus). До настоящего времени в периодической и патентной литературе не описано объективных методов регистрации плазмокоагулирующей активности бактерий, позволяющих с помощью приборов зарегистрировать коагуляцию плазмы микроорганизмами.

В микробиологической практике способность бактерий вызывать коагуляцию плазмы определяют визуально в течение 18 часов культивирования бактерий (Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М., Медицина. - 1978. - С.167). Данный способ выявления фермента плазмокоагулазы у патогенных стафилококков выбран в качестве прототипа. Способ заключается в следующем: в две пробирки наливают по 0,5 мл плазмы, разбавленной 1:5 изотоническим раствором хлорида натрия, затем в каждую пробирку вносят по 1 петле 18-20-часовой культуры стафилококка. Одну пробирку (опытную) засевают исследуемой культурой бактерий, вторую (первый контроль) - заведомо патогенным, плазмокоагулирующим штаммом стафилококка. Засеянные пробирки выдерживают в течение 3 ч. Если за указанное время коагуляции плазмы в опытной пробирке не происходит, пробирки оставляют при комнатной температуре еще на 18 ч. Если и через это время свертывания плазмы не произойдет, исследуемая культура является коагулазоотрицательной. Одновременно в термостат ставят несколько пробирок с плазмой (второй контроль), в которые не вносят бактерии. Если в одной из пробирок второго контроля наступает коагуляция плазмы, обусловленная микробным загрязнением, результат опыта не учитывают.

Одним из существенных недостатков прототипа является субъективное определение изменения вязкости раствора в опытной пробирке по сравнению с контрольными. Окончательный учет наличия плазмокоагулирующей активности бактерий проводят через 18 часов, и в течение этого времени сотрудник лаборатории периодически (через каждые 10-20 мин) просматривает пробирки с посевами исследуемых культур для выявления плазмокоагулирующей активности бактерий. Если сотрудник лаборатории вовремя не просмотрел пробирки (в момент коагуляции плазмы), то процесс идет в обратном направлении, то есть из желеобразного состояния раствор приобретает жидкую консистенцию. В данном случае лаборатория может дать ложноотрицательный результат лабораторного исследования на наличие фермента плазмокоагулазы.

Задачей настоящего изобретения является разработка нового, объективного, экономичного экспресс-способа определения плазмокоагулирующей активности стафилококков.

Технический результат - простой, не требующий больших материальных затрат определения патогенных стафилококков по плазмокоагулирующей активности, позволяющий сократить сроки проведения исследований, повысить точность проведения лабораторного анализа и создающий возможность автоматизации в процессе регистрации плазмокоагулирующей активности стафилококка, основанный на определении показателей электрического сопротивления микробной взвеси в растворе плазмы. Использован известный способ определения электрического сопротивления растворов по новому назначению, а именно для выявления патогенных стафилококков по плазмокоагулирующей активности.

Технический результат достигается тем, что способ определения патогенных стафилококков по плазмокоагулирующей активности предусматривает внесение 12-часовой культуры стафилококка в плазму, разведенную изотоническим раствором хлорида натрия, инкубирование микробной взвеси при температуре 37°С в течение 5 часов, регистрацию электрического сопротивления микробной взвеси с 3-го до 5-го часа инкубирования, причем при показателях сопротивления раствора 64-84 кОм делают заключение о патогенности стафилококка по наличию плазмокоагулирующей активности.

Сущность изобретения достигается тем, что использован объективный способ регистрации плазмокоагулирующей активности бактерий по показателям электрического сопротивления раствора, позволяющий автоматизировать процесс выявления патогенных штаммов стафилококков (S.aureus) по плазмокоагулирующей активности, в результате этого освобождается от работы сотрудник лаборатории, регистрирующий плазмокоагулирующую активность бактерий, экономится расход питательных сред и создается возможность объективно с высокой точностью за 5 часов проводить значительно большее количество лабораторных анализов по определению плазмокоагулирующей активности микробных взвесей.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Используют 12-ти часовую культуру стафилококка. Микробную взвесь в количестве 0,1 мл, содержащую 10⁷ КОЕ/мл, вносят в пробирку с 0,3 мл плазмы, разбавленной 1:5 изотоническим раствором хлорида натрия. В пробирки с микробной взвесью вводят стальные электроды, соединенные с пишущим устройством, регистрирующим электрическое сопротивление раствора в пределе 2000 кОм. Микробную взвесь инкубируют при 37°С в течение 5 часов. При показаниях электрического сопротивления раствора от 64 до 84 кОм за период с 3-го до 5-го часа инкубирования микробной взвеси делают заключение о патогенности стафилококка по наличию плазмокоагулирующей активности.

Предложенный способ определения патогенных стафилококков (S. aureus) по плазмокоагулирующей активности (по сравнению с прототипом) позволяет экономить расход питательных сред, сокращает время проведения лабораторных исследований, дает объективные результаты исследований и создает возможность автоматизировать процесс определения плазмокоагулирующей активности микробной взвеси.

Примеры конкретного выполнения предлагаемого способа

Пример 1

У больного К. 37 лет, находящегося на лечении в отделении гнойной хирургии Областной клинической больницы (ОКБ) №1 г.Тюмени, из раны выделена культура S.aureus. Идентификация возбудителя проведена до вида в бактериологической лаборатории ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Тюменской области» по общепринятым тестам для стафилококков: наличие гемолизинов, пигментов, лецитиназы на желточно-солевом агаре, плазмокоагулазы, каталазы, ферментации маннита в аэробных и анаэробных условиях, ферментации глюкозы в аэробных и анаэробных условиях.

Для определения плазмокоагулирующей активности с помощью предложенного способа взята 12-часовая культура стафилококка, выделенного от больного. Концентрацию микробной взвеси готовили по стандартной методике (МУК 4.2.1890-04). Использовали стандарт 0,5 по МакФарланду. Микробную взвесь в количестве 0,1 мл, содержащую 10⁷ КОЕ/мл, внесли в пробирку с 0,3 мл плазмы, разбавленной 1:5 изотоническим раствором хлорида натрия. В пробирку с микробной взвесью поместили два стальных электрода, соединили их с пишущим устройством, регистрирующим сопротивление раствора в пределе 2000 кОм. Микробную взвесь инкубировали при 37°С в течение 5 часов. Через 3 часа 15 мин визуально установлена коагуляция плазмы. Одновременно зарегистрированы показания самопишущего устройства, регистрирующего электрическое сопротивление раствора. Показания регистрирующего устройства - 64 кОм. Выделенную культуру бактерий отнесли к плазмокоагулирующей.

Пример 2

Больной В. 57 лет, находился на лечении в Областной клинической больнице №19 г.Тюмени по поводу гнойного конъюнктивита. Из гнойного отделяемого выделена культура S.aureus. Идентификация возбудителя проведена до вида в бактериологической лаборатории ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Тюменской области» по общепринятым тестам для стафилококков: наличие гемолизинов, пигментов, лецитиназы на желточно-солевом агаре, плазмокоагулазы, каталазы, ферментации маннита в аэробных и анаэробных условиях, ферментации глюкозы в аэробных и анаэробных условиях.

Для определения плазмокоагулирующей активности с помощью предложенного способа взята 12-часовая культура выделенного стафилококка. Концентрацию микробной взвеси определяли по МакФарланду, используя стандарт 0,5. Микробную взвесь в количестве 0,1 мл, содержащую 10⁷ КОЕ/мл, внесли в пробирку с 0,3 мл плазмы, разбавленной 1:5 изотоническим раствором хлорида натрия. В пробирку с микробной взвесью поместили два стальных электрода и определяли электрическое сопротивление раствора в пределе 2000 кОм, используя цифровой мультиметр М-832. Микробную взвесь инкубировали при 37°С в течение 5 часов. Через 3 часа 50 мин визуально установлена коагуляция плазмы. Одновременно зарегистрированы показания электрического сопротивления раствора 74 кОм. Выделенную культуру бактерий отнесли к плазмокоагулирующей.

Пример 3

При плановом бактериологическом исследовании на наличие S.aureus на объектах внешней среды отделения гнойной хирургии Областной клинической больницы №1 г.Тюмени проведен смыв с рук сотрудника отделения больницы К. 32 лет. В бактериологической лаборатории ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Тюменской области» у сотрудника К. с рук выделена культура S.aureus. Идентификация возбудителя проведена до вида по общепринятым тестам для стафилококков.

Для определения плазмокоагулирующей активности с помощью предложенного способа взята 12-часовая культура выделенного стафилококка. Концентрацию микробной взвеси определяли по МакФарланду, используя стандарт 0,5. Микробную взвесь в количестве 0,1 мл, содержащую 10⁷ КОЕ/мл, внесли в пробирку с 0,3 мл плазмы, разбавленной 1:5 изотоническим раствором хлорида натрия. В пробирку с микробной взвесью поместили два стальных электрода, соединили их с пишущим устройством, регистрирующим сопротивление раствора в пределе 2000 кОм. Взвесь бактерий инкубировали при 37°С в течение 5 часов. Через 3 часа 40 мин визуально установлена в растворе коагуляция плазмы. Одновременно зарегистрированы показания самопишущего устройства, регистрирующего электрическое сопротивление раствора, которое составило 84 кОм. Выделенную культуру бактерий отнесли к плазмокоагулирующей.

Приведенные примеры иллюстрируют возможность применения предложенного способа для определения патогенных штаммов Staphylococcus aureus по плазмокоагулирующей активности. Способ апробирован на базе бактериологической лаборатории ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Тюменской области». Проведено определение плазмокоагулирующей активности 10 штаммов Staphylococcus aureus, выделенных от больных и с объектов окружающей среды в больничных помещениях. Результаты исследований представлены в таблице.

Предложенный способ определения патогенных стафилококков по плазмокоагулирующей активности не требует больших материальных затрат, легко воспроизводим, сокращает сроки проведения исследований, создает возможность автоматизировать процесс выявления патогенных стафилококков по плазмокоагулирующей активности и дает объективные данные лабораторных исследований, позволяющих выявлять патогенные штаммы стафилококков по плазмокоагулирующую активности с точностью 100%.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической лабораторной диагностике инфекционных заболеваний. Способ предусматривает внесение 12-часовой культуры стафилококка в плазму, разведенную изотоническим раствором хлорида натрия. Полученную микробную взвесь инкубируют при температуре 37°С в течение 5 часов. Регистрируют электрическое сопротивление микробной взвеси с 3-го до 5-го часа инкубирования. Причем при показателях сопротивления раствора 64-84 кОм делают заключение о патогенности стафилококка по наличию плазмокоагулирующей активности. Изобретение позволяет сократить сроки проведения исследований и повысить точность анализа.

Способ определения патогенных стафилококков по плазмокоагулирующей активности, предусматривающий внесение 12-часовой культуры стафилококка в плазму, разведенную изотоническим раствором хлорида натрия, инкубирование микробной взвеси при температуре 37°С в течение 5 ч, регистрацию электрического сопротивления микробной взвеси с 3-го до 5-го часа инкубирования, причем при показателях сопротивления раствора 64-84 кОм делают заключение о патогенности стафилококка по наличию плазмокоагулирующей активности.