СРЕДСТВО, УСИЛИВАЮЩЕЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВУЮ АКТИВНОСТЬ ХИМИОПРЕПАРАТОВ, И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2005 года по МПК A61K35/70 A61P35/00 

Область техники

Изобретение относится к фармакологии, а именно к биологически активным веществам, получаемым путем микробиологического синтеза, которые могут применяться в медицине и ветеринарии в качестве средства, усиливающего противоопухолевую активность химиопрепаратов для лечения онкологических заболеваний.

Предшествующий уровень техники

Для химиотерапии различных раковых заболеваний используют большое количество лекарственных препаратов природного или искусственного происхождения, относящихся к разным классам химических соединений и отличающиеся механизмом их действия на опухолевые клетки. Примерами таких цитостатических препаратов являются циклофосфамид, доксорубицин, винбластин, этопозид, фторурацил и многие другие. Однако в ряде случаев клетки злокачественных новообразований обнаруживают высокую резистентность ко многим химиопрепаратам, которые в других случаях вполне эффективны в практической онкологии (Ставровская А.А. Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. “Биохимия”, 2000, том 65, вып.1, с.112-126).

Известны модуляторы - вещества, усиливающие эффективность известных противоопухолевых средств и способствующие преодолению множественной лекарственной устойчивости опухолей. К таким веществам относятся верапамил, циклоспорин А, нифедипин и его производные, амиодарон, трифторкеразин, хинин и другие (Ford J.M., Halt W.N. Pharmacology of drugs that alter multidrug resistance in cancer. Pharmacol. Res. 1990, 42, 155-199).

Недостатком указанных соединений является наличие серьезных побочных эффектов в дозах, в которых усиливают положительное действие противоопухолевых препаратов. В частности, верапамил вызывает сердечную недостаточность и мозговые нарушения, а циклоспорин А обладает иммунодепрессантной активностью.

В работе Дидье и Лура (Didier A.D. and Loor F. The abamectin derivative ivermectin is a potent P-glycoprotein inhibitor. Anti-Cancer Drugs, 1996, 7, 745-751) проведено сравнительное изучение действия циклоспорина и ивермектина - полусинтетического производного авермектинов. Было показано, что ивермектин лучший ингибитор Р-гликопротеина, чем циклоспорин. Однако дальнейшего развития эти исследования не получили.

Сущность изобретения

Целью изобретения является поиск малотоксичных модуляторов Р-гликопротеина и других транспортных белков, усиливающих противоопухолевую активность известных химиопрепаратов для лечения опухолей, главным образом, резистентных.

Предлагаемое изобретение основано на ранее неизвестных свойствах индивидуальных авермектинов, преимущественно природного происхождения, и их смесей.

В частности установлено, что авермектины усиливают противоопухолевую активность химиопрепаратов.

При лечении онкологических заболеваний, включающем прием химиопрепаратов, дополнительно принимают средства, усиливающие противоопухолевую активность химиопрепаратов. В качестве химиопрепаратов используют винкристин, таксол, этопозид, фарморубицин, доксорубицин, а в качестве средства, усиливающего противоопухолевую активность химиопрепаратов, используют авермектины. Сравнительные опыты, в которых, при прочих равных условиях, меняли только последовательность приема препаратов, показали, что наибольший эффект достигается, если авермектины принимать после приема химиопрепаратов.

Авермектины препятствуют откачке лекарственных средств (химиопрепаратов) из опухолевых клеток, химиопрепараты поступают в клетку в больших количествах, что значительно повышает эффективность лечения.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Пример 1. Клетки карциномы молочной железы MCF-7 были высажены в 96-луночные плейты, 40000 кл/лунку. Среда культивирования - DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 10 мкг/мл антибиотика гентамицина. После прикрепления клеток к подложке в среду культивирования были добавлены винкристин (50 пг/мл) и на его фоне один из авермектинов A₁, A₂, B₁, B₂ в концентрации (10 нг/мл). Затем клетки инкубировали при 37°С в стандартных условиях в течение 72 часов. Для оценки синергизма действия соединений на выживаемость и пролиферацию клеток использовали МТТ тест и визуальную микроскопию. Через 72 часа в лунки добавляли 20 мкл раствора МТТ красителя 3-(4,5-диметилтиазолил 2)-2,5-дифенилтетразолий бромистый (Sigma) и плейты культивировали в СO₂-инкубаторе в течение 2 часов до образования игольчатых гранул формазана. Затем среду с красителем удаляли и в каждую лунку добавляли 50 мкл DMSO. Плейт интенсивно встряхивали и определяли оптическую плотность образцов на длине волны 550 нм сканированием на специальном приборе (Reader ANTOS 2020, BioRad).

Для правильного выбора концентраций предварительно были сняты кривые доза-зависимость действия винкристина и авермектинов на выживаемость клеток MCF-7. Винкристин в концентрации 50 пг/мл и каждый из авермектинов в концентрации 1 нг/мл не влияют на оптическую плотность (и соответственно процент выживших клеток). При совместном действии винкристина и авермектинов A₁ и B₁ оптическая плотность резко падает. Причем наиболее эффективными является авермектин A₁ (оптическая плотность падает более чем в 4 раза (Р<0,05)). Авермектин B₁ в присутствии винкристина уменьшает оптическую плотность в 1,5-2 раза.

Пример 2. Тем же способом, что и в примере 2, оценивали синергизм цитотоксического действия винкристина и авермектинов на клетках карциномы легкого человека А549 и меланомы мыши В-16. Клетки были высажены в 96-луночные плейты (40000 кл/лунку). Среда культивирования - DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 10 мкг/мл антибиотика гентамицина. После прикрепления клеток к подложке в среду культивирования были добавлены винкристин (50 пг/мл) и на его фоне один из авермектинов A₁, А₂, B₁, B₂ в концентрациях от 0,01 до 10 нг/мл. Затем клетки инкубировали в стандартных условиях в течение 72 часов. Для оценки синергизма действия соединений на выживаемость и пролиферацию клеток использовали МТТ тест и визуальную микроскопию. Через 72 часа в лунки добавляли 20 мкл раствора МТТ красителя 3-(4,5-диметилтиазолил 2)-2,5-дифенилтетразолий бромистый (Sigma) и культивировали при 37°С в СО₂-инкубаторе в течение 2 часов до образования игольчатых гранул формазана. Затем среду с красителем удаляли и в каждую лунку добавляли 50 мкл DMSO. Плейт интенсивно встряхивали и определяли оптическую плотность образцов на длине волны 550 нм сканированием на специальном приборе (Reader ANTOS 2020, BioRad).

Предварительно были сняты кривые доза-зависимость действия винкристина и авермектинов A₁, А₂, B₁, В₂ на эти клетки. При действии каждого отдельно взятого соединения (50 пг/мл винкристина и 0,01-10 нг/мл любого из авермектинов) оптическая плотность и соответственно процент выживших клеток практически не меняется. В то же время на клетках карциномы А549 при совместном действии винкристина и авермектинов оптическая плотность уменьшается для A₁ на 50±8%, А₂ - 40±7%, B₂ - 35-40%, B₁ - не эффективен.

На клетках меланомы мыши В16 действует только авермектин A₁. Оптическая плотность в присутствии A₁ уменьшается на 40±4,5%. Другие авермектины на клетках меланомы мыши В16 не эффективны.

Примеры 2-3 показывают, что эффективность авермектинов зависит от типа клеток. Разные авермектины обладают специфической активностью к разным типам раковых клеток.

Пример 3. Резистентный к винкристину штамм лимфолейкоза Р388 получали методом многократного введения винкристина, 1 мкг/г мышам DBA₂ с привитым лимфолейкозом. Мышам прививали внутрибрюшинно по 1 млн клеток Р388 и через сутки также внутрибрюшинно вводили винкристин. После нарастания опухолевых клеток (через 7-10 суток) клетки перевивали на других мышей и через сутки опять вводили винкристин. Процедуру повторяли до 6 раз. Для работы in vitro клетки выделяли, отмывали и помещали в среду RPM1-1640 с сывороткой и антибиотиками. Агенты добавляли перед инкубацией, а через 22 часа инкубации при 37°С определяли количество живых клеток с помощью окраски трипановым синим. Выживаемость рассчитывали как отношение количества живых клеток в опыте (N₀) к контролю (N_k): В% = (N₀/N_k)·100%. IC₅₀ для клеток Р388 составляло 14 нг/мл, а для резистентных к винкристину клеток (Р388ВР) - 724 нг/мл. Авермектин B₁ (10 нг/мл) увеличивал чувствительность к винкристину клеток Р388ВР в 35 раз. Винкристин в дозе 100 нг/мл не влиял на выживаемость клеток Р388ВР, но в сочетании с авермектинами винкристин становился токсичным для клеток, причем авермектины существенно различались по эффективности. Дозы авермектинов, снижающие выживаемость клеток Р388ВР до 50% (IС₅₀), составляли для A₁, А₂, B₂, B₁ соответственно 0,01; 1; 4 и 6 нг/мл. Сами по себе авермектины в этих концентрациях не токсичны для клеток. Таким образом, резистентность клеток Р388ВР к винкристину снимается авермектинами. Наиболее активен при этом A₁ и наименее - B₁.

Пример 4. Для получения резистентного к таксолу штамма клетки Нер-2 высевали в культуральные флаконы (V=6 мл) по 100 тыс./мл в среде ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 80 мкг/мл гентамицина. Через сутки инкубации при 37°С добавляли таксол в конечной концентрации 10 нМ. Через 2-3 суток удаляли погибшие клетки сменой среды. Выжившие клетки давали колонии, после их разрастания клетки открепляли, пересевали и наращивали для опытов. Для определения цитотоксичности агентов клетки (50 тыс./мл) в среде ДМЕМ с добавлением сыворотки (10%) и гентамицина (80 мкг/мл) рассевали в 96-луночный планшет по 0,1 мл. Через сутки инкубации в СO₂-инкубаторе при 37°С добавляли исследуемые агенты и продолжали инкубацию еще двое суток. По окончании инкубации клетки окрашивали 0,02% фиолетовым кристаллическим в 20% этаноле, краску экстрагировали 1% SDS, оптическую плотность определяли при 570 нм на спектрофотометре Multiscan Plus. Выживаемость клеток (N/N₀%) определяли по формуле:

N₀/N_k=[{(D₀-D_фон)-(D_k-D_фон)}/(D_k-D_фон)]×100%,

где D₀, D_k, D_фoн - оптические плотности в опыте, в контроле и фоновая соответственно. IC₅₀ таксола для таксол-резистентного штамма Нер-2ТР возрастало до 1660 пМ, что в 55 раз больше IС₅₀ для исходных клеток Нер-2. Авермектин B₁ добавляли одновременно с таксолом. Сам B₁ не влиял на выживаемость клеток. IС₅₀ таксола в присутствии 0,01 нг/мл B₁ составляло 1,4 пМ для штамма Нер-2ТР. Сопоставив это значение с IC₅₀ таксола без B₁ (1660 пМ), получим коэффициент модификации чувствительности к таксолу авермекти-ном B₁, равный 1186.

Пример 5. Влияние авермектинов на множественную лекарственную устойчивость (МЛУ) опухолей определяли методом увеличения в клетках Р388ВР флуоресценции кальцеина, который откачивался из клеток транспортными белками, ответственными за МЛУ. Клетки (2 млн/2 мл) инкубировали с эфиром кальцеина (1 мкМ) 10 минут при 37°С в среде RPMI-1640 с 10% сыворотки, затем клетки осаждали центрифугированием (12000 g, 3 мин). Осадок ресуспендировали в солевом растворе рН 7,4 с содержанием Са²⁺ 40 мкМ. Флуоресценцию кальцеина измеряли на флуориметре (длина волны возбуждения 493 нм, длина волны эмиссии 515 нм). Авермектины добавляли за 20 минут до эфира кальцеина. Авермектины увеличивают накопление в клетках кальцеина, что указывает на ингибирование ими МЛУ. Концентрации, увеличивающие флуоресценцию в два раза, варьируют для разных авермектинов от 0,01 до 10 нг/мл.

Пример 6. Карциному Эрлиха прививали внутримышечно (в бедро) 2 млн клеток на мышь белым мышам-самцам СН₃. Через пять суток после прививки внутрибрюшинно вводили винкристин, аверсектин С (смесь авермектинов, см. RU 2182174) или оба вместе. Контрольным мышам вводили 0,2 мл 4% этанола (контроль на растворитель аверсектина С). В опытах использовано 60 животных: по 10 мышей на вариант. Эффект воздействий определяли по торможению роста опухолей (ТРО). Аверсектин С (0,2-0,5 мг/кг) существенно увеличивал ТРО винкристина в диапазоне его доз от 30 до 300 нг/г. При дозе винкристина 300 нг/г ТРО составляло 30-40%, а добавление аверсектина С увеличивало ТРО до 70-80%.

Пример 7. Клетки карциномы Льюиса (LLC) в количестве 30-40 мг/мышь взвесью в 0,3 мл питательной среды (или 250-300 тыс./мышь культивируемых клеток LLC в суспензии) прививали подкожно самцам породы С57В1 (штамм LLC поддерживали на той же породе мышей). Анализировали эффекты совместного действия винкристина (200 нг/г) и авермектина B₁ (0,1 мг/кг). Контролем служили две группы животных: первой контрольной группе вводились только LLC (группа К₀), второй - LLC и винкристин (группа К_v). Винкристин (200 нг/г) и авермектин (0,1 мг/кг) вводили внутрибрюшинно одноразово. Оценивали увеличение продолжительности жизни и торможение роста опухолей. Статистически достоверно (Р<0,05) показан положительный эффект авермектина B₁ как на продолжительность жизни экспериментальных животных, так и на торможение роста опухолей. В 2 сериях экспериментов в группах животных, которым вводили винкристин и авермектин В₁, опухоли просто не развивались или исчезали едва развившись, в то время как в контрольной группе К₀ через 35-45 дней у 100%, а в группе К_v у 80±20% животных опухоли достигали критических размеров (22±3,6 мм - 24±2,8 мм). Длительное наблюдение (60 дней) показало, что выжившие животные экспериментальной группы ничем не отличаются от животных, которым не вводились клетки LLC.

В других сериях экспериментов выживали 60±10% животных (у них опухоль не возникала вообще или, появившись, в течение 10-14 дней исчезала). В группах К₀ и К_v в этих экспериментах наблюдалась практически та же картина, что и в первой серии экспериментов.

У экспериментальных животных с опухолью статистически достоверно наблюдалось торможение роста опухоли к 20 дню наблюдения на 65±17% от контрольных К_v. В дальнейшем торможение развития опухоли уменьшалось и к 30 дню составляло 32±9%. Следует отметить, что при увеличении числа прививаемых клеток LLC до 700 тыс./мышь результаты резко ухудшаются: выживаемость животных падает до 20±10%, а торможение роста опухолей - до 40±13%.

Сводные данные о действии авермектинов на активность противоопухолевых препаратов в условиях in vitro и in vivo приведены в таблицах 1 и 2 соответственно.

Изобретение относится к фармакологии, а именно касается использования биологически активных веществ, получаемых путем микробиологического синтеза, в медицине и ветеринарии в качестве средства, усиливающего противоопухолевую активность химиопрепаратов. В качестве такого средства в заявленном изобретении используют индивидуальные авермектины или их комплексы в условиях in vitro в концентрациях 0,01-10 нг/мл и в условиях in vivo в дозах от 0,01 мг/кг до 1 мг/кг. Изобретение позволяет уменьшить токсическое действие химиопрепаратов при повышении их противоопухолевой активности за счет блокирования малыми дозами авермектинов выхода химиопрепаратов из опухолевых клеток. 2 с. и 2 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Применение авермектинов в качестве средства, усиливающего противоопухолевую активность химиопрепаратов, в условиях in vitro в концентрациях 0,01-10 нг/мл и в условиях in vivo в дозах от 0,01 до 1 мг/кг.2. Способ лечения онкологических заболеваний, включающий введение химиопрепаратов и средств, усиливающих противоопухолевую активность химиопрепаратов, отличающийся тем, что в качестве средств, усиливающих противоопухолевую активность химиопрепаратов, используют индивидуальные авермектины или их комплексы в дозах от 0,01 до 1 мг/кг.3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве химиопрепаратов используют винкристин, или доксорубицин, или фарморубицин, или таксол, или этопозид.4. Способ по п.2, отличающийся тем, что авермектины принимают после приема химиопрепаратов.