СПОСОБ ИОНООБМЕННОГО РАЗДЕЛЕНИЯ МЕТИОНИНА И ГЛИЦИНА Российский патент 2011 года по МПК C07C227/40 C07C319/28 G01N30/02 G01N30/96 

Изобретение относится к способам разделения и выделения индивидуальных алифатических аминокислот из их смесей и может быть использовано в биохимической, фармацевтической и пищевой промышленности.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ классической ионообменной хроматографии [А.с. СССР N 979991, G01N 31/08, 1981], в основе которого лежит сорбция молекул вещества неподвижной фазой, обусловленная их электростатическим связыванием с поверхностью пористых гранул твердого гидрофильного сорбента, находящегося в контакте с раствором.

Недостатками являются использование для регенерации сорбента большого количества вспомогательных реактивов, наличие стадии предварительной подготовки растворов аминокислот перед пропусканием их через ионообменник и протекание в системе ионообменник - сорбент различных необменных взаимодействий, что осложняет процесс выделения аминокислот и приводит к большим объемам промывных вод и низкой эффективности разделения.

Техническая задача изобретения заключается в разработке способа ионообменного разделения метионина и глицина, позволяющего увеличить эффективность разделения смеси аминокислот, исключить из технологического процесса большое количество вспомогательных реактивов, уменьшить объемы и степень загрязнения сточных вод.

Для решения технической задачи изобретения предложен способ ионообменного разделения метионина и глицина, характеризующийся тем, что разделение алифатических аминокислот метионина и глицина осуществляют в две стадии, на первой стадии проводят сорбцию аминокислот с обогащением фазы сорбента глицином, а раствора на выходе - метионином, для этого готовят полиамфолит Purolite S950 в H⁺-форме, проводят сорбцию смеси двух алифатических аминокислот в противоточной колонне с неподвижным слоем сорбента, для этого снизу пропускают раствор, содержащий смесь глицина и метионина, при этом глицин сорбируется на полиамфолите Purolite S950, на выходе появляется метионин, водный раствор которого собирают в приемник на выходе из колонны, через некоторое время - смесь аминокислот, сорбцию останавливают, в течение сорбции производят отбор проб через определенные промежутки времени, контролируют суммарную концентрацию аминокислот йодометрическим методом, метионина - спектрофотометрическим методом, глицина - по разности концентраций: суммарной и метионина, степень разделения исходного раствора составляет 60%, на второй стадии проводят элюирование глицина раствором соляной кислоты pH 1,2 из сорбента с подачей сверху, элюат, содержащий глицин, собирают в приемник, степень концентрирования глицина составляет 70%, после десорбции глицина проводят полную десорбцию смеси аминокислот, полиамфолит принимает исходную форму и готов к работе, при этом также отбирают пробы через определенные промежутки времени и проводят анализ каждой пробы йодометрическим и спектрофотометрическим методами, для полного отделения глицина от метионина повторяют двустадийный процесс разделения смеси аминокислот, полученной на выходе из колонны.

Технический результат заключается в увеличении эффективности разделения смеси аминокислот, исключении из технологического процесса вспомогательных реактивов, повышении выхода аминокислот и уменьшении объемов промывных вод.

На фиг.1 представлены зависимости отношения концентрации аминокислоты в растворе на выходе из колонны к исходной концентрации (c/c₀) от времени сорбции (t, мин) метионина (кривая 1) и глицина (кривая 2) на Purolite S950 (H⁺) при 298 К и скорости пропускания 7 см³/мин.

На фиг.2 представлены зависимости отношения концентрации аминокислоты в элюате к концентрации в смоле (c/c₀) от времени десорбции (t, мин) глицина (кривая 1) и метионина (кривая 2) из Purolite S950 раствором соляной кислоты с рН 1,2 и скоростью пропускания 8 см³/мин.

Способ ионообменного разделения алифатических аминокислот глицина и метионина из водных растворов реализуют следующим образом.

Разделение аминокислот проводится в две стадии: первая стадия - сорбция смеси аминокислот с обогащением жидкой фазы метионином, а твердой фазы глицином, вторая стадия - элюирование с обогащением раствора глицином.

В колонну загружают полиамфолит Purolite S950; подготовку смолы осуществляют следующим образом: пропускают через слой ионообменника последовательно раствор КОН с концентрацией 0,5 моль/дм³, дистиллированную воду, раствор соляной кислоты с концентрацией 0,5 моль/дм³, воду до полного удаления соляной кислоты из межгранульного пространства, полиамфолит переведен в Н⁺-форму и готов к использованию; проводят сорбцию, для этого снизу пропускают раствор, содержащий смесь глицина и метионина, на выходе из колонны первым появляется метионин, через некоторое время - смесь аминокислот, степень разделения исходного раствора составляет 60%, сорбцию прекращают. В течение сорбции через определенные промежутки времени отбирают пробы раствора на выходе из колонны. Суммарную концентрацию аминокислот в растворе определяют йодометрическим методом. Концентрацию метионина в отобранных пробах определяют спектрофотометрическим методом. Концентрацию глицина рассчитывают по разнице между суммарной концентрацией аминокислот и метионина.

На второй стадии осуществляют десорбцию глицина из полиамфолита раствором соляной кислоты с pH 1,2 с подачей элюента сверху. Степень концентрирования глицина составляет 70%. В течение десорбции проводят анализ отобранных через определенные промежутки времени растворов йодометрическим и спектрофотометрическим методами. После элюирования глицина и смеси аминокислот полиамфолит принимает исходную форму и готов к работе.

Для более глубокого разделения аминокислот ионообменный цикл, состоящий из двух стадий, повторяют.

Использование сорбента полиамфолитной природы позволяет достичь высокой степени разделения алифатических аминокислот (глицина и метионина), которые имеют схожие физико-химические характеристики и различаются длиной углеводородного радикала. Объемы разделяемых растворов и исходная концентрация аминокислот могут быть различны, поэтому требуемая производительность ионообменников варьируется, в связи с этим характеристики ионообменных колонн (высота, диаметр, скорость подачи раствора, объем сорбента и т.д.) подбираются для каждого случая отдельно.

Способ ионообменного разделения метионина и глицина поясняется следующим примером.

Пример. Разделение аминокислот проводят из водного раствора с содержанием глицина 0,025 моль/дм³ и метионина 0,0026 моль/дм³, приготовленного растворением аминокислот марки «Reanal» в дистиллированной воде. Сорбцию и десорбцию глицина осуществляют на амфолите Purolite S950 в H⁺-форме в колоне с внутренним диаметром 56 мм и высотой 158 мм. В колонну загружают полиамфолит Purolite S950, пропускают через слой ионообменника раствор КОН с концентрацией 0,5 моль/дм³, затем дистиллированную воду, после нее раствор соляной кислоты с концентрацией 0,5 моль/дм³ и снова воду до полного удаления соляной кислоты из межгранульного пространства. На первой стадии разделения проводят сорбцию, подавая в колонну раствор аминокислот снизу вверх со скоростью 7 см³/мин. Отбор проб на выходе из колонны осуществляют через 10 мин с точно фиксируемым временем для дальнейшего построения выходных кривых. Данные о ходе сорбции смеси глицин-метионин из водного раствора представлены в таблице 1.

Определение суммарной концентрации аминокислот в элюате осуществляют йодометрическим титрованием. Для этого в мерную колбу на 50 см³ пипеткой вносят 5 см³ исследуемого щелочного раствора, содержащего аминокислоту. Из цилиндра приливают 30 см³ свежеприготовленного фосфата меди, содержимое колбы доводят водой до метки, перемешивают и фильтруют через фильтр с синей лентой. Фильтрат должен быть прозрачным. Затем 10 см³ фильтрата пипеткой вносят в коническую колбу, добавляют 0,5 см³ ледяной уксусной кислоты и 7 см³ 10% раствора йодида калия. После перемешивания выделившийся йод титруют из микробюретки раствором тиосульфата натрия с концентрацией 0,01 моль/дм³, прибавляя в конце титрования 1-2 капли свежеприготовленного раствора крахмала, точку эквивалентности определяют по исчезновению синей окраски.

Наличие метионина в отобранных пробах определяют спектрофотометрическим методом. Для этого в мерную колбу вносят объем раствора метионина, такой, чтобы его концентрация находилась в пределах градуировочного графика от 0,0005 до 0,001 моль/дм³, затем добавляют раствор азотной кислоты до pH 1 и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Перед началом измерений на портативном спектрофотометре UVMini-1240 проводят калибровку прибора по дистиллированной воде. Затем в кювету наливают растворы, содержащие метионин (met), и измеряют оптическую плотность (A) в интервале длин волн от 190 до 250 нм. Для проверки соответствия максимума строят дифференциальный спектр поглощения, определяют оптическую плотность раствора при λ=211 нм. По градуировочной функции, построенной в координатах A=f(c_met), устанавливают концентрацию метионина и пересчитывают концентрацию в исходном растворе.

Концентрацию глицина в водном растворе определяют по разнице между суммарной концентрацией аминокислот и метионина. Результаты исследований представлены на фиг.1 и фиг.2.

Как видно на фиг.1, выделение метионина из раствора с глицином происходит в интервале времени от 110 до 175 мин от начала сорбции. Оптимальное время разделения глицина и метионина при сорбции составляет 150 мин от начала процесса, при этом степень разделения составляет 60%.

Процесс десорбции глицина из раствора с метионином осуществляется раствором соляной кислоты с концентрацией 0,1 моль/дм³, которая подается в колонну сверху вниз, со скоростью пропускания 8 см³/мин.

Контроль осуществляют отбором проб на выходе из колонны через каждые 10 мин и дальнейшим их анализом. Определения концентраций аминокислот осуществляют приведенным выше способом. Данные о ходе десорбции смеси глицин-метионин представлены в таблице 2.

Как видно из фиг.2, выходные кривые десорбции глицина и метионина расположены практически параллельно. Концентрирование глицина происходит на 70% в интервале времени элюирования от 40-110 мин.

При необходимости через колонну повторно пропускают смесь аминокислот, полученную ранее на выходе из колонны (содержащую глицин и оставшийся метионин). В результате на выходе получают раствор метионина, глицин сорбируется на смоле. После этого процесс элюирования глицина соляной кислотой и промывки сорбента водой повторяют.

Как видно из примера, таблиц и фигур, выделение метионина происходит на стадии сорбции смеси аминокислот, а выделение глицина - при элюировании, при этом ионит переходит в исходное рабочее состояние.

Предлагаемый способ ионообменного разделения метионина и глицина позволяет эффективно разделять алифатические аминокислоты - глицин и метионин из гидролизатов различного генезиса и биохимических сточных вод сочетанием процессов сорбции и десорбции, исключить стадию регенерации сорбента, использование значительного количества вспомогательных реактивов и стадию предварительной подготовки растворов аминокислот перед пропусканием через ионообменник, уменьшить объемы промывных вод.

Таблица 1 Способ ионообменного разделения метионина и глицина № пробы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Время отбора, мин 95 112 132 162 215 250 265 270 275 285 300 Суммарная концентрация, моль/дм³ 0 0,00001 0,0007 0,0017 0,0118 0,022 0,0236 0,0248 0,0256 0,0264 0,027 Концентрация метионина, моль/дм³ 0 0,00001 0,0007 0,0017 0,00172 0,00219 0,00223 0,00218 0,00224 0,00205 0,00196 Концентрация глицина, моль/дм³ 0 0 0 0 0,01 0,02 0,021 0,0226 0,023 0,024 0,025 C_гл/c_{0 гл} 0 0 0 0 0,395 0,777 0,838 0,887 0,916 0,955 0,982 C_мет/c_{0 мет} 0 0,004 0,28 0,68 0,84 0,88 0,89 0,87 0,89 0,82 0,79

Таблица 2 Способ ионообменного разделения метионина и глицина Номер пробы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Время отбора, мин 40 78 93 108 123 142 147 160 200 Суммарная концентрация, моль/дм³ 0,03 0,02 0,0124 0,0076 0 - - - - Концентрация глицина, моль/дм³ 0,025 0,017 0,01 0,0053 0,0012 0 - - - Концентрация метионина, моль/дм³ 0,0026 0,0026 0,0026 0,0025 0,0014 0,0008 0,0007 0,00002 0 C_сумм/c_{0 сумм} 1 0,67 0,41 0,25 0 - - - - C_гл/c_{0 гл} 1 0,68 0,4 0,212 0,048 0 - - - C_мет/c_{0 мет} 1 1 1 0,95 0,55 0,32 0,26 од 0

Изобретение относится к способу ионообменного разделения метионина и глицина и может найти применение в биохимической, фармацевтической и пищевой промышленности. Способ заключается в том, что разделение метионина и глицина осуществляют в две стадии, на первой стадии проводят сорбцию аминокислот с обогащением фазы сорбента глицином, а раствора на выходе - метионином, для этого готовят полиамфолит Purolite S950 в H⁺-форме, проводят сорбцию смеси двух алифатических аминокислот в противоточной колонне с неподвижным слоем сорбента, для этого снизу пропускают раствор, содержащий смесь глицина и метионина, при этом глицин сорбируется на полиамфолите Purolite S950, на выходе появляется метионин, водный раствор которого собирают в приемник на выходе из колонны, через некоторое время - смесь аминокислот, сорбцию останавливают, в течение сорбции производят отбор проб через определенные промежутки времени, контролируют суммарную концентрацию аминокислот иодометрическим методом, метионина - спектрофотометрическим методом, глицина - по разности концентраций: суммарной и метионина, степень разделения исходного раствора составляет 60%, на второй стадии проводят элюирование глицина раствором соляной кислоты с рН 1,2 из сорбента с подачей сверху, элюат, содержащий глицин, собирают в приемник, степень концентрирования глицина составляет 70%, после десорбции глицина проводят полную десорбцию смеси аминокислот, полиамфолит принимает исходную форму и готов к работе, при этом также отбирают пробы через определенные промежутки времени и проводят анализ каждой пробы иодометрическим и спектрофотометрическим методами, для полного отделения глицина от метионина повторяют двустадийный процесс разделения смеси аминокислот, полученной на выходе из колонны. Предлагаемый способ позволяет эффективно разделять метионин и глицин сочетанием процессов сорбции и десорбции, исключив при этом стадию регенерации сорбента, и уменьшить объемы промывных вод без использования значительного количества вспомогательных реактивов. 2 ил., 2 табл.

Способ ионообменного разделения метионина и глицина, характеризующийся тем, что разделение алифатических аминокислот метионина и глицина осуществляют в две стадии, на первой стадии проводят сорбцию аминокислот с обогащением фазы сорбента глицином, а раствора на выходе - метионином, для этого готовят полиамфолит Purolite S950 в Н⁺-форме, проводят сорбцию смеси двух алифатических аминокислот в противоточной колонне с неподвижным слоем сорбента, для этого снизу пропускают раствор, содержащий смесь глицина и метионина, при этом глицин сорбируется на полиамфолите Purolite S950, на выходе появляется метионин, водный раствор которого собирают в приемник на выходе из колонны, через некоторое время - смесь аминокислот, сорбцию останавливают, в течение сорбции производят отбор проб через определенные промежутки времени, контролируют суммарную концентрацию аминокислот иодометрическим методом, метионина - спектрофотометрическим методом, глицина - по разности концентраций: суммарной и метионина, степень разделения исходного раствора составляет 60%, на второй стадии проводят элюирование глицина раствором соляной кислоты с рН 1,2 из сорбента с подачей сверху, элюат, содержащий глицин, собирают в приемник, степень концентрирования глицина составляет 70%, после десорбции глицина проводят полную десорбцию смеси аминокислот, полиамфолит принимает исходную форму и готов к работе, при этом также отбирают пробы через определенные промежутки времени и проводят анализ каждой пробы иодометрическим и спектрофотометрическим методами, для полного отделения глицина от метионина повторяют двустадийный процесс разделения смеси аминокислот, полученной на выходе из колонны.