ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ Российский патент 1999 года по МПК A61K31/40 A61K38/05 

Изобретение относится к медицине, в частности к фармацевтическим препаратам на основе пептидов, а именно к фармацевтическим композициям на основе L-глутамин-L-триптофана.

L-глутамил-L-триптофан (Временная фармакопейная статья, ВФС, N 42-1981-90) является одним из регуляторных пептидов и находит применение, например, в качестве иммуностимулирующего средства для лечения больных с иммунодефицитными состояниями (патент РФ N 1582393, кл. A 61 K 37/02).

Известно (ВФС N 42-1981-90), что L-глутамил-L-триптофан очень мало растворим в воде или в изотоническом растворе хлорида натрия. Для получения 0,01%-ного раствора L-глутамин-L-триптофана, обычно используемого в медицинской практике, навеску дипептида в воде или изотоническом растворе обрабатывают ультразвуком в течение 2 мин. Обработка ультразвуком приводит к частичному разрушению молекулы L-глутамин-L-триптофана.

Также известен 0,01%-ный раствор L-глутамин-L-триптофана в 0.01М растворе гидроксида натрия (ВФС N 42-1983-90), в котором L-глутамин-L-триптофан растворяется мало, но больше, чем в воде.

Недостатком указанного раствора является то, что его pH равен 12, что весьма нежелательно для использования L-глутамин-L-триптофана в качестве лекарственного препарата, поскольку pH среды в организме не превышает 7,0.

Наиболее близкой по совокупности существенных признаков к заявляемой композиции является мононатриевая соль L-глутамин-L-триптофана общей формулы:

(Ерюхина А.П., Куликов С.В. // Ж. общей химии. 1995, т. 65, Вып. 10, с. 1735-1738).

Указанная соль хорошо растворима в воде и позволяет получать растворы такой концентрации, которая необходима для использования L-глутамил-L-триптофана в качестве иммуномодулятора с биорегулирующим спектром действия.

Однако, как показали наши исследования как сухой натриевой соли L-глутамил-L-триптофана, так и особенно ее водных растворов, на хроматограмме, полученной методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, появляется дополнительный пик, соответствующий пироглутамил-триптофану:

На фиг. 1 представлена хроматограмма мононатриевой соли L-глутамил-L-триптофана, полученная по методике, описанной в ВФС N 42-1981-90. Пик на фиг. 1 (t= 3,696 мин) соответствует 99,38% указанного вещества. На фиг. 2 представлена хроматограмма того же вещества, хранившегося 5 лет. Пик t=4,038 мин отвечает 64,14% мононатриевой соли L-глутамил-L-триптофана и рядом появился пик t= 4,686 мин, соответствующий 33,18% пироглутамил-триптофана (спектрофотометрическая идентификация).

Пироглутамил-триптофан не токсичен, но менее эффективен, чем мононатриевая соль L-глутамил-L-триптофана, следовательно, дозы дипептида, разработанные для различных заболеваний, становятся неэффективными.

Технический результат, достигаемый в заявляемом изобретении, выражается в поддержании постоянного состава мононатриевой соли L-глутамил-L-триптофана.

Указанный технический результат достигается тем, что фармацевтическая композиция на основе мононатрисвой соли L-глутамил-L-триптофана дополнительно содержит аминоуксусную кислоту при следующем соотношении компонентов, (мас. ч. ): мононатриевая соль L-глутамил-L-триптофана 1 - 3; аминоуксусная кислота 50 - 100.

Аминоуксусная кислота H₂N-CH₂COOH (синонимы: глицин, гликокол) представляет собой кристаллический порошок белого цвета, легко растворимый в воде. Она улучшает метаболические процессы в тканях головного мозга, обладает седативным действием и используется для лечения хронического алкоголизма. Суточная доза препарата составляет 2,5 - 4,2 г (Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Медицина, 1993, ч. 2, с. 114). Стабилизирующее действие аминоуксусной кислоты на перегруппировку линейной части молекулы мононатриевой соли L-глутамил-L-триптофана является неожиданным, однако в смеси с глицином дипептид остается неизменным как в сухом виде, так и в растворе.

На фиг. 3-8 представлены хроматограммы, полученные методом высокоскоростной жидкостной хроматографии композиции, содержащей мононатриевую соль L-глутамил-L-триптофана и аминоуксусную кислоту в соотношении 3:5 мас.ч. Хроматограммы получены по методике, описанной в ВФС N 42-1981-90. Была использована колонка длиной 250 мм с внутренним диаметром 4,6 мм, набитая C₁₈, т.е. октадодецилсиликагелем. Элюэнт - смесь 15 мас.% ацетонитрила с 85 мас.% водного раствора трифторуксусной кислоты, концентрация которой - 0,05 мас.%. Скорость делюции - 1 мл/мин, режим изократический. Идентификация веществ - спектрофотометрическая.

На фиг. 3 представлена хроматограмма композиции сразу при приготовлении. Как видно на фиг.3, здесь присутствует пик t=3,893 мин, соответствующий мононатриевой соли L-глутамил-L-триптофана, пик t=1,552 мин, соответствующий аминоуксусной кислоте и пик t= 4,644 мин, соответствующий пироглутамил-триптофану и занимающий 4% площади хроматограммы.

Исследуемый раствор был подвергнут искусственному старению при 60^oC. На фиг. 4 представлена хроматограмма композиции после 10 ч выдержки при 60^oC; на фиг. 5 - после 30 ч выдержки; на фиг. 6 - после 69 ч; на фиг. 7 - после 17 суток выдержки при 60^oC, что соответствует примерно 3 годам выдержки при комнатной температуре, на фиг. 8 - после 35 суток выдержки при 60^oC, что соответствует 5 годам выдержки при комнатной температуре. Как видно на фиг 4-7, площадь хроматограммы, занимаемая пиком пироглутамил-триптофана, за 5 лет выдержки не превышает 5,76%, через 3 года хранения - 4,76% площади. Таким образом, за 3 года количество пироглутамил-триптофана в композиции, содержавшей аминокусусную кислоту, практически не увеличилось.

Для сравнения иммуномодулирующей активности заявляемой композиции с активностью L-глутамил-L-триптофана основания и его мононатриевой соли исследовали in vitro их влияние на метаболическую активность по уровню зеленой (флавиновые ферменты) и красной (пиридиновые ферменты) аутолюминесценции лимфоцитов периферической крови, индуцированной ультрафиолетовым лазером. Исследования проведены на лимфоцитах здорового человека. Облучение лимфоцитов и регистрацию результатов производили на проточном цитофлюориметре Faxscan фирмы Becton-Dickinson по стандартному протоколу фирмы. Доза препаратов в пересчете на L-глутамил-L-триптофан составляла 3.3 мкг на 1 мл суспензии лимфоцитов, содержавшей 10⁶ клеток/мл. Соотношение мононатриевая соль L-глутамил-L-триптофана : аминоуксусная кислота в изучаемой композиции составляло 1:100.

Результаты изучения представлены в табл. 1. Как видно из представленных данных, все исследованные препараты оказывают активирующий эффект на метаболическую активность лимфоцитов. Однако действие мононатриевой соли L-глутамил-L-триптофана и ее композиции с аминоуксусной кислотой существенной выше, чем у L-глутамил-L-триптофан основания. Эффект последнего сопоставим с результатами контроля, что, по-видимому, связано с существенно меньшей растворимостью основания.

Все препараты L-глутамил-L-триптофана оценивали также и по их способности экспрессировать мембранные рецепторы на поверхности лимфоцитов при инкубировании последних с препаратами при 37^oC в течение 15 мин. Использовали лимфоциты периферической крови человека, выделенные на градиенте плотности фиколл: верографин по стандартной методике (Иммунологические методы: Под ред. Г.Фримеля/Пер. с нем. М.: Медицина, 1987. С. 226). После 3-кратной отмывки лимфоциты ресуспендировали в среде 199 в концентрации 10⁶ клеток/мл. Суспензию клеток разливали в 4 пробирки по 1 мл в каждой. В пробирку N 1 добавляли L-глутамил-L-триптофан основание, в пробирку N 2 - L-глутамил-L-триптофана мононатриевую соль, в пробирку N 3 - L-глутамил-L-триптофана мононатриевую соль с аминоуксусной кислотой. В пробирку N 4 (контроль) - 0,1 мл изотонического раствора хлорида натрия. Препараты вносили в объеме 0,1 мл, содержавшем 3.3 мкг препарата в пересчете на чистый дипептид. После инкубирования с препаратами клетки осаждали на 3 стекла и окрашивали моноклональными антителами ОКТ3⁺, ОКТ4⁺, ОКТ8⁺, конъюгированными с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ). Мазки докрашивали этидия бромидом и просматривали в люминесцентном микроскопе. В мазке сосчитывали 100 клеток, среди которых определяли процент окрашенных моноклональными антителами соответствующей специфичности. Результаты представлены в табл. 2.

Как следует из табл. 2, инкубация лимфоцитов с мононатриевой солью L-глутамил-L-триптофана и его композицией с аминоуксусной кислотой сопровождается достоверно более высокой экспрессией мембранных рецепторов, что свидетельствует о наличии у этих препаратов отчетливого иммуномодулирующего эффекта. L-глутамил-L-триптофана основание также стимулировал экспрессию рецепторов, но наблюдавшийся эффект был значительно меньшим - различия по сравнению с контролем были, как правило, недостоверны при заданном уровне вероятности.

Таким образом, предлагаемая фармакологическая композиция, состоящая из мононатриевой соли L-глутамил-L-триптофана и аминоуксусной кислоты обладает существенным преимуществом, заключающимся в сохранении первичной структуры дипептида. Аминоуксусная кислота препятствует полимеризации L-глутамина и превращению его в пироглутамат. По показателям иммуномодулирующей активности фармакологическая композиция не отличается от мононатриевой соли L-глутамил-L-триптофана и значительно превосходит активность L-глутамил-L-триптофана основания.

Изобретение относится к медицине, к фармацевтическим препаратам на основе пептидов, а именно к фармацевтическим композициям на основе L-глутамил-L-триптофана. Изобретение заключается в том, что фармацевтическая композиция содержит мононатриевую соль L-глутамил-L-триптофана и аминоуксусную кислоту; сочетание компонентов в определенном соотношении обеспечивает получение лекарственного средства, хорошо растворимого в воде в качестве иммуностимулирующего средства. 8 ил., 2 табл.

Фармацевтическая композиция на основе мононатриевой соли L-глутамил-L-триптофана, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит аминоуксусную кислоту при следующем соотношении компонентов, мас.ч.:
Мононатриевая соль L-глутамил-L-триптофана - 1 - 3
Аминоуксусная кислота - 50 - 100