СРЕДСТВО ДЛЯ ПРЕОДОЛЕНИЯ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ Российский патент 2011 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 A61P43/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, и может быть использовано для устранения множественной лекарственной устойчивости у онкологических и инфекционных больных, длительно получающих химиопрепараты.

Возникновение множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) опухолевых клеток, грамм-отрицательных бактерий и простейших к цитостатическим и антимикробным препаратам возникает в результате активации естественных защитных механизмов клетки. Такие механизмы посредством АТФ-зависимых транспортных белков обеспечивают интенсивное откачивание из клетки любых токсических соединений, включая химиотерапевтические агенты. Усиление интенсивности работы транспортного насоса клеток в период химиотерапии вызывает резкое падение концентрации препаратов в клетке и, таким образом, снижает терапевтическое действие лекарственных препаратов у больных бактериальными, паразитарными, грибковыми инфекциями и онкологическими заболеваниями. Из перечисленного широкого спектра заболеваний, лечение которых осложняется, а порой становится невозможно из-за развития МЛУ, очевидна полезность создания эффективных лекарственных средств преодоления МЛУ.

В клетках млекопитающих за МЛУ ответственны, в основном, два типа транспортных белков: белки множественной лекарственной резистентности - multidrug resistance (MRP) и Р-гликопротеин - Р-glycoprotein (P-gp). MRP и P-gp обнаружены в опухолях различного происхождения: лимфомах, саркомах, карциномах и нейробластомах.

Субстратами для обоих типов транспортных белков является широкий спектр противоопухолевых соединений: антрациклины, этопозид, винкристин, таксол и др. Однако, в отличие от P-gp, MRP транспортирует различные соединения из клеток в виде коньюгатов с глутатионом или глюкуроновой кислотой. В результате работы транспортных белков цитостатические препараты поступают во внеклеточное пространство и опухолевые клетки приобретают устойчивость одновременно ко множеству лекарственных препаратов.

Известно, что целый ряд соединений ингибируют активность транспортного белка P-gp и тормозят выведение химиопрепаратов из клеток. По физико-химическим свойствам все известные соединения ингибиторы МЛУ объединяют признаки низкой молекулярной массы, наличия гидрофобных физико-химических свойств и присутствия ароматического кольца в молекуле. К числу ингибиторов МЛУ относят препараты следующих групп: блокаторы кальциевых каналов, ингибиторы кальмодулина, коронарные вазодилятаторы, алкалоиды индола, гормоны, циклоспорины, сурфактанты и антибиотики [(Krishna R., Mayer R.D., Eur. J. Pharmacol. Sci. 2000. Vol.11. №4. 265-283)].

Однако указанные препараты обладают низкой удельной активностью в отношении ингибирования МЛУ опухолевых клеток. Так, блокаторы кальциевых каналов, например верапамил, обладают ингибирующей активностью in vitro в дозе порядка 10 мкМ.

Другая известная группа препаратов - антагонисты кальмодулина: трифторперазин, хлорпромазин, прохлорперазин проявляют способность снижать резистентность опухолевых клеток к химиопрепаратам только при относительно высоких концентрациях порядка 5-50 мкМ. Однако клиническое применение известных препаратов для преодоления МЛУ оказывается невозможным. Введение известных препаратов в действующих концентрациях экспериментальным животным требует их назначения в таких высоких дозах, которые вызывают летальные исходы или тяжелые осложнения [Sandor V., Fojo,T., Bates S.E. Drug Res. Updates 1998. V.1, 190-200]. Тяжелые токсические реакции известных ингибиторов МЛУ не позволяют их использовать у больных для преодоления МЛУ. Поэтому до настоящего времени не существует препаратов, обеспечивающих возможность преодоления МЛУ у онкологических или инфекционных больных.

Развитие МЛУ опухолевых клеток определяется не только транспортерами P-gp, но и другими транспортными агентами, в том числе белками множественной лекарственной резистентности - MRP. Данный белок вызывает устойчивость к тем же химиопрепаратам, что и P-gp, но с несколько другим спектром перекрестной резистентности. Белки множественной лекарственной резистентности семейства MRP, в отличие от белков P-gp, обладают широким межвидовым представительством и контролируют появление МЛУ как опухолевых клеток, так и гельминтов, простейших и бактерий [Borst T., Kool M., Evers R. Sem. Cancer Biol. 1997. V.8, 205-213]. Поэтому препараты способные влиять на активность транспортных белков MRP имеют более широкий спектр действия по сравнению с препаратами, влияющими на активность транспортных белков P-gp. Первые могут влиять не только на формирование МЛУ опухолевых клеток, но и на проявление множественной лекарственной резистентности глистов, простейших, в том числе малярийного плазмодия, и бактерий.

Известно применение циклогексапептида структурной формулы цикло-лизил-гистидил-глицил-лизил-гистидил-глицин в качестве лекарственного средства для лечения иммунодефицитных состояний [Патент Российской Федерации RU 2157235 - Средство для лечения иммунодефицитных состояний]. Однако известная фармакологически активная субстанция не обладает способностью преодолевать МЛУ и отличается по химической формуле от предложенного гексапептида линейной структуры - лизил-гистидил-глицил-лизил-гистидил-глицин. Брутто формула C₂₈H₄₄O₆N₁₂. Молекулярная масса 644,7 Д. Поэтому рассмотрение касается совершенно разных химических соединений, обладающих разным действием: одно цикло-лизил-гистидил-глицил-лизил-гистидил-глицин влияет на иммунную систему, другое - лизил-гистидил-глицил-лизил-гистидил-глицин на множественную лекарственную устойчивость.

Одним из наиболее активных ингибиторов МЛУ, принимаемый за ближайший аналог настоящего изобретения, является известный лекарственный препарат, содержащий в качестве действующего вещества пептид - Циклоспорин А [Регистр лекарственных средств России, т.16, с.983-984, 2008]. Препарат нашел применение клинике в качестве иммунодепрессанта при трансплантации органов и тканей. Для преодоления МЛУ известный препарат применяют только в экспериментальных целях в культуре клеток. Циклоспорин А представляет собой гидрофобный циклический пептид структурной формулы:

Известный пептид Циклоспорин А подавляет МЛУ преимущественно путем конкурентного ингибирования АТФ-зависимых транспортных белков семейства P-gp. Действия на белки множественной лекарственной резистентности (MRP) Циклоспорин А практически не оказывает [Legrand О., Simonin G., Perrot J.Y. Blood. 1998. V.91. №12. 4480-4488]. Циклоспорин А в опытах in vitro ингибирует активность транспортных белков при концентрациях 0.5-2 мкМ. Циклоспорин А ингибирует МЛУ в опытах на животных и повышает эффективность действия доксорубицина на рост опухолей мышей. Однако его клиническое применение для преодоления МЛУ у больных оказывается невозможным, поскольку в эффективных дозах препарат оказывает мощное токсическое действие.

Предложенное изобретение направлено на создание лекарственного средства, обеспечивающего повышение эффективности преодоления множественной лекарственной устойчивости, увеличение специфичности действия в отношении транспортных белков множественной лекарственной резистентности (MRP), повышение безвредности, устранение токсических реакций и создание приемлемых лекарственных форм для профилактики и терапии больных с явлениями множественной лекарственной устойчивости.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в качестве средства для преодоления МЛУ к различным химиотерапевтическим препаратам используют гидрофильный гексапептид структурной формулы: лизил-гистидил-глицил-лизил-гистидил-глицин. Брутто-формула: С₂₈Н₄₆О₇N₁₂.

Краткое описание чертежей

На Фигуре 1 показано накопление кальцеина в клетках Р388 ВР в контроле (1) и после добавления 12 нМ гексапептида (2) в присутствии в среде ионов Со для тушение внеклеточного кальцеина.

На Фигуре 2 показана скорость выход кальцеина из предварительно нагруженных им клеток Р388 ВР в контроле (1) и после добавления 120 нМ гексапептида (2).

На Фигуре 3 показана кинетика выхода R123 из клеток Нер-2 в контроле (1) после добавления циклоспорина А 1 мкг/мл (2) и дигитонина 0.02% (3).

На Фигуре 4 показана кинетика выхода R123 из клеток Нер-2 в контроле (1) и после добавления циклоспорина А 1 мкг/мл (2).

На Фигуре 5 показана зависимость ингибирования скорости выхода R 123 (R) из клеток Нер-2 гексапептидом и циклоспорином А (Цс. А) от их концентраций.

На Фигуре 6 показана выживаемость клеток Нер-2 после воздействия 50 мкМ арсената с 1(2) и 100(3) мг/мл гексапептида.

На Фигуре 7 показано действие гексапептида на рост клеток Нер-2.

Предложенное средство содержит в качестве действующего вещества синтетический гексапептид молекулярной массой 662,7 Д.

Действующее вещество представляет собой белый порошок без запаха, легко растворимый в воде и изотоническом растворе хлорида натрия. Вещество не растворимо в спирте и хлороформе.

Предложенное средство для преодоления МЛУ содержит гексапептид в дозе 1-0,001% (10-0,01 мг). Лекарственные формы выпуска предложенного средства содержат стерильный раствор гексапептида для подкожных или внутримышечных инъекций в ампулах. В качестве стабилизатора средство содержит 1,0-0,5% раствор (10-0,5 мг) аминоуксусной кислоты. Лекарственная форма для подкожных или внутримышечных инъекций наиболее предпочтительна для применения в виде 0,005% стерильного раствора гексапептида в ампулах по 1,0 мл и 0,5% стабилизатора аминоуксусной кислоты. Срок хранения 2 года при 4-8 С°.

Лекарственная форма в виде спрея для дозированного интраназального применения наиболее предпочтительна во флаконах объемом 10,0-20,0 мл по 10-20 доз заявленного средства. Каждая доза содержит по 0,05-0,1 мг гексапептида и в качестве стабилизатора аминоуксусную кислоту в количестве 5-10 мг. В качестве консерванта раствор для дозированного интраназального применения содержит бензалкония хлорида от 0,0040 до 0,00012 г/мл. Наиболее предпочтительная лекарственная форма содержит разовую дозу 100 мкг гексапептида, 0,5% стабилизатора аминоуксусной кислоты и бензалкония хлорида 0,00010 г/мл. Срок хранения 2 года при 4-8 С°.

Лекарственная форма в виде ректальных или вагинальных суппозиториев содержит действующее вещество - гексапептид в разовой дозе 5-0,05 мг, в качестве стабилизатора аминоуксусную кислоту 20-0,5 мг (ВФС 42-599-92, НД 42-11253-00) или другого зарегистрированного в России аналогичного качества, твин 80 (Полисорбат 80) (ФС 42-2540-88) 120-150 мг, воды для инъекций (ФС 42-2620-97) и твердого жира (ФС 42-346-97, НД 42-8991-98) до получения суппозитория массой 1,2-2,5 г. Срок хранения 2 года при 4-8 С°.

Заявленное лекарственное средство обладает следующими новыми свойствами, которые не являются очевидными для специалиста в данной области техники:

- преодоление множественной лекарственной устойчивости клеток;

- специфичности действия в отношении транспортных белков множественной лекарственной резистентности (MRP);

- повышение безвредности;

- устранение токсических реакций организма;

- создание приемлемых лекарственных форм для профилактики и терапии больных с явлениями множественной лекарственной устойчивости.

Результаты доклинического и клинического изучения предложенного средства демонстрируют, что оно не вызывает выраженной токсической реакции или развитие побочных эффектов.

Экспериментальные и клинические данные показывают, что:

1. Гексапептид обеспечивает преодоление множественной лекарственной устойчивости в 3.000 раз эффективнее по сравнению с веществом по прототипу (пример 3, фиг.5) и обладает достаточной безопасностью в отношении опухолевого роста (пример 4, фиг.7).

2. Заявленное средство обладает специфичностью действия в отношении транспортных белков множественной лекарственной резистентности (MRP). Вещество по прототипу - циклоспорин А не обладает подобным действием (пример 3). Гексапептид в концентрации 1,2 нМ увеличивает в 3 раза чувствительность клеток рака гортани человека Нер-2 к специфическому ингибитору белка множественной лекарственной резистентности цитостатическому веществу - арсенату (фиг.4).

3. Гексапептид обладает исключительно низкой токсичностью и обеспечивает широкий резерв терапевтической безопасности. Разовая доза, в тысячу раз превышающая среднюю терапевтическую (1,5 мг/кг), не вызывает гибели экспериментальных животных.

4. В тесте изучения хронической токсичности предложенного лекарственного средства выявлена его безвредность. Колебания гематологических и биохимических показателей при назначении животным лекарственного средства ежедневно, в течение одного месяца, в терапевтической (1,5 мкг/кг) или 10-кратно превышающей терапевтическую (15 мкг/кг) дозе после отмены лекарственного средства возвращаются к исходному уровню.

5. Введение лекарственного средства не вызывает местно раздражающего действия, не обладает аллергенностью и мутагенной активностью.

Лекарственное средство показало хорошие клинические результаты в комплексной химиолучевой терапии рака шейки матки, рака пищевода и других злокачественных опухолей человека. Предложенное средство назначают курсами до начала химиолучевой терапии и в период ее проведения.

Эффективность терапии оценивают по клинико-лабораторным показателям, в том числе по степени патоморфоза опухоли, развитию токсических и лучевых реакций, непрерывности химиотерапии, состоянию окислительно-антиокислительной и иммунной систем организма. Лекарственное средство предпочтительно назначают курсами введения в разовой дозе 1-1,5 мкг/кг массы тела ежедневно перед началом химиолучевой терапии в течение 5-10 дней и непосредственно в период проведения курсов химиотерапии. При необходимости для купирования токсических реакций лекарственное средство назначают после окончания химиолучевой терапии в течение 2-3 недель.

Ниже представлены конкретные примеры получения заявленного вещества, а также примеры, подтверждающие его биологические и лечебные свойства.

Пример 1

Получение действующего вещества

Гексапептид синтезируют по методу твердофазного синтеза на автоматизированном синтезаторе "Beckman-990".

Аминометилполимеразу (1.8 г, 1 ммоль) дают набухнуть в хлороформе в течение 30 минут, затем присоединяют трет-бутоксикарбонил-Gly-ОСН₂С₆H₄СН₂СООН (0,65 г, 2 ммоль) с помощью N,N-дициклогексилкарбодиимид (ДЦГК) (0,4 г, 2 ммоль в 15 мл хлороформа в течение 2 часов). После промывки диметилформамидом полимер обрабатывают 20 мл смеси диизопропилэтиламин-уксусный ангидрид, 2:1 в течение 30 минут. После промывки диметилформамидом и хлороформом полимер обрабатывают 30 мл смеси трифторуксуная кислота-хлороформ 1:1 20 минут, промывают хлороформом и нейтрализуют 7% раствором диизопропилэтиламина в диметилформамиде в течение 10 минут, затем аминоацилполимер промывают диметилформамидом. Присоединения трет-бутоксикарбонил-аминокислоты (Вос-аминокислоты) проводят с помощью симметричного ангидрида Вос-аминокислоты: 4 ммоль Вос-аминокислоты растворяют в 5 мл хлороформа, охлаждают до 0°С, добавляют раствор 2 ммоль ДЦГК в 5 мл хлороформа. После перемешивания в течение 10 минут при 0°С смесь добавляют к пептидилполимеру, приливают 10 мл диметилформамида и перемешивают с пептидилполимером 30 минут при 28°С.

После присоединения очередной аминокислоты пептидилполимер промывают диметилформамидом, хлороформом, затем удаляют защитную Вос-группу.

Удаление динитрофенильной группы: 2 г пептидилполимера перемешивают в течение 1,5 часов при комнатной температуре в 40 мл 20% раствора тиофенола в диметилформамиде. Затем пептидилполимер промывают диметилфорамидом, хлороформом и сушат в вакууме.

Снятие пептида со смолы: 2 г пептидилполимера помещают в реакционный сосуд прибора для работы с фтористым водородом, добавляют 1 г n-крезола, охлаждают жидким азотом и после вакуумирования сосуда перегоняют в него 10 мл жидкого безводного фтористого водорода. Доводят температуру реакционного сосуда до -20°С и перемешивают полимер в течение 30 минут, поддерживая температуру смеси ССl₄-твердый СO₂, затем помещают реакционный сосуд в ледяную баню и выдерживают при перемешивании еще 30 минут. После этого втористый водород упаривают на водоструйном насосе, полимер промывают на фильтре диэтиловым эфиром. Затем пептид экстрагируют 20% уксусной кислотой и лиофилизируют.

Удаление трифторацетильной группы. Снятый со смолы пептид обрабатывают 60 мл одномолярного водного раствора пиперидина при 0°С в течение 2 часов. Затем реакционную смесь лиофилизируют и обессоливают гельфильтрацией на колонке Sephadex G-25 в 5% уксусной кислоте.

Пример 2. Специфичность действия предложенного вещества по сравнению с прототипом

Исследование влияния гексапептида (заявленного вещества) и циклоспорина А (вещества по прототипу) на специфичность действия в отношении транспортных белков, ответственных за МЛУ.

Клетки рака гортани человека Нер-2 в среде DMEM (Sigma) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma) и 40 мкг/мл гентамицина (Sigma) рассевали в 96-луночный планшет по 0.1 мл при концентрации 50000/мл, добавляли исследуемые агенты и инкубировали трое суток при 37°С в атмосфере с 5% CO₂. По окончании инкубации клетки окрашивали 0.02% фиолетовым кристаллическим (Sigma) в 20% этаноле 10 минут, затем раствор красителя удаляли, промывали ячейки водой и добавляли 0.1% раствор SDS для экстракции красителя из клеток. Оптическую плотность определяли при 570 нм на спектрофотометре Multiscan Plus. Эффект воздействия определяли по формуле: N_o/N_k=(D_o-D)/(D_k-D)100%, где D_o, D_k, D - оптические плотности в опыте, контроле и фоновая, соответственно, a N_o/N_k - выживаемость клеток: количество живых клеток в опыте относительно контроля.

Клетки Р388 выращивали в брюшной полости мышей DBA2. Резистентные к винкристину клетки Р388 получали путем их выращивания в мышах-самцах DBA2 при воздействии 1 мкг/г винкристина (Гедеон, Рихтер, Венгрия). Винкристин вводили внутрибрюшинно через сутки после прививки опухоли (10⁶ клеток на мышь). После нарастания клеток их перевивали и снова вводили 1 мкг/г винкристина. Процедуру повторяли шесть раз. Полученный штамм клеток обозначили Р388ВР (винкристин-резистентный).

Все измерения флуоресценции проводили на спектрофотометре Perkin-Elmer MF44 при постоянном перемешивании и температуре 37°С. Длины волн возбуждения и эмиссии для кальцеина 493 и 515 нм. Клетки Нер-2 (1-1.5 млн) помещали в кювету прикрепленными к прозрачной пластиковой пластинке, а клетки Р388 (500 тыс) были в суспензии. При определении образования кальцеина кальцеин AM добавляли в кювету, прописывали скорость образования кальцеина в контроле, затем вводили в кювету исследуемые агенты и продолжали регистрировать увеличение флуоресценции. Эффект воздействия оценивали коэффициентом увеличения скорости после добавления агента. При исследовании скорости выхода из клеток кальцеина клетки предварительно нагружали этим же флуорохромом в присутствии 1 мкг\мл циклоспорина А для подавления их откачки из клеток, затем отмывали и хранили до измерения на льду. При определении выхода кальцеина из клеток в суспензии (Р388ВР) в кювету перед клетками добавляли 2 мкМ Со²⁺ для тушения флуоресценции внеклеточного кальцеина, и таким образом регистрировался кальцеин только в клетках. Вначале определялась скорость выхода флуорохрома в контроле, затем в кювету добавляли исследуемый агент и продолжали запись уменьшения кальцеина в клетках. Эффект воздействия оценивали отношением скоростей выхода в контроле и после введения агента. Все эффекты пептида сравнивали с действием циклоспорина А.

Скорость образования в кювете кальцеина при добавлении в среду кальцеина AM без ионов Со, позволяет определять активность транспортных белков, откачивающих из клеток кальцеин AM, но не белков, способных транспортировать из клеток кальцеин (MRP), поскольку в этом случае регистрируется весь кальцеин: в клетках и вне клеток.

Циклоспорин А, как преимущественный ингибитор P-gp, эффективно увеличивает скорость образования кальцеина в кювете с клетками Р388ВР, в которых МЛУ обусловлено в основном сверхэкспрессией P-gp. Коэффициент увеличения скорости образования кальцеина в клетках Р388 ВР циклоспорином А достигает 7±0.4 при его концентрации 0.8 и более мкМ. Гексапептид не действует на скорость образования кальцеина в кювете с клетками Р388ВР вплоть до 1.2 мкМ. Однако в присутствии Со (тушение внеклеточного кальцеина) гексапептид уже при концентрации 12 нМ увеличивает скорость образования кальцеина в этих клетках в два раза (фиг.1). Результаты показывают, что гексапептид не действует на активность P-gp (откачка кальцеина AM в клетках Р388ВР), но ингибирует MRP, который транспортирует из клеток кальцеин. Действительно, при исследовании скорости выхода кальцеина из предварительно им нагруженных клеток Р388ВР оказалось, что гексапептид эффективно подавляет MRP: скорость выхода кальцеина снижается в 1.5 раза уже при концентрации пептида 1.2 нМ, а при концентрации 120 нМ коэффициент ингибирования скорости равен 2.6 (фиг.2).

Напротив, циклоспорин А проявляет крайне низкую эффективность в ингибировании MRP: коэффициент равен 1.3±0.1 при концентрации 0.8 мкМ.

Полученные данные демонстрируют, что гексапептид (заявленное вещество) не действует на активность P-gp (откачка кальцеина AM в клетках Р388ВР), но ингибирует MRP, который в небольшом количестве также присутствует в клетках Р388ВР и транспортирует из клетки кальцеин. Аналогичные выводы следуют из результатов, полученных на другой модели - клетках Нер-2. Белки MRP в клетках Нер-2, в отличии от клеток Р388ВР, несут доминирующий вклад в появление МЛУ. Поэтому гексапептид в клетках Нер-2 ингибирует МЛУ гораздо более эффективно, чем в клетках Р388ВР. Так гексапептид уже в концентрации 1.2 нМ в два раза увеличивает скорость образования кальцеина в клетках (в присутствии ионов Со), а при возрастании концентрации пептида до 120 нМ коэффициент увеличения скорости образования кальцеина достигает 3.7 (фиг.2). Таким образом, гексапептид (заявленное вещество), в отличии от циклоспорина А, обладает выраженным специфическим действием в отношении ингибирования транспортных белков множественной лекарственной резистентности (MRP).

Пример 3

Исследование влияния гексапептида и вещества по прототипу (Циклоспорина А) на преодоление множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток Нер-2.

Активность в клетках транспортных белков, обеспечивающих множественную лекарственную устойчивость, определяли по скорости выхода из клеток родамина 123 (R123) ("ICN", США). Известно, что отношение скоростей выхода R 123 из клеток в норме и при полном подавлении активного транспорта минус единицу: (R-1)_max равно отношению активного и пассивного транспорта и, следовательно, характеризует активность в клетках белков, обеспечивающих множественную лекарственную устойчивость. Клетки Нер-2 высевали в количестве 1-1.5 млн в среде DMEM+10% эмбриональной телячьей сыворотки с гентамицином на пластинки (50×9×2 мм), помещенные в чашки диаметром 6 см, объем среды 8 мл. Инкубировали в СО₂ инкубаторе. Через сутки инкубации в CO₂ инкубаторе при 37°С клетки отмывали в среде RPMI1640 и нагружали их R123, 0.5 мкг/мл в присутствии ингибитора транспортных белков циклоспорина А, 3 мкг/мл в среде RPMI1640, содержащей 5% эмбриональной сыворотки, в течение 60 мин при 37°С. После инкубации клетки трижды (по 10 мин) отмывали от красителя холодным (2°С) физиологическим раствором с 1% эмбриональной сывороткой. После отмывания и до момента измерения пластинки с клетками хранили в растворе Хэнкса с 0.5% сыворотки на льду. Отмытую пластинку с клетками ставили в кювету спектрофотометра MF44 Perkin-Elmer с раствором Хэнкса и 0.5% эмбриональной сывороткой, объем 3 мл, 37°С и определяли увеличение количества R123 в среде при постоянном перемешивании. Длины волн возбуждения и эмиссии 488 и 520 нм соответственно. В конце эксперимента для определения максимального количества R123 в клетках клетки разрушали добавлением в кювету 0,02% дигитонина ("Sigma", США).

При исследовании действия ингибиторов на выход R123 в кювету через несколько минут нормального выхода красителя добавляли ингибитор в необходимой концентрации. Определение контрольной и ингибированной констант скоростей выхода родамина на одной пластинке уменьшает ошибку определения их отношения, необходимого для получения значения R. На фиг.3 приведена кинетика увеличения R 123 в среде в контроле (1), после добавления циклоспорина А (2) и дигитонина (3). Общее количество родамина в клетках определяли по разнице уровней флуоресценции после добавления дигитонина и перед добавлением в кювету клеток. Относительное количество R123 в клетках (W) определяли по формуле: N=1-{I_t-I₀/I_max-I₀}, где I_t, I₀, I_max - флуоресценция R123 в среде в моменты времени t, 0 и максимальная, после добавления дигитонина, соответственно. Как видно на фиг.4, количество R123 в клетках в контроле и после добавления ингибитора уменьшается по экспоненте, поскольку в полулогарифмическом масштабе эти кинетики описываются прямыми линиями. В данном примере Циклоспорин А, 1 мкг/мл в 3.8 раза в данном опыте снижал константу скорости выхода родамина 123: R=2.8.

Описанным выше методом определяли влияние заявленного гексапептида и для сравнения известного ингибитора МЛУ - циклоспорина А на выход R123 из клетки Нер-2. Влияние каждой концентрации агентов на выход R123 определяли в нескольких опытах. На фиг.5 приведены средние значения R с квадратичными отклонениями, для концентраций, где было больше 3 повторностей.

Как видно из фиг.5, гексапептид (ГП) максимально ингибирует выход R123 при оптимуме концентрации 1нг/мл. Величина R для гексапептида равняется 3.2. Аналогичное значение R для циклоспорина А достигается при концентрации, более чем в три тысячи раз большей, чем для заявленного гексапептида.

Таким образом, заявленное вещество - гексапептид обеспечивает преодоление множественной лекарственной устойчивости более чем в три тысячи раз эффективнее по сравнению с веществом по прототипу - циклоспорином А.

Пример 4

Онкологическая безопасность и безвредность заявляемого гексапептида.

Клетки рака гортани человека Нер-2 в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 40 мкг/мл гентамицина рассевали в пенициллиновые флаконы по 200 тыс на флакон в объеме 2 мл. Гексапептид в дозе 1 мкг/мл добавляли через 3 час после посева клеток (когда они уже прикреплялись к стеклу) и оставляли в среде на весь оставшийся период инкубации. Через 3 суток после посева клетки открепляли от стекла трипсином и подсчитывали количество живых клеток, не окрашенных 0.04% раствором трипанового синего.

Таким образом, гексапептид не вызывает стимуляцию роста опухолевых клеток. Напротив, гексапептид повышает чувствительность клеток опухоли к цитостатическому препарату арсенату и тормозит выживаемость клеток Нер-2 (фиг.6). На фиг.7 приведены данные по действию гексапептида на рост клеток Нер-2.

Видно, что гексапептид в концентрации 1 мкг/мл практически не влияет на рост опухолевых клеток Нер-2 (фиг.7).

Таким образом, полученные данные демонстрируют, что гексапептид (заявленное вещество) является безопасным в отношении стимуляции опухолевого роста.

Пример 5

Больная Р., 37 лет. Клинический диагноз: рак шейки матки III стадии (Т3NX-1М0). Обследование больной включало клиническую и лабораторную оценку при поступлении и в период лечения. Общее состояние больной средней тяжести. На фоне практически нормальных значений показателей окислительно-антиокислительной системы у больной отмечена резкая иммуносупрессия по показателю процентного содержания основных субпопуляций Т-лимфоцитов. Процентное содержание CD3, CD4, CD8, СD16-позитивных клеток снижено относительно среднестатистических нормальных значений в два раза. Больная до начала противоопухолевого лечения получила курс из 5-кратного введения гексапептида по 1 мл 0.005% раствора подкожно ежедневно в течение 5 дней. Химиолучевое лечение проводили по схеме: 500 мг 5-фторурацила (суммарная доза 2500 мг). В течение всего курса химиолучевой терапии больная получала по 1 мл 0.005% раствора гексапептида (биопоэтина) 5 раз ежедневно. Через 2 дня после окончания 5-фторурацила больной проводили дистанционное облучение в разовой дозе 4 Гр на фоне внутривенного введения 30 мг циспластина в течение 3 дней (суммарная доза циспластина 90 мг). Далее продолжали лучевое лечение в режиме ежедневного мультифракционирования дозы. Облучение проводили до очаговой дозы 20 Гр на область первичного очага и зон регионарного метастазирования. Затем присоединяли внутриполостную гамма-терапию (10 фракций по 5 Гр), а дистанционное облучение продолжали на зоны параметрального метастазирования до суммарной дозы 44 Гр. Выраженных побочных и постлучевых реакций у больной не отмечено, что позволило обеспечить непрерывность курсов химиолучевой терапии. Явлений развития МЛУ не отмечено. В тоже время среднестатистические показатели химиолучевой терапии больных раком шейки матки III стадии демонстрируют появление специфических реакций, требующих длительного перерыва в терапии у 33-34%, развитие эпителиита в 78-87%, у 55-58% островчатый эпителиит и у 15-20% пленчатый эпителиит, требующий 4-5 месячного лечения. Существенным является и тот факт, что показатели иммунитета и общая формула крови после химиолучевой терапии у больной практически не изменились, в то время как в контрольной группе, не получавшей раствор гексапептида, после химиотерапии отмечается их дальнейшее снижение. В результате проведенного лечения у больной достигнута полная резорбция опухоли.

Таким образом, заявленное средство сокращает явления токсикоза, развитие побочных эффектов и лучевых реакций химиолучевой терапии.

Пример 6

Больной Н., 52 года.

Клинический диагноз: рак пищевода III стадии (T3-4N0-2MOP3). При поступлении общее состояние больного средней тяжести. Лабораторные показатели общей формулы крови без выраженных изменений. Отмечен значительный дисбаланс показателей окислительно-антиокислительной системы на фоне умеренной иммуносупрессии.

Состояние окислительно-антиокислительной системы у больных оценивали по интенсивности перекисного окисления липидов путем измерения в сыворотке крови концентрации малонового диальдегида (МДА, мкмоль/л) и эндогенных антиоксидантов: лактоферрина (ЛФ, мг/л), церулоплазмина (ЦП, усл. ед.) и антиокислительного фермента каталазы (Кат, усл. ед). Анализ процентного содержания основных субпопуляций Т-лимфоцитов проводили к поверхностным рецепторам CD3 (Т-лимфоциты), CD4 (Т-хелперы/индукторы), CD8 Т (супрессоры/цитотоксические лимфоциты), CD16 естественные киллеры), CD25 (активированные лимфоциты, экспрессирующие рецептор к интерлейкину-2), CD72 (В-лимфоциты). При поступлении больного в отделение химиотерапии отмечен значительный дисбаланс окислительно-антиокислительной системы: МДА - 3,5 (норма 3,0±0,1), КАТ - 450 (норма 576±48), ЦП - 0,59 (норма 0,53±0,04), ЛФ - 3,8 (норма 1,0±04). В тоже время показатели лимфоцитарного звена находились практически в пределах нормальных значений. Поскольку ЦП и ЛФ являются белками острой фазы воспаления, повышение их уровня в сыворотке крови отражает наличие воспалительного процесса, сопутствующего развитию рака пищевода. Перед проведением химиолучевого лечения больному назначали 5-кратное введение гексапептида внутримышечно ежедневно по 1 мл 0,1% раствора 5 раз в день в течение 5 дней. Комплексную химиолучевую терапию проводили по следующей схеме: 750 мг 5-фторурацила (5-ФУ) вводили внутривенно в течение 5 дней (суммарная доза 3750 мг); через 2 дня после окончания введения 5-ФУ больного облучали по схеме динамического фракционирования дозы в разовой дозе 4 Гр на фоне внутривенного введения циспластина в дозе 30 мг в течение 3 дней (суммарная доза циспластина 90 мг, СОД 12 Гр). В течение всего указанного периода химиолучевой терапии больной получал гексапептид в разовой дозе 100 мкг дважды в день (утром и вечером). С 11 дня продолжали лучевую терапию в режиме классического фракционирования дозы с разовой очаговой дозой 2 Гр (СОД 40 Гр). Выраженных побочных и постлучевых реакций у больного не отмечено, что позволило обеспечить непрерывность курсов химиолучевой терапии. В течение всего курса химиолучевой терапии показатели активности естественного клеточного и Т-лимфоцитарного звена иммунитета, продукция белков острой фазы воспаления существенно не менялись. Отмечено улучшение показателей окислительно-антиокислительной системы организма и снижение концентрации малонового диальдегида до 3,2 мкмоль/л. Симптомов МЛУ не отмечено. В результате проведенного лечения у больной раком пищевода III стадии достигнуто значительное улучшение общего состояния, сокращение явлений токсикоза, устранение побочных эффектов и лучевых реакций химиолучевой терапии полная резорбция опухоли.

Таким образом, заявленное средство сокращает явления токсикоза, развитие побочных эффектов и лучевых реакций химиолучевой терапии. В результате проведенного лечения у больного достигнута полная резорбция опухоли.

Наблюдение в течение 12 месяцев за больным, прошедшим курс лечения с применением заявленного средства, не выявили рецидива заболевания.

Пример 7

Больная П., 54 года.

Заболевание проявилось болями за грудиной, слабостью, похуданием. При обследовании на основании эндоскопии, рентгеноконтрастного исследования выявлен рак средне- и нижнегрудинных отделов пищевода, протяженностью около 10 см с метастатическим поражением региональных лимфатических узлов. Гистологическое исследование биоптата опухоли - плоскоклеточный рак. Перед проведением химиолучевого лечения больной назначали 5-кратное введение гексапептида в виде ректальных суппозиторий ежедневно по 5 мг 5 раз в день в течение 5 дней.

На первом этапе комбинированного лечения проведено два курса полихимиотерапии.

В течение всего периода химиолучевой терапии больная получала лечение заявленным средством в виде ректальных суппозиторий по 50 мкг дважды в день (утром и вечером).

В период проведения полихимиотерапии сильно выраженных явлений токсикоза не наблюдалось: отмечена умеренная нейтропения, снижение показателей Т-клеточного иммунитета, эпизодически диарея, тошнота, головокружение.

При контрольных исследованиях опухоль пищевода не определялась, значительно уменьшились размеры региональных лимфоузлов. Исследования гистологического и биоптического материала наличие опухолевых клеток не подтвердили. Гистологическое исследование биологического материала субтотальной резекции пищевода позволило выявить полный лечебный патоморфоз опухоли. В лимфатических узлах метастазов не выявлено.

Пример 8

Больная П., 1938 г.р., поступила с диагнозом: РМЖ T4cN2Mo с изъязвлением кожи молочной железы.

Из анамнеза: больная около 2-х лет, когда впервые заметила опухолевое образование в левой молочной железе, которое постепенно увеличивалось.

При поступлении: жалобы на наличие опухоли в левой груди с кровоточащим изъязвлением, общую слабость, головную боль, тошноту, боли в левой молочной железе.

Результаты обследования:

В левой молочной железе визуально на границе верхних квадрантов бугристое опухолевое образование в виде карбункула с изъязвлением в центре, с кровянистыми выделениями и неприятным запахом. На маммограммах: в левой молочной железе опухолевый узел более 10 см в диаметре с инфильтрацией кожи и деструкцией в центре (язвой). Маммосцинтиграфия: очаги гиперфиксации 99 Тс диаметром около 10 см в левой молочной железе и около 6 см в левой подмышечной области. По результатам ультразвукового исследования определяется округлое шаровидное образование с гипоэхогенными контурами диаметром 92 мм на границе верхних квадрантов левой молочной железы. Гистологически: опухолевые клетки низкодифференцированной аденокарциномы.

Заключение: рак молочной железы с распадом опухоли, метастаз в подмышечные лимфатические узлы слева.

На область левой молочной железы с двух тангенциальных встречных полей и фигурным полем на зоны регионарного лимфооттока слева начата лучевая терапия на линейном ускорителе (ЛУ-20-SL с энергией тормозного излучения 6 МЭВ) в режиме среднего фракционирования дозы; по 3 Гр в день 5 раз в неделю на область опухоли до суммарной дозы (СОД) 45 Гр, эквивалентной режиму обычного фракционирования по 2 Гр в день - СОД 60 Гр, и на зоны регионарного лимфооттока слева (надподключично-подмышечную и парастернальную зоны) по 3 Гр до СОД 33-36 Гр, эквивалентной 44-48 Гр обычного фракционирования.

Состояние больной после курса облучения удовлетворительное, опухолевое изъязвление в стадии рубцевания, выделений практически нет. Спустя 2 недели начата полихимиотерапия по схеме CMF, которая проводилась в течение 4-х недель 1 раз в неделю. В течение 5 дней до начала химиотерапии больная ежедневно получала гексапептид в виде интраназального дозированного спрея 5 раз в день по 100 мкг. Схема CMF включала в себя внутривенное капельное введение 1 г 5-фторурацила и 40 мг метотрексата и внутримышечное - 1 г циклофосфана. В период полихимиотерапии больная ежедневно получала гексапептид в виде инраназального дозированного спрея 5 раз в день по 100 мкг. Химиолучевое лечение больная переносила удовлетворительно: лейкоциты - 4,5×10⁹, тромбоциты - 200×10³/л. Больная выписана из клиники в удовлетворительном состоянии.

Повторный курс CMF. Больной было ведено внутривенно 40 мг метотрексата и 1 г 5-фторурацила и внутримышечно 1 г циклофосфана. Состояние после полихимиотерапии удовлетворительное. На месте изъязвления молочной железы сформировался рубец. Регионарные лимфатические узлы не определялись, молочная железа мягкая, свежих инфильтратов нет. На маммограммах опухолевый узел по сравнению с данными маммографии уменьшился в диаметре до 5 см. В дальнейшем начат курс полихимиотерапии по той же схеме и в тех же дозах. В течение 5 дней до начала химиотерапии больная ежедневно получала гексапептид в виде интраназального дозированного спрея 5 раз в день по 100 мкг. В период полихимиотерапии больная ежедневно получала гексапептид в виде интраназального дозированного спрея 5 раз в день по 100 мкг.

Больная была выписана из клиники под наблюдение онколога, а затем вновь госпитализирована для проведения 4-го курса полихимиотерапии. Состояние ее удовлетворительное, на месте язвы гладкий рубец, инфильтративных явлений нет, подмышечные и подключичные лимфатические узлы не определялись, правая молочная железа не изменена. На маммограммах опухолевый узел в виде фиброзной ткани уменьшился по сравнению с последними данными маммографии до 3.8 см. Клинический анализ крови в норме.

Начат 2-недельный курс химиотерапии по схеме CMF. В течение 5 дней до начала химиотерапии больная ежедневно получала гексапептид в виде интраназального дозированного спрея 5 раз в день по 100 мкг. В период полихимиотерапии больная ежедневно получала гексапептид в виде интраназального дозированного спрея 5 раз в день по 100 мкг. Полихимиотерапию больная переносила удовлетворительно: лейкоциты - 4,0×10⁹, тромбоциты - 200×10³/л.

При клинико-рентгенологическом обследовании (осмотр, маммография, УЗИ молочных желез и органов брюшной полости, рентгенография и томография легких и средостения, остеосцинтиграфия, клиническое и биохимическое исследование крови и мочи) данных за наличие рецидива опухоли в молочной железе и метастазов не получено.

Проведен 5 курс 2-недельный курс полихимиотерапии по схеме CMF, который больная перенесла хорошо. Развитие МЛУ не отмечено. В течение 5 дней до начала химиотерапии больная ежедневно получала гексапептид в виде интраназального дозированного спрея 5 раз в день по 50 мкг. В период полихимиотерапии больная ежедневно получала гексапептид в виде интраназального дозированного спрея 5 раз в день по 50 мкг

Состояние больной удовлетворительное. При клинико-рентгенологическом обследовании данных за продолженный рост опухоли не получено. Проведен снова 2-недельный курс полихимиотерапии по CMF, который больная по-прежнему перенесла удовлетворительно. Выписана под наблюдение районного онколога. На контрольном осмотре (через 15 месяцев от начала лечения) - без признаков рецидива заболевания.

Изобретение относится к области медицины, в частности к области химиотерапии. Предложено средство для преодоления множественной лекарственной устойчивости, которое представляет собой гексапептид структурной формулы: лизил-гистидил-глицил-лизил-гистидил-глицин. На основе данного вещества возможно создание лекарственных средств, обладающих повышенной эффективностью преодоления множественной лекарственной устойчивости, увеличенной специфичностью действия в отношении транспортных белков множественной лекарственной резистентности (MRP), повышенной безвредностью и не вызывающих токсических реакций. Эти лекарственные средства могут применяться для профилактики и терапии больных с явлениями множественной лекарственной устойчивости. 3 з.п. ф-лы, 7 ил.

1. Средство для преодоления множественной лекарственной устойчивости, содержащее пептид и целевую добавку, отличающееся тем, что в качестве пептида оно содержит гексапептид структурной формулы: лизил-гистидил-глицил-лизил-гистидил-глицин.

2. Средство по п.1, отличающееся тем, что оно выполнено в форме раствора для подкожных и внутримышечных инъекций, а в качестве целевой добавки содержит аминоуксусную кислоту,

3. Средство по п.1, отличающееся тем, что оно выполнено в форме спрея для дозированного применения, а в качестве целевой добавки содержит аминоуксусную кислоту и бензалкония хлорид.

4. Средство по п.1, отличающееся тем, что оно выполнено в форме суппозитория, а в качестве целевой добавки содержит аминоуксусную кислоту, твин 80 (Полисорбат 80), воду для инъекций и твердый жир.