N-ИЗОВАЛЕРОИЛ-L-ГЛУТАМИЛ-L-ТРИПТОФАН КАК СРЕДСТВО, ПРЕПЯТСТВУЮЩЕЕ ЯЗВООБРАЗОВАНИЮ В ЖЕЛУДКЕ И ДВЕНАДЦАТИПЕРСТНОЙ КИШКЕ Российский патент 2011 года по МПК A61K38/05 A61P1/04 

Изобретение относится к органической химии, а именно к пептидным соединениям. Заявляемое вещество может найти применение как средство для лечения и профилактики язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки.

Язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки - хроническое циклически протекающее рецидивирующее заболевание - является одним из самых распространенных заболеваний желудочно-кишечного тракта. По современным представлениям ведущая роль в патогенезе язвенной болезни принадлежит нарушению равновесия между факторами агрессии желудочного сока и защиты слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки. Вследствие полиэтиологичности язвенной болезни фармакотерапия заболевания включает различные группы лекарственных средств, действие которых направлено на основные звенья патогенеза язвообразования: антациды, блокаторы Н₂-рецепторов и протонной помпы, антибиотики, антихеликобактерные средства и др. [Васильев Ю.В. Обволакивающие (антацидные) лекарственные препараты в терапии некоторых заболеваний верхних отделов пищеварительного тракта. // Гастроэнтерология. - Прил. к Consilium Medicum. - 2004. - №5. - С.244-248.; Васильев Ю.В. Современная терапия язвенной болезни, ассоциируемой с Helicobacter pilori. // Трудный пациент. - 2007. - №6-7. - С.35-41.; Васильев Ю.В. Язвенная болезнь. // Избранные главы клинической гастроэнтерологии. / Под ред. Л.Б.Лазебника. М.: Анахарсис, 2005. - С.82-112].

В настоящее время известно около 450 противоязвенных препаратов с различным механизмом действия. Однако нет ни одного препарата, который бы не вызывал, особенно при длительном применении, нежелательных побочных реакций. В силу этого так важна профилактика язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки.

Технический результат, на достижение которого направлено заявляемое изобретение, заключается в синтезе нового соединения класса пептидов, использование которого препятствует процессам язвообразования в желудке и двенадцатиперстной кишке, вызванным лекарственным или стрессорным воздействием или ассоциированным с заболеваниями других внутренних органов.

Указанный технический результат достигается синтезом N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофана формулы

где X=Н, Na, К, с молекулярной массой 417,5-456,5 как средства, препятсвующего язвообразованию в желудке и двенадцатиперстной кишке.

Заявляемое химическое соединение синтезировано нами впервые и не имеет структурных аналогов - N-защищенных пептидов - известных из уровня техники.

Синтез N-валероил-L-глутамил-L-триптофана (С₂₁Н₂₇N₃O₆) проводили в две стадии:

1. Получение N-оксисукцинимидного эфира изовалериановой кислоты

3.0 мл (30 мМ) изовалериановой кислоты растворяли в 30 мл тетрагидрофурана, добавляли 4,0 г N-оксисукцинимида, полученный раствор охлаждали на ледяной бане. 7,2 г (35 мМ) N,N'-дициклогексилкарбодиимида растворяли в 30 мл тетрагидрофурана и аналогично охлаждали. Полученные растворы объединяли и перемешивали при охлаждении льдом 3 часа и затем двое суток при комнатной температуре.

Выпавшую N,N'-дициклогексилмочевину отфильтровывали, растворитель упаривали на вакуумном роторном испарителе при 40°С. Остаток растворяли в минимальном количестве этилацетата и кристаллизовали при добавлении гексана. Полученный осадок отфильтровывали и перекристаллизовывали из изопропилового спирта. Продукт сушили в вакуумном шкафу над КОН и P₂O₅. Выход 4,7 г (76%).

Продукт гомогенен по данным тонкослойной хроматографии: подвижность Rf: 0,67 (система бензол-ацетон 1:1, пластинка Silufol, проявление хлор/бензидин).

2. Получение N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофана

1-2 г (6 мМ) N-оксисукцинимидного эфира изовалериановой кислоты суспендировали в 30 мл смеси диоксан-вода (1:1), при сильном перемешивании порциями добавляли 1.0 г (3 мМ) мононатриевой соли глутамил-триптофана. Перемешивание продолжали двое суток. рН реакционной смеси поддерживали в интервале 8,0-8,5 прибавлением 0.1 N раствора NaOH. По окончании реакции реакционную смесь подкисляли 0,5 N раствором H₂SO₄ до рН=3 и экстрагировали этилацетатом (3×50 мл). Объединенный органический слой последовательно промывали 0,5 N раствором H₂SO₄ (3×50 мл), водой (2×50 мл), охлажденным до 0°С 2,5% раствором NаНСО₃ (1×50 мл), водой (2×50 мл), 0,5 N раствором H₂SO₄ (2×50 мл), водой (2×50 мл) и насыщенным раствором Na₂SO₄ (2×50 мл). Органический слой сушили над безводным Na₂SO₄, растворитель упаривали на вакуумном роторном испарителе при 40°С, остаток кристаллизовали под гексаном. Полученный осадок отфильтровывали и сушили в вакуумном шкафу над КОН и Р₂O₅. Выход 1,1 г (80%).

Продукт хроматографически гомогенен по данным тонкослойной хроматографии: подвижность Rf: 0,27 (система бензол-ацетон 1:1, пластинка Silufol, проявление хлор/ бензидин).

Содержание основного вещества определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе "Beckman" на колонке Supelco LC-18-DB 4,6×250 мм. Подвижная фаза А: 0,1% TFA (трифторуксусная кислота); подвижная фаза В: MeCN (ацетонитрил) / 0,1%TFA; градиент В 0→20% за 30 мин. Скорость потока 1 мл/мин. Детекция при 220 нм, сканирование 190-600 нм, объем пробы 20 мкл. Содержание основного вещества 98,45%.

Для C₂₁H₂₇N₃O₆ вычислено в %: С (60,42), Н (6,52), N (10,07); найдено в %: С (60,31), Н (6,63), N(9, 95); ПМР-спектр (протонный магнитный резонанс) снимали на спектрометре (Bruker AM 300 Mhz, в DMSO (диметилсульфоксид): 6,97 (СН₃); 1,71 (СН); 1,97 (СН₂); 3,00 (СН); 4,92 (СН₂); 7,20, 7,08, 6,92, 6,82 (СН индол): 7,47 (NH индол); 7,84, 7,94 (NH амид); 10,63 (СООН). УФ-спектр (спектр поглощения в ультрафиолетовой области) снимали на спектрофотометре "Beckman": λ_max 280 нм, плечо λ 286 нм (0,004% р-р в 0,01 М NaOH).

3. Получение натриевой соли N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофана

600 мг N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофана суспендировали в 50 мл дистиллированной воды и добавляли 0,01 N раствор NaOH до рН=7. Полученный раствор упаривали на вакуумном роторном испарителе, продукт кристаллизовали из минимума воды изопропиловым спиртом. Осадок отфильтровывали и сушили в вакуумном шкафу на КОН и P₂O₅.

Калиевую соль получали аналогичным путем.

Было изучено общетоксическое действие заявляемого соединения.

Общетоксическое действие N-изовалероил-L-глугамил-L-триптофана исследовали в соответствии с требованиями «Руководства по экспериментальному доклиническому изучению новых фармакологических веществ» (2000): острой токсичности при однократном введении заявляемого препарата, а также подострой и хронической токсичности при длительном введении его.

Исследование по изучению острой токсичности проведено на 60 белых беспородных мышах самцах массой 20-23 г. Животные были разделены на 6 равных групп. Препарат вводили животным однократно внутримышечно в объеме 0,1 мл в дозах 1 мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг, 20 мг/кг, в стерильном 0,9% растворе NaCl. Животным контрольной группы в том же объеме вводили 0,9% раствор NaCl.

Исследования по изучению подострой токсичности проведено на 60 белых беспородных крысах-самцах массой 150-250 г. Ежедневно однократно животным подопытных групп вводили препарат внутримышечно в течение 90 дней в дозах 100 мкг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг в 0.25 мл 0,9% раствора NaCl. Животным контрольной группы вводили в том же объеме 0,9% раствор NaCl. До введения препарата, на 30, 60 и 90 сутки после начала введения препарата у животных исследовали морфологический состав и свойства периферической крови. При завершении эксперимента исследовали биохимические и коагулологические показатели крови.

Исследования по изучению хронической токсичности проводили в течение 6 месяцев, исходя из длительности рекомендуемого клинического назначения препарата, на 100 морских свинках-самцах массой 300-350 г. Животные подопытных групп получали ежедневно однократно внутримышечно дипептид в дозах 100 мкг/кг, 1 мг/кг, 10 мг/кг в 0,5 мл 0,9% раствора NaCl. В контрольной группе животным вводили по аналогичной схеме 0,9% раствор NaCl в том же объеме. У животных в периферической крови общепринятыми методами определяли количество эритроцитов, гемоглобина, ретикулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), резистентность эритроцитов. Наряду с этим определяли содержание в сыворотке крови общего белка по методу Лоури, калия и натрия методом плазменной спектрофотометрии. После завершения эксперимента проводили патоморфологическое исследование головного и спинного мозга, спинномозговых ганглиев, щитовидной железы, паращитовидных желез, надпочечников, семенников, гипофиза, сердца, легких, аорты, печени, почек, мочевого пузыря, поджелудочной железы, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, тимуса, селезенки, лимфатических узлов, костного мозга.

При изучении острой токсичности установлено, что однократное введение заявляемого вещества животным в дозе, превышающей терапевтическую, рекомендованную для клинического применения, более чем в 100 раз, не вызывает токсических реакций, что свидетельствует о большой терапевтической широте препарата.

Отсутствие общетоксического действия N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофана позволило рекомендовать его для проведения испытаний in vivo при экспериментальной язвенной патологии.

Было изучено фармакологическое действие заявляемого соединения в экспериментальных моделях язвообразования в желудке и двенадцатиперстной кишке. Следует отметить, что в патогенезе индуцированных приемом нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП) или стрессорным воздействием поражений желудочно-кишечного тракта большое место занимает нарушение трофики слизистых оболочек, снижение энергетического и пластического обеспечения тканей пищеварительного тракта в целом. Таким образом, ульцерогенному (язвообразующему) воздействию подвергается не только слизистая оболочка желудка, но и двенадцатиперстной кишки.

Были проведены три серии экспериментов:

- исследование профилактического противоязвенного действия N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофана (ВГТ) на модели водоиммерсионного стресса;

- исследование профилактического курсового введения ВГТ на формирование язв желудка, вызванных индометацином;

- исследование лечебного действия ВГТ на модели язв, вызванных индометацином.

Все исследования проводились на крысах-самцах линии Вистар массой 220±20 г, полученных из питомника Рапполово (Ленинградская область). В течение 14 дней до эксперимента животные находились на карантине. Содержание животных осуществляли в соответствии с правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). Животных размещали в стандартных пластиковых клетках и содержали на стандартном пищевом рационе (гранулированный корм ПК 120-3 согласно приказу №1179 МЗ СССР от 10.10.83 г.) при свободном доступе к воде.

В каждой серии экспериментов животных распределяли на опытные и контрольную группы по 10 крыс в каждой. Животным опытных групп перорально вводили исследуемый препарат или препарат сравнения, а животным контрольной группы - дистиллированную воду в том же объеме.

Пример 1. Эффективность применения N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофана при профилактическом курсовом применении на модели водоиммерсионного стресса.

Подопытные животные были разбиты на 5 групп по 10 особей в каждой. Они получали следующую терапию:

- Контрольная группа - дистиллированная вода per os;

- Опытная группа 1 - животные, получавшие N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофан в дозе 0,1 мкг/кг;

- Опытная группа 2 - животные, получавшие N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофан в дозе 10 мкг/кг;

- Опытная группа 3 - препарат сравнения сукральфат в дозе 200 мг/кг;

- Опытная группа 4 - препарат сравнения мизопростол в дозе 50 мг/кг.

Сукральфат - препарат, содержащий в качестве действующего вещества бета-D-фруктофуранозил-альфа-D-глюкопиранозид-октакис(гидросульфат)алюминия комплекс. Он рекомендован для лечения и кратковременной профилактики гастропатий, индуцированных нестероидными противовоспалительными препаратами (НПВП) для 3-4-кратного приема в сутки. Как и другие препараты, содержащие алюминий, для длительного приема он не пригоден.

Мизопростол - метиловый эфир (11альфа, 13Е)-(+-)-11,16-дигидрокси-16-метил-9-оксопрост-13-ен-1-овой кислоты - также разрешен к применению для профилактики гастропатий, индуцированной НПВП.

Эксперимент проводили следующим образом.

Исследуемое вещество, препараты сравнения и дистиллированную воду вводили ежедневно однократно в течение 7 дней, а также в день стрессового ульцерогенного воздействия за 1 час до стресса.

За 18 часов до ульцерогенного воздействия животных лишали пищи, оставляя свободный доступ к воде.

Крыс, голодавших в течение 18 часов, помещали в специальные пеналы и погружали в воду вертикально до уровня мечевидного отростка. В таком положении животных выдерживали 5 часов при температуре воды 23°С. Затем животных выводили из опыта.

В ходе эксперимента осуществляли контроль за изменением массы тела животных. Подопытных животных умерщвляли методом декапитации. Кровь собирали в пробирки. Желудки извлекали, вскрывали по большой кривизне, промывали холодным физиологическим раствором и с помощью лупы при ярком освещении тщательно осматривали поверхность слизистой. Учитывали цвет слизистой оболочки, наличие гиперемии и ее интенсивность. Определяли число и площадь деструкции, которые дифференцировали на точечные (менее 1 мм), полосовидные и крупные (более 1 мм). Подсчитывали среднее количество деструкции на одно животное в группе, процент животных с язвами. Определяли Индекс Паулса (ИП) как интегральный показатель количества деструкции, по формуле:

ИП=среднее количество деструкции в группе x % животных с язвами/100 [Pauls F., Wick A.M., Mac. Key E.M. et al. An assau method for anti ulcer substances // Gastroenterology. - 1947. №8. - P.774-782.]. Вычисляли индекс изъязвления: ИЯ = средняя площадь деструкции в группе x % животных с язвами/100, а также гастропротекторную активность: ГА₁=ИП контрольной группы/ИП опытной группы, ГА₂=ИЯ контрольной группы/ИЯ опытной группы. Изучаемый препарат считали активным, если ГА≥2.

Интенсивность процессов свободнорадикального окисления оценивали по накоплению малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови [Темирбулатов Р.А., Селезнев Е.И. Метод повышения интенсивности свободнорадикального окисления липидсодержащих компонентов крови и его диагностическое значение. // Лабор. дело. - 1981. - №4. - С.209-211]. О состоянии антиоксидантной системы судили по активности супероксиддисмутазы (СОД) [Чевари С., Чаба И., Секей И. Роль супероксиддисмутазы в окислительных процессах клетки и метод определения ее в биологических материалах. // Лабор. дело. - 1985. - №11. - С.678-681].

В сыворотке крови определяли активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) и щелочной фосфатазы (ЩФ) с помощью наборов фирмы «Витал Девелопмент корпорейшн».

Выраженность стрессорных изменений внутренних органов животных оценивали по изменению относительной массы надпочечников, тимуса и селезенки, которую вычисляли как отношение массы органа к массе животного, умноженное на 100.

Статистическую обработку производили, используя пакет статистических программ STATISTICA 6.

Известно [Селье Г. Очерки об адаптационном синдроме. М., «Медгиз», 1960, с.207], что в результате стрессорного воздействия у животных развивается комплекс изменений во внутренних органах, так называемая «триада Селье»: гипертрофия надпочечников, инволюция иммунокомпетентных органов, появление деструкции в слизистой оболочке желудка.

Эксперимент показал, что у животных, подвергнутых 5-часовому водоиммерсионному стрессу, происходило развитие выраженной гиперемии слизистой оболочки желудка, а также образование язв и эрозий. Кроме того, отмечались гипертрофия надпочечников и усиление ПОЛ (Табл.1-4).

Профилактическое внутрижелудочное введение препарата в обеих дозах способствовало уменьшению количества и площади язвенных поражений желудка, вызванных стрессом. Эффект N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофана зависел от дозы, причем эта зависимость носила обратный характер. Уменьшение площади деструкции имело более выраженный характер, так как изменение среднего количества язв на одно животное в группе происходило в основном за счет снижения количества крупных деструкций (Табл. 1).

* - достоверные изменения по сравнению с контрольной (стресс) группой, Р<0,05 Так, препарат ВГТ уменьшал площадь крупных деструкции в 2,7 и 3,4 раза, в зависимости от дозы. Профилактический эффект в меньшей дозе был более выражен в отношении предотвращения образования общего количества деструкции и сокращения их площади. Кроме того, профилактическое введение N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофана в дозе 0,1 мкг/кг способствовало снижению, сопоставимому с сукральфатом, количества животных с язвами в группе.

Таблица 2 Гастропротекторная активность (ГА) N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофана при водоиммерсионном стрессе (M±SEM) Группы Количество поражений Площадь поражений % животных с язвами Индекс Паулса Индекс изъязвления ГА₁ ГА₂ Контроль стресс 22,1±1,1 20,2±1,6 100 22,1 20,2     Препарат ВГТ 0,1 мкг/кг + стресс 15,4±2,1 8,7±2,0* 90 13,9 7,83 1,59 2,58 Препарат ВГТ 10,0 мкг/кг + стресс 16,3±1,5 9,7±1,2* 100 16,3 9,7 1,36 2,08 Сукральфат 200 мг/кг + стресс 8,8±1,4* 7,5±1,5* 90 7,92 6,75 2,79 2,99 Мизопростол 50 мкг/кг + стресс 13,6±2,4* 7,3±1,3* 100 13,6 7,3 1,63 2,77 * - достоверные изменения по сравнению с контрольной (стресс) группой, Р<0,05 ГА₁ - гастропротекторная активность, рассчитанная по количеству деструкций ГА₂ - гастропротекторная активность, рассчитанная по площади поражений

Расчет и сравнение индексов изъязвления и гастропротекторной активности показали, что противоязвенная активность препарата ВГТ в дозе 0,1 мкг/кг была сопоставима с таковой препаратов сравнения сукральфата и мизопростола. Так, у животных, получавших N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофана, площадь поражений была в 2,1-2,6 раза меньше, чем у животных в группе контроля.

Таблица 3 Активность супероксиддисмутазы и содержание малонового ангидрида в сыворотке крови крыс при водоиммерсионном стрессе (M±SEM) Группы СОД (усл.ед./мл) МДА (OD₅₃₂) Интактные животные 2,20±0,17 0,103±0,016 Контроль стресс 0,96±0,09# 0,271±0,020# Препарат ВГТ 0,1 мкг/кг + стресс 2,20±0,09* 0,130±0,019* Препарат ВГТ 10,0 мкг/кг + стресс 2,35±0,11* 0,128±0,020* Сукральфат 200 мг/кг + стресс 2,32±0,11* 0,147±0,007* Мизопростол 50 мкг/кг + стресс 2,58±0,17* 0,151±0,011* # - достоверные изменения по сравнению с интактными животными, Р<0,05; * - достоверные изменения по сравнению с контрольной группой, Р<0,05

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что исследуемый препарат - N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофан - проявляет профилактический эффект, повышая устойчивость слизистой оболочки желудка к повреждающему действию стресса.

Повышение резистентности слизистой оболочки желудка проявлялось также в предупреждении чрезмерной интенсификации перекисного окисления липидов (ПОЛ) и сохранении активности ферментов антиоксидантной системы (АОС) в сыворотке крови крыс (Табл. 3). N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофан в исследуемых дозах предотвращал снижение активности СОД и увеличение продукции МДА.

Таблица 4 Влияние N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофана на активность аланинаминотрансферазы и щелочной фосфатазы в сыворотке крови крыс, подвергнутых водоиммерсионному стрессу (M±SEM) Группы АлАТ (мМоль/ч·л) ЩФ (нМоль/с·л) Интактные животные 1,08±0,03 1037+65 Контроль стресс 2,20±0,23# 1496±36# Препарат ВГТ 0,1 мкг/кг + стресс 1,55±0,15* 1100±54* Препарат ВГТ 10,0 мкг/кг + стресс 1,78±0,08* 1123±55* Сукральфат 200 мг/кг + стресс 1,57±0,06* 1113±77* Мизопростол 50 мкг/кг + стресс 1,60±0,06* 976±76* # - достоверные изменения по сравнению с интактными животными, Р<0,05; * - достоверные изменения по сравнению с контрольной (стресс) группой, Р<0,05

Профилактическое использование препарата способствовало сохранению активности аланинаминотрансферазы (АлАТ) и щелочной фосфатазы (ЩФ) на уровне, близком таковому у интактных животных. При этом эффект препарата ВГТ в дозе 0,1 мкг/кг был более заметен (Табл. 4).

Расчет относительной массы селезенки и тимуса показал, что при стрессе достоверных изменений этих показателей не отмечалось, в то время как относительная масса надпочечников достоверно увеличивалась на 18% (Табл. 5). N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофана в дозе 0,1 мкг/кг предотвращал развитие гипертрофии надпочечников, способствуя снижению их массы на 16-17%, по сравнению с таковыми у контрольных животных. Введение малой дозы препарата приводило к уменьшению относительной массы селезенки по отношению к показателям, отмечавшимся у интактных животных, на 24%.

Таблица 5 Влияние курсового профилактического введения N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофана на массу органов крыс, подвергнутых стрессу (M±SEM) Группы Масса животных (г) селезенка надпочечники тимус масса, г отн. масса, % масса, г отн. масса, % масса, г отн. масса, % Интактные животные 232±6 1,148±0,099 0,49±0,048 41,7±1,8 0,017±0,001 0,290±0,017 0,125±0,007 Контроль стресс 241±7 1,0±0,059 0,42±0,07 48,3±2,6# 0,020±0,001# 0,347±0,025 0,145±0,01 Препарат ВГТ 0,1 мкг/кг + стресс 236±7 0,872±0,066 037±0,06* 40,8±1,1* 0,017±0,001* 0307±0,028 0,124±0,010* Препарат ВГТ 10,0 мкг/кг + стресс 239±6 0,977±0,082 0,41±0,03 45,2±2,2 0,018±0,001* 0,350±0,022 0,154±0,008 Сукральфат 200 мг/кг + стресс 240±7 0,974±0,057 0,40±0,02 41,6±2,7 0,017±0,001* 0,327±0,016 0,140±0,007 Мизопростол
50 мкг/кг + стресс 229±6 0,886±0,052 0,39±0,02 41,0±0,8* 0,018±0,001 0,323±0,030 0,140±0,011 # - достоверные изменения по сравнению с интактными животными, Р<0,05; * - достоверные изменения по сравнению с контрольной группой, Р<0,05

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что препарат ВГТ оказывал стресспротекторное действие, которое проявлялось в уменьшении степени поражения слизистой оболочки желудка; предотвращении гипертрофии надпочечников, чрезмерной интенсификации ПОЛ, нарушения защитной функции АОС и увеличения активности ферментов-маркеров повреждения тканей.

Пример 2. Эффективность применения N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофана при профилактическом курсовом применении на модели язвообразования, вызванного пероральным введением инодметацина

Пять групп животных по 10 особей в группе готовили к эксперименту, как в Примере 1.

В каждой серии экспериментов животных распределяли на опытные и контрольную группы, по 10 крыс в каждой. Животным опытных групп перорально вводили исследуемый препарат или препарат сравнения, а животным контрольной группы - дистиллированную воду в том же объеме:

- Контрольная группа - дистиллированная вода per os;

- Опытная группа 1 - N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофана в дозе 0,1 мкг/кг;

- Опытная группа 2 - N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофан в дозе 10 мкг/кг;

- Опытная группа 3 - препарат сравнения сукральфат в дозе 200 мг/кг.

В качестве ульцерогенного вещества животным вводили в желудок индометацин в дозе 20 мг/кг (2 мл/кг).

Индометацин является нестероидным противовоспалительным препаратом, который отличается ульцерогенным воздействием на слизистые оболочки желудка.

Эффективность профилактического применения заявляемого вещества оценивали через 24 часа после введения индометацина. Исследование проводили, как в Примере 1.

Установлено, что введение индометацина в ульцерогенной дозе вызывало образование деструкции слизистой оболочки желудка, причем наибольшее их количество и площадь приходились на крупные и полосовидные повреждения. Возникновение язвенных дефектов слизистой оболочки желудка сопровождалось снижением активности СОД и увеличением содержания МДА, повышением активности АлАТ и ЩФ в сыворотке крови, изменением относительной массы органов (достоверным увеличением относительной массы печени и селезенки, выраженной тенденцией к увеличению этого показателя у надпочечников и тимуса) (Табл. 6-9).

Профилактическое введение препарата ВГТ в значительной степени препятствовало образованию язвенных поражений желудка, вызванных индометацином (Табл. 6). Площадь деструкции слизистой оболочки желудка у животных, получавших препарат ВГТ, снижалась в 5 раз.

Расчет и сравнение интегральных показателей противоязвенной активности показали, что N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофан обладает выраженной гастропротекторной активностью (Табл.7).

Наряду с этим, установлено, что введение индометацина в дозе 20 мг/кг сопровождалось выраженной индукцией процессов свободнорадикального окисления и параллельно развивающимися нарушениями антиоксидантного статуса организма (Табл.8). Профилактическое введение исследуемого вещества способствовало снижению в сыворотке крови концентрации конечного продукта перекисного окисления липидов ПОЛ - МДА - на 140%, а также повышению активности фермента эндогенной антиоксидантной системы - СОД - в 1,6 раза по сравнению с аналогичными показателями у животных контрольной группы.

Таблица 7 Гастропротекторная активность N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофана при моделировании индометациновых язв желудка Группы Количество поражений Площадь поражений % животных с язвами ИП Индекс изъязвления ГА₁ ГА₂ Контроль индометачип 20 мг/кг 21,3±2,1 22,6±4,5 100 213 22,6     Препарат ВГТ 0,1 м кг/кг + индомстацин 7,5±1,0* 4,1±0,9* 100 7,5 4,1 2,84 531 Препарат ВГТ 10,0 мкг/кг + индометацин 8,3±1,7* 4,1±1,6* 100 83 4,1 2,57 5,51 Сукральфат 200 мг/кг + индометацин 5,4±1,4* 3,3±1,2* 80 432 2,64 4,93 8,56 * - достоверные изменения по сравнению с контрольной группой, Р<0,05 ГА₁ - гастропротекторная активность, рассчитанная по количеству деструкции ГА₂ - гастропротекторная активность, рассчитанная по площади поражений

Таблица 8 Влияние профилактического введения N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофана на активность аланинаминотрансферазы и щелочной фосфатазы в сыворотке крови крыс при индометациновом язвообразовании (M±SEM) Группы СОД (усл. ед./мл) МДА (OD₅₃₂) Интактные животные 2,54±0,13 0,103±0,016 Контроль индометацин 20 мг/кг 1,52±0,12# 0,268±0,020# Препарат ВГТ 0,1 мкг/кг + индометацин 2,50±0,05* 0,124±0,009* Препарат ВГТ 10,0 мкг/кг + индометацин 2,58±0,14* 0,158±0,030* Сукральфат 200 мг/кг + индометацин 2,68±0,14* 0,134±0,024* # - достоверные изменения по сравнению с интактными животными, Р<0,05; * - достоверные изменения по сравнению с контрольной группой, Р<0,05

Таблица 9 Влияние N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофана на активность аланинаминотрансферазы и щелочной фосфатазы в сыворотке крови крыс при индометациновом язвообразовании (M±SEM) Группы АлАТ (мМоль/ч·л) ЩФ (нМоль/с·л) Интактные животные 1,03±0,10 1037±65 Контроль Индометацин 20 мг/кг 1,42±0,07# 1277±84# Препарат ВГТ 0,1 мкг/кг + индометацин 1,04±0,06* 1108±91 Препарат ВГТ 10,0 мкг/кг + индометацин 1,08±0,06* 1180±91 Сукральфат 200 мг/кг + индометацин 1,05±0,05* 931±108 # - достоверные изменения по сравнению с интактными животными, Р<0,05; * - достоверные изменения по сравнению с контрольной группой, Р<0,05

Введение ВГТ в обеих дозах препятствовало увеличению активности АлАТ в сыворотке крови, вызванному введением индометацина. На активность щелочной фосфатазы достоверного влияния исследуемый препарат не оказал (Табл.9).

Кроме того, введение препарата ВГТ в изучаемых дозах способствовало сохранению относительной массы селезенки, надпочечников и тимуса на уровне, характерном для интактных животных (Табл.10).

Представленные результаты показывают, что заявляемое вещество проявляет гастропротекторную активность на модели индометацинового повреждения при профилактическом курсовом применении.

Пример 3. Эффективность лечебного применения N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофана на модели язвообразования, вызванного индометацином

5 групп животных по 10 особей в каждой готовили, как в Примере 1.

В каждой серии экспериментов животных распределяли на опытные и контрольную группы по 10 крыс в каждой. Животным опытных групп перорально вводили исследуемый препарат или препарат сравнения, а животным контрольной группы - дистиллированную воду в том же объеме:

- Контрольная группа - дистиллированная вода per os;

- Опытная группа 1 - N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофан в дозе 0,1 мкг/кг;

- Опытная группа 2 - N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофан в дозе 10 мкг/кг;

- Опытная группа 3 - препарат сравнения сукральфат в дозе 200 мг/кг.

Ульцерогенную дозу индометацина, равную 30 мг/кг, вводили внутрижелудочно в объеме 2 мл/кг. Лечение начинали через 24 часа после введения индометацина и продолжали в течение 5 дней. Животные в опытных группах получали N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофан или препарат сравнения сукральфат, а в контрольной группе - дистиллированную воду.

Введение подопытным животным ульцерогенной дозы индометацина (30 мг/кг) через сутки вызывало образование язвенных поражений у 100% животных. На 5-е сутки количество и площадь поражений у животных контрольной группы (индометацин) не изменились (Табл.11).

На 5-е сутки в контрольной группе выжило только 7 животных из 10; в группе, получавшей ВГТ, выжило 9 из 10.

Применение препарата с лечебной целью показало, что N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофана, а также сукральфат вызывали уменьшение количества и площади поражений желудка. Терапевтический эффект у препарата ВГТ был сильнее в дозе 0,1 мкг/кг; также повышалась выживаемость животных (9 выживших из 10). При этом достоверно снижалось количество и площадь поражений, индекс Паулса был в 2 раза меньше, чем у животных контрольной группы, а гастропротекторная активность была равна 2 и 2,6. По своему лечебному действию, в отношении способности сокращать количество и площадь поражений, препарат ВГТ в дозе 0,1 мкг/кг достоверно не отличался от препарата сравнения сукральфат. Однако в группе, получавшей сукральфат, деструкции желудка наблюдали только у 85,7% животных, поэтому ИП и ГА в этой группе были несколько выше, чем у животных, получавших N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофана.

Наблюдение за изменением массы тела животных (Табл.12) показало, что при введении животным ульцерогенной дозы индометацина на 5 сутки происходило достоверное снижение данного показателя на 17,6% по сравнению с интактными животными. Небольшое снижение массы тела у интактных животных связано с 18-часовым голоданием. Применение ВГТ с лечебной целью не вызывало достоверных изменений этого показателя по сравнению с интактными животными.

Образование деструкции слизистой оболочки желудка сопровождалось повышением интенсивности ПОЛ. Индометацин в ульцерогенной дозе вызывал снижение активности СОД и повышение уровня МДА уже через 1 сутки, на 5-е сутки активность СОД повышалась, а уровень МДА был в 2 раза выше нормы (Табл.13).

Таблица 12 Влияние введения N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофана на изменение массы тела животных при индометациновой интоксикации (M±SEM) Группы Масса животных до введения индометацина, % через 5 суток Интактные животные 100 93,5±0,9 Контроль индометацин 30 мг/кг 100 82,4±0,9# Препарат ВГТ 0,1 мкг/кг 100 84,4±2,3# Препарат ВГТ 10,0 мкг/кг 100 84,1±3,0# Сукральфат 200 мг/кг 100 86,6±2,5 # - достоверные изменения по сравнению с интактными животными, Р<0,05

Таблица 13 Влияние лечебного действия N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофана на активность супероксиддисмутазы и содержание малонового ангидрида в сыворотке крови крыс при индометациновой интоксикации (M±SEM) Группы СОД (усл.ед./мл) МДА (OD₅₃₂) Интактные животные 2,82±0,21 0,103±0,016 Контроль индометацин 1 сутки 1,30±0,08# 0,188±0,011# Контроль индометацин 5 суток 2,34±0,10 0,245±0,017# Препарат ВГТ 0,1 мкг/кг 3,10±0,11* 0,169±0,012*# Препарат ВГТ 10,0 мкг/кг 3,06±0,16* 0,217±0,030# Сукральфат 200 мг/кг 2,66±0,11 0,155±0,037* # - достоверные изменения по сравнению с интактными животными, Р<0,05 * - достоверные изменения по сравнению с контрольной группой, Р<0,05

Применение малой дозы препарата ВГТ снижало содержание МДА на 70% и увеличивало активность СОД.

Индометациновая интоксикация приводила к снижению активности АлАТ и повышению ЩФ. Применение обеих доз N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофана повышало сниженную активность АлАТ, однако не до уровня, характерного для интактных животных, а также снижало активность ЩФ. При этом наибольший эффект наблюдался при использовании меньшей дозы препарата ВГТ (Табл.14).

Полученные результаты также свидетельствуют, что введение ульцерогенной дозы индометацина вызывало развитие гипертрофии надпочечников, а также инволюцию селезенки и тимуса. Инволюция тимуса имела ярко выраженный характер - масса органа снижалась почти в 2 раза (Табл.15).

Таблица 14 Влияние курсового применения N-изовалероил-L-глутамил-L-триппюфана на активность аланинаминотрансферазы и щелочной фосфатазы в сыворотке крови крыс с индометациновыми язвами (M±SEM) Группы АлАТ (mM/h*1) ЩФ (nM/s*1) Интактные животные 1,08±0,03 1037±65 Контроль индометацин 0,52±0,09# 1607±147# Препарат ВГТ 0,1 мкг/кг 0,75±0,09# 1357±58 Препарат ВГТ 10,0 мкг/кг 0,66±0,11# 1368±148 Сукральфат 200 мг/кг 0,69±0,05# 1260±104 # - достоверные изменения по сравнению с интактными животными, Р<0,05 * - достоверные изменения по сравнению с контрольной группой, Р<0,05

Применение препарата ВГТ с лечебной целью на фоне индометациновой интоксикации приводило к снижению повышенной массы надпочечников. Из таблицы 15 видно, что изменения массы тимуса при применении препаратов не достоверны, однако можно отметить тенденцию к увеличению сниженной массы тимуса под влиянием N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофана.

Таким образом, исходя из полученных результатов можно заключить, что N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофан проявляет лечебное действие на модели индометацинового ульцерогенеза. При этом наилучший терапевтический эффект наблюдался в дозе 0,1 мкг/кг.

Представленные данные свидетельствуют, что заявляемое соединение - N-изовалероил-L-глутамил-L-триптофан - препятствует процессам язвообразования на слизистых оболочках желудка и может использоваться как лечебное и профилактическое противоязвенное средство.

Изобретение относится к органической химии, а именно к пептидным соединениям. Средство содержит модифицированный N-защищенный дипептид общей формулы

где Х=Н, Na, К, с молекулярной массой 417,5-456,5. Средство, содержащее соединение, препятствует язвообразованию на слизистых желудка и двенадцатиперстной кишки и не вызывает токсических реакций. 15 табл.

N-изовалероил-L-глутамин-L-триптофан общей формулы

где Х - Н, Na, K, с молекулярной массой 417,5-456,5 как средство, препятствующее язвообразованию в желудке и двенадцатиперстной кишке.