СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ ШЕЙКИ МАТКИ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ВИРУСОМ ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА, В ВИДЕ ВАГИНАЛЬНЫХ КАПСУЛ Российский патент 2012 года по МПК A61K39/385 A61K39/12 A61K9/48 

Изобретение относится к медицине, в частности к гинекологии, и может найти применение для лечения предраковых и раковых заболеваний шейки матки. В настоящее время можно считать доказанной роль ВПЧ в развитии остроконечных кондилом и цервикального рака. Оказалось, что в большинстве случаев во всем мире (65-77%) выявляются вирусы папилломы человека - ВПЧ 16/18 типов, относящихся к вирусам высокого онкогенного риска.

Распространение инфекции происходит преимущественно половым путем, достигая максимума инфицирования до 30 лет. Более 50% сексуально активного населения мира в течение жизни инфицируется вирусом папилломы человека, и это является «первичным» событием в патогенезе РШМ. Большинство случаев инфицирования заканчивается спонтанным выздоровлением. Однако в некоторых случаях развивается персистирующая инфекция, способная запускать механизмы клеточной трансформации эпителиальных клеток. Так при CIN 1 наблюдается активная репликация вируса и его бессимптомное выделение. Превращение CIN 1 в инвазивный рак происходит с большой частотой и, как правило, сопровождается интеграцией вирусной ДНК в геном клетки хозяина [Киселев В.И. (2004) Вирусы папилломы человека в развитии рака шейки матки. - М.: Компания «Димитрейд График Групп®»].

ВПЧ высокой степени онкогенного риска (преимущественно 16 и 18 типов) обнаруживают в 50-80% образцов умеренной и тяжелой дисплазии плоского эпителия шейки матки и в 90% инвазивного рака. Важным обстоятельством является то, что клинические проявления ВПЧ-инфекции не обнаруживаются достаточно длительное время, однако последствия персистенции вируса от этого не становятся более легкими. Развитие легкой и умеренной дисплазии в тяжелую происходит, соответственно, в 10 и 20% случаев.

В связи с простотой организации вирусного генома оказалось довольно сложно разработать лекарственное средство, избирательно ингибирующее репродукцию вируса. По этой причине основные усилия направлены на создание вакцинных препаратов, так как хорошо обоснована роль иммунитета в спонтанной регрессии клинических проявлений вирусной инфекции.

В патенте РФ №2229307 описана разработка вакцины на основе гибридных белков Е7 и Hsp 70 М.tuberculosis. Авторы описывают инъекционную лекарственную форму, с помощью которой удается добиться регрессии опухолей индуцированных вирусом на экспериментальных моделях с перевиваемыми опухолями. Продемонстрированная эффективность вакцинации на этих моделях подтверждает правильность выбора белка Е7 как молекулярной мишени, против которой индуцируются иммунные реакции.

В заявке на патент №2008146809 от 27.11.08 описана рекомбинантная композиция белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, соединенных с аминокислотной последовательностью белка теплового шока м.м. 70 кДа из М.tuberculosis в виде вагинальных суппозиториев. Недостатками данной композиции является использование масла какао и твердого жира типа А в качестве основы для суппозиториев, так как данные основы не стабильны при высоких температурах, дают метастабильные модификации и не могут быть использованы повторно на стадиях технологического процесса, что значительно повышает стоимость производства. Также в данной заявке не рассмотрены вопросы стабильности рекомбинантной композиции белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, соединенных с аминокислотной последовательностью белка теплового шока м.м. 70 кДа из М.tuberculosis в суппозиториях.

В патенте РФ 2377305 описаны мукозальные вакцины местного применения при заболеваниях, ассоциированных с вирусом папилломы человека, в том числе рака шейки матки. Отмечается, что вакцина в комплексе с хитозаном может использоваться в виде суппозиториев состава:

- раствор рекомбинантных белков, E716-Hsp 70, E718-Hsp 70;

- Хитозан со степенью деацетиллирования 86%;

- ПЭГ 1500;

- твердый жир типа А;

- витепсол HW;

- TRIS фирмы МР Biomedicals Inc. cat. 195605.

Данный источник не раскрывает конкретно капсульную форму, но близок по эффекту и составу, поэтому он может быть указан в качестве наиболее близкого аналога-прототипа.

Желатиновые капсулы для вагинального применения более перспективны по сравнению с суппозиториями с технологической, биофармацевтической и экономической точек зрения. Желатиновая оболочка предохраняет лекарственные вещества от воздействия факторов внешней среды. В частности, они выдерживают температуры более 40 градусов в отличие от свечей.

Высвобождение лекарственного вещества происходит быстрее и легче, чем у суппозиториев, так как под влиянием слабощелочной среды (рН 7,3-7,6) слизистых оболочек желатиновые оболочки набухают, и в таком состоянии даже слабого воздействия на них достаточно для ее разрыва и высвобождения содержимого. Количество лекарственного вещества в капсуле, оказывающее необходимый терапевтический эффект, может быть значительно выше, чем в суппозиториях.

Таким образом, производство вагинальных средств на основе белков в желатиновой оболочке позволяет значительно расширить ассортимент средств для лечения заболеваний шейки матки, ассоциированных с вирусом папилломы человека.

Задачей данного изобретения является создание средства, эффективного в применении, исключающего инъекционный путь введения как травматичный и небезопасный, а также обеспечивающего стабильность рекомбинантных белков, входящих в его состав, на протяжении длительного времени в различных климатических регионах.

Задача решается вагинальной мягкой желатиновой капсулой, которая содержит рекомбинантную композицию белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, соединенных с аминокислотной последовательностью белка теплового шока м.м. 70 кДа из М.tuberculosis, желатин, глицерин, моноглицериды дистиллированные, воду очищенную, хитозан со степенью деацетилирования 86%, лактозу, декстран 40000, консервант, масло растительное, при следующем сочетании компонентов на 1 капсулу, вес.ч.:

- Рекомбинантная композиция белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, соединенных с аминокислотной последовательностью белка теплового шока м.м. 70 кДа из:

М.tuberculosis 3,0-6,0 - Желатин 10,0-12,5 - Глицерин 20,0-30,0 - Моноглицериды дистиллированные 0,35-0,65 - Вода очищенная 30,6-36,0 - Хитозан со степенью деацетилирования 86% 18,0 - Лактоза 50,-100,0 - Декстран 40000 150,0-200,0 - Консервант 5,0-10,0 - Масло растительное до 1000

Желатин, глицерин и моноглицериды дистиллированные и вода очищенная используются для формирования оболочки капсулы. В заявленном соотношении они обеспечивают необходимую структурную целостность и эластичность оболочки. При изменении соотношения оболочка либо не формируется, либо время ее распадаемости превышает 30 минут.

Хитозан со степенью деацетилирования 86%, консервант, лактоза, декстран 40000 и масло растительное используются для формирования внутреннего содержимого капсулы. В заявленном соотношении они образуют суспензию с рекомбинантной композицией белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, соединенных с аминокислотной последовательностью белка теплового шока м.м. 70 кДа из М.tuberculosis, обладающую необходимой консистенцией для задержки рекомбинантной композиции белков на клетках слизистой влагалища в течение необходимого времени для проявления терапевтического эффекта.

Хитозан со степенью деацетилирования 86% способен усиливать абсорцию гидрофильных соединений, например белковых и пептидных лекарственных препаратов, на эпителии. Он увеличивает проницаемость апикальных клеточных мембран и перераспределяет белки цитоскелета вследствие своей катионной природы. Его взаимодействие с клеточной мембраной приводит к структурной реорганизации белков, связанных с плазматическими мембранами, что, в свою очередь, увеличивает проницаемость для лекарственных препаратов.

Кроме того, введение хитозана со степенью деацетилирования 86% в состав лекарственных препаратов с белковыми соединениями обеспечивает повышение их стабильности в лекарственной форме за счет образования комплекса между белком и хитозаном.

В качестве консерванта используют любые физиологически приемлемые консерванты, проявляющие антигрибковое и антибактериальное свойства. Предпочтительно в качестве консерванта могут быть использованы нипагин, нипазол, бензалконий хлорид и т.п.

В качестве растительного масла может быть использовано оливковое, подсолнечное, соевое и другие масла. Предпочтительно используется соевое масло. Капсулы готовят общепринятыми в фармации методами. Например, следующим образом.

Желатин в реакторе заливают водой (температура 15-18°С) на 1,5-2 часа, затем расплавляют его при t=45-75°С при перемешивании в течение 1 часа, добавляют глицерин, моноглицериды дистиллированные и воду, продолжая перемешивание еще 30 мин. Затем отключают обогрев и мешалку, оставляют массу в реакторе на 1,5-2 часа с подключением вакуума для удаления из массы пузырьков воздуха. Приготовленную массу передают в термостат и выдерживают при t=60°C для стабилизации 2,5-3 часа. Готовят суспензию рекомбинантной композицией белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, соединенных с аминокислотной последовательностью белка теплового шока м.м. 70 кДа из М.Tuberculosis, хитозана со степенью деацетилирования 86%, консерванта, лактозы, декстрана 40000 и масла растительного. Наполняют капсулы с помощью дозатора. Дозатор представляет собой поршневой насос с регулятором объема рабочего цилиндра и электронным регулятором паузы. При всасывающем ходе поршне дозатора жидкость попадает в шприц. При обратном ходе она выталкивается в резиновую трубку, которая заканчивается пипеткой, которую вводят в пустые оболочки. После наполнения желатиновые капсулы тотчас поступают на запайку. Проверяют качество запайки. Сушат капсулы в шкафу с принудительной циркуляцией воздуха при t=+23…+26°С в течение 20 часов. Шлифуют капсулы.

Предлагаемая лекарственная форма и соотношение действующих и вспомогательных веществ обеспечивают необходимое качество и эффективное терапевтическое действие, а также удобство применения.

Предлагаемые средства отвечают всем требованиям, предъявляемым к лекарственным формам: высокая биодоступность и стабильность активных ингредиентов, термо- и коллоидная стабильность, удобство применения.

Пример 1

Состав мягкой капсулы

- Рекомбинантная композиция белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, соединенных с аминокислотной последовательностью белка теплового шока м.м. 70 кДа из:

М.tuberculosis 4,0 - Желатин 10,0 - Глицерин 30,0 - Моноглицериды дистиллированные 0,65 - Вода очищенная 30,6 - Хитозан со степенью деацетилирования 86% 18,0 - Лактоза 70,0 - Декстран 40000 180,0 - Нипагин 7,0 - Масло соевое до 1000

Пример 2

Состав мягкой капсулы

- Рекомбинантная композиция белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, соединенных с аминокислотной последовательностью белка теплового шока м.м. 70 кДа из:

M.tuberculosis 6,0 - Желатин 12,5 - Глицерин 25,0 - Моноглицериды дистиллированные 0,55 - Вода очищенная 36,0 - Хитозан со степенью деацетилирования 86% 18,0 - Лактоза 100,0 - Декстран 40000 150,0 - Лимонная кислота 5,0 - Масло оливковое до 1000

Пример 3

Сравнительное исследование стабильности рекомбинантных белков Е7-16-Hsp и E7-18-Hsp

Определение содержания рекомбинантных белков проводили методом иммуноферментного анализа, описанного в статье «Разработка диагностической системы для определения онкобелков Е7 вируса папилломы человека 16-го и 18-го типов методом твердофазного иммуноферментного анализа» Киселев В.И., Солопова О.Н., Свешников П.Г и другие. Молекулярная медицина, 2010, №2, стр.52-57.

Стабильность рекомбинантных белков в различных лекарственных формах. Хранение при комнатной температуре Суппозитории Капсулы по примеру 1 Сроки измерений (дни) Е7-16 (мкг) Е7-18 (мкг) Е7-16 (мкг) Е7-18 (мкг) 250 250 250 250 1 154 120 250 250 14 110 70 210 200 30 60 40 180 160 60 50 35 100 90 90

Пример 4

Результаты фармакокинетических исследований

Исследования проведены на экспериментальных животных (кроликах) в соответствии с Каркищенко Н.Н., Хоронько В.В., Сергеева С.А. «Фармакокинетика», Ростов, 2001.

Было установлено, что максимальный уровень концентрации рекомбинантного белка E7-16-Hsp 70 (в пределах 180-250 нг/мл) в крови экспериментальных животных при интравагинальном введении достигается через час после интравагинального введения в дозе, соответствующей составу капсул по примеру 1, в то время как при инъекционном пути введения этот показатель составляет 0,5 часа при той же величине концентрации.

Длительность действия препарата в капсулах составляет около 10.5 часов. Данные фармакологических испытаний подтверждают сохранение фармакологических свойств активного начала. Состав может быть эффективно применен для лечения различных ассоциированных с вирусом папилломы человека заболеваний шейки матки, таких как дисплазия, рак шейки матки, кандиломы.

Изобретение относится к медицине, в частности к гинекологии, и может найти применение для лечения предраковых заболеваний шейки матки. Средство выполнено в виде вагинальных капсул, характеризующееся тем, что содержит рекомбинантную композицию белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, соединенных с аминокислотной последовательностью белка теплового шока м.м. 70 кДа из М.tuberculosis, желатин, глицерин, моноглицериды дистиллированные, воду очищенную, хитозан со степенью деацетилирования 86%, лактозу, декстран 40000, консервант, масло растительное. Средство более эффективно и стабильно при хранении. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Средство для лечения заболеваний шейки матки, ассоциированных с вирусом папилломы человека, в виде вагинальных капсул, характеризующееся тем, что содержит рекомбинантную композицию белков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, соединенных с аминокислотной последовательностью белка теплового шока м.м. 70 кДа из M.tuberculosis, желатин, глицерин, моноглицериды дистиллированные, воду очищенную, хитозан со степенью деацетилирования 86%, лактозу, декстран 40000, консервант, масло растительное при следующем сочетании компонентов на 1 капсулу, вес.ч.:
Рекомбинантная композиция белков Е7   вируса папилломы человека   16 и 18 типов, соединенных с аминокислотной   последовательностью белка теплового   шока м.м. 70 кДа из M.tuberculosis 3,0-6,0 Желатин 10,0-12,5 Глицерин 20,0-30,0 Моноглицериды дистиллированные 0,35-0,65 Вода очищенная 30,6-36,0 Хитозан со степенью деацетилирования 86% 18,0 Лактоза 50,-100,0 Декстран 40000 150,0-200,0 Консервант 5,0-10,0 Масло растительное До 1000

2. Средство по п.1, характеризующееся тем, что содержит в качестве растительного масла соевое масло.