СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАКСИМАЛЬНОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ ЖИВЫХ БАКТЕРИЙ Российский патент 2012 года по МПК C12Q1/06 G01N33/483 

Способ относится к области медицины, а именно к микробиологии, и предназначен для определения концентрации бактерий в питательных средах.

Совершенствование методов определения концентрации бактерий в различных суспензиях является актуальным до настоящего времени. В процессе культивирования бактерий в питательных средах происходит сложный биологический процесс, связанный с питанием бактерий и накоплением продуктов их обмена. Размножение бактерий завершается процессом их отмирания [Рост и способы размножения бактерий. С.62-66. В кн.: Медицинская микробиология, вирусология и иммунология / ред. А.А.Воробьева. - М., 2004. - 691 с.]. Необходимость определения концентрации микробных клеток (мк) в суспензиях возникает при получении стандартных диагностических, лечебных и профилактических препаратов. Диагноз инфекционного заболевания ставят на основании определения рода и вида возбудителя. Более эффективна идентификация бактерий в сроки максимальной концентрации живых микробных клеток в процессе роста бактерий на питательных средах.

Известен способ определения концентрации микробных клеток по стандарту мутности, регистрирующий суммарное количество живых и отмирающих микробных клеток [Патент RU №2285257 C2. Бюл. №28 от 10.10.2006 г.]. Данный способ не дает возможности определить концентрацию живых микробных клеток и сроки их максимального накопления.

Известен метод определения количества живых микробных клеток по результатам посева на плотную питательную среду и подсчету выросших колоний из отдельных микробных клеток [Определение общего числа бактерий в воде. С.304-306. В кн.: Микробиология с техникой микробиологических исследований. М., Медицина, 1978, 394 с.], выбранный нами в качестве прототипа. Однако данный метод имеет существенные недостатки: 1) нельзя определить концентрацию живых микробных клеток в процессе культивирования бактерий в питательных средах; 2) результат определения количества живых микробных клеток в исследуемых пробах можно получить только через 24 часа роста изолированных микробных клеток на плотной питательной среде (в этот срок в исследуемой популяции, обычно, завершается процесс отмирания микробных клеток); 3) для осуществления метода требуются дополнительные затраты на питательные среды и временные затраты специалистов микробиологической лаборатории (титрование исследуемой популяции бактерий, подсчет количества выросших колоний из отдельных микробных клеток, математический расчет концентрации микробных клеток в исследуемой пробе).

Задачей настоящего изобретения является разработка экспресс-способа определения максимальной концентрации живых микробных клеток в процессе их культивирования на питательных средах. Под максимальной концентрацией живых бактерий в суспензии понимается необходимая концентрация бактерий, достаточная для проведения идентификации выделенных бактерий от больного. На основании изложенного следует, что задачей настоящего изобретения является качественная, а не количественная оценка максимальной концентрации живых бактерий.

Технический результат. Способ основан на электрокинетических свойствах микробных клеток в жидкой среде и способности их в поле постоянного электрического тока обладать определенным электрическим сопротивлением.

Теоретическое обоснование возможности определения электрического сопротивления биологических частиц нашло отражение в теории Г.Гельмгольца - Ж.Перена, согласно которой на поверхности биологических частиц, находящихся в жидкой среде, возникает двойной электрический слой типа конденсора, одна обкладка которого - заряженная поверхность биологической частицы, а другая - ионы, находящиеся в жидкости и несущие противоположный заряд. Установлено, что бактерии на своей поверхности имеют определенный по величине и знаку электрический заряд. Электрокинетические свойства бактерий могут меняться в процессе питания микроорганизмов, что приводит к изменению показателей электрического сопротивления бактерий и свидетельствует об их жизнеспособности. На основании изучения электрокинетических свойств бактерий А.Д.Евтушенко предложил устройство для обнаружения бактерий [А.С. №288898, 1971. Бюл. №7].

Технический результат предложенного нами способа достигается тем, что бактерии в жидкой среде в поле постоянного электрического тока обладают определенным электрическим сопротивлением. В связи с этим взвесь бактерий по стандарту мутности в 5 единиц доводят до концентрации 500000 мк в 1 мл и определяют в поле постоянного электрического тока при напряжении 2,8 В на разомкнутых концах электродов электрическое сопротивление, показатель которого в пределах 900-1500 кОм свидетельствует о концентрации в суспензии живых бактерий в достаточном количестве для проведения идентификации бактерий.

Способ осуществляется следующим образом. Исследуемую взвесь бактерий в жидкой среде доводят по стандарту мутности на 5 единиц до концентрации 500000 мк в 1 мл взвеси. Полученную взвесь бактерий в объеме 2,0 мл помещают в лунку плексигласовой пластины, обычно используемой в лабораторной практике для серологических реакций. С помощью цифрового мультиметра (Mini digital multimeter) марки М832 в пределе измерения 2000 кОм с разрешением 1 кОм и точностью ±0,8% единиц счета, при максимальном напряжении на электродах 2,8 В проводят определение электрического сопротивления взвеси бактерий. При показателе электрического сопротивления в пределах 900-1500 кОм регистрируется концентрация живых микробных клеток, достаточная для проведения идентификации бактерий.

Примеры использования предлагаемого способа

Пример 1.

Через 15 часов роста спорадической культуры Staphylococcus aureus на кровяном мясопептонном агаре (МПА) проведен смыв выросших колоний бактерий физиологическим раствором хлорида натрия и концентрация бактерий доведена до 500000 мк в 1 мл по стандарту мутности в 5 единиц. С помощью цифрового мультиметра (Mini digital multimeter) марки М832 в пределе измерения 2000 кОм с разрешением 1 кОм и точностью ±0,8% единиц счета, при напряжении на электродах 2,8 В проведено определение электрического сопротивления взвеси бактерий. Меняющиеся показатели сопротивления достигли 1260 кОм. Концентрация бактерий в данной взвеси по результатам подсчета выросших колоний из отдельных микробных клеток (мк) на плотной питательной среде составила 2,4·10¹² мк в 1 мл.

Пример 2.

Через 12 часов роста спорадической культуры Proteus mirabilis на кровяном МПА проведен смыв выросших колоний физиологическим раствором хлорида натрия и концентрация бактерий доведена до 500000 мк в 1 мл по стандарту мутности в 5 единиц. С помощью цифрового мультиметра (Mini digital multimeter) марки М832 в пределе измерения 2000 кОм с разрешением 1 кОм и точностью ±0,8% единиц счета, при напряжении на электродах 2,8 В проведено определение электрического сопротивления взвеси бактерий. Меняющиеся показатели сопротивления достигли 1490 кОм. Концентрация микробных клеток в данной взвеси по результатам подсчета выросших колоний на плотной питательной среде из отдельных микробных клеток составила 2,6·10¹² мк в 1 мл.

Пример 3.

Через 10 часов роста госпитального штамма культуры Citrobacter freundii на кровяном МПА проведен смыв выросших бактерии физиологическим раствором хлорида натрия и концентрация бактерий доведена до 500000 мк в 1 мл по стандарту мутности в 5 единиц. С помощью цифрового мультиметра (Mini digital multimeter) марки М832 в пределе измерения 2000 кОм с разрешением 1 кОм и точностью ±0,8% единиц счета, при напряжении на электродах 2,8 В проведено определение электрического сопротивления взвеси бактерий. Меняющиеся показатели сопротивления достигли 1115 кОм. Концентрация бактерий в данной взвеси по результатам подсчета выросших колоний из отдельных микробных клеток на плотной питательной среде составила 1,4·10⁹ мк в 1 мл.

Пример 4.

Через 13 часов роста госпитального штамма культуры Pseudomonas aeruginosa на кровяном МПА проведен смыв выросших бактерий физиологическим раствором хлорида натрия и концентрация бактерий доведена до 500000 мк в 1 мл по стандарту мутности в 5 единиц. С помощью цифрового мультиметра (Mini digital multimeter) марки М832 в пределе измерения 2000 кОм с разрешением 1 кОм и точностью ±0,8% единиц счета, при напряжении на электродах 2,8 В проведено определение электрического сопротивления взвеси бактерий. Меняющиеся показатели сопротивления достигли 926 кОм. Концентрация бактерий в данной взвеси по результатам подсчета выросших колоний из отдельных микробных клеток на плотной питательной среде составила 6,0·10¹⁰ мк в 1 мл.

Способ определения концентрации живых бактерий в процессе их культивирования на питательных средах по их электрическому сопротивлению внедрен на базе отделения общей микробиологии ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Тюменской области». Электрическое сопротивление определяли у госпитальных и спорадических штаммов следующих видов бактерий: Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Citrobacter freundii, Hafnia alvei, Staphylococcus aureus, Enterobacter cloacae. Всего проведено 48 исследований.

Оценка экономического и положительного (значительное ускорение получения результатов анализа) эффекта предлагаемого способа проведена в сравнении с прототипом и представлена в таблице.

Предложенный нами способ позволяет получить концентрацию живых микробных клеток, необходимую для проведения идентификации бактерий, выделенных от больных, сокращает время проведения исследований, не требует больших материальных затрат. Общий экономический эффект на проведение 100 анализов составил 343980 рублей.

Таблица Характеристика положительного эффекта определения максимальной концентрации живых бактерий по предложенному способу и прототипу Признак Прототип Предлагаемый способ Длительность проведения одного анализа 24 часа 3-5 минут Расход питательных сред на проведение одного анализа (в рублях) 1250 руб. Питательные среды не требуются Расход лабораторной посуды на проведение 1 анализа 25 чашек для культивирования бактерий, 15 бактериологических пробирок и 15 пипеток на сумму 661 руб. 1 лунка из 72 плексигласовой пластины Подготовка лабораторной посуды для анализа Мытье посуды, закупорка, стерилизация Не требуется Временные затраты специалистов микробиологической лаборатории на проведение 1 анализа 9 часов (1530 руб.) 3-5 минут Стоимость устройства для измерения сопротивления взвеси бактерий Не используется 120 рублей Общие затраты на проведение 1 анализа 3441 рублей 120 рублей Затраты на проведение 100 исследований 344100 рублей 120 рублей Примечание Лабораторная посуда и прибор для измерения сопротивления взвеси бактерий используются многократно.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ определения максимальной концентрации живых бактерий. Взвесь бактерий по стандарту мутности в 5 единиц доводят до концентрации 500000 мк в 1 мл. Затем в поле постоянного электрического тока при максимальном напряжении на разомкнутых концах электродов 2,8 В определяют электрическое сопротивление взвеси. Максимальный показатель сопротивления в пределах 900-1500 кОм свидетельствует о максимальной концентрации живых бактерий в суспензиях различных видов микроорганизмов. Предложенный способ позволяет качественно оценить концентрацию живых бактерий, достаточную для их дальнейшей идентификации, и сокращает время проведения анализа. 1 табл., 4 пр.

Способ определения максимальной концентрации живых бактерий, отличающийся тем, что взвесь бактерий по стандарту мутности в 5 единиц доводят до концентрации 500000 микробных клеток в 1 мл и определяют в поле постоянного электрического тока при максимальном напряжении 2,8 В на разомкнутых концах электродов электрическое сопротивление, максимальный показатель которого в пределах 900-1500 кОм свидетельствует о максимальной концентрации живых бактерий в суспензии.