ПРОИЗВОДНЫЕ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЯ, СОДЕРЖАЩИЕ АРОМАТИЧЕСКУЮ ДИАЗОГРУППУ Российский патент 2012 года по МПК C08G65/333 C08G65/332 C07C245/12 

Изобретение относится к области химии, в частности к новым производным монометоксиполиэтиленгликоля, содержащим ароматическую диазогруппу, и может быть использовано при создании новых конъюгатов биологически активных соединений.

Монометоксиполиэтиленгликоль (далее - мПЭГ) представляет собой нейтральный полиэфир с различной молекулярной массой, который применяется для модификации разнообразных полипептидов [Никитин И.Г. Пегилированные препараты: современное состояние проблемы и перспективы / И.Г.Никитин, Г.И.Сторожаков // Вирусные гепатиты, достижения перспективы. - 2001. - №3(13). - С 3-8].

Сам мПЭГ непосредственно с полипептидами не взаимодействует, поэтому к его молекуле «прикрепляют» различные функциональные группы, которые позволяют полимеру связываться с белком [Kozlowski A. Development of Pegylated hiterferons for the Treatment of Chronic Hepatitis С / A.Kozlowski, S.A. Charles, J. M.Harris // BioDrugs - 2001. - №15 (7). P 419-429].

К таким производным мПЭГ относятся мПЭГ-альдегиды [US 5990237], мПЭГ-карбонаты [US 5324844], активированные эфиры [US 5932462] и другие. Как правило, данные пегилирующие агенты взаимодействуют со свободными аминогруппами полипептидов, в результате чего образуется смесь позиционных изомеров, число которых равно количеству свободных аминогрупп в протеине [Блохин Н.П. Особенности фармакологической динамики и кинетики пегилированного α-интерферона (40 kDa) «Пегасис»: новые возможности терапии хронического гепатита C /Н.П.Блохин, И.Г.Никитин // Материалы VII Российской конференции «Гепатология сегодня» РЖГГК, - 2002. - 6].

Поскольку позиционные изомеры протеинов имеют различную биологическую активность [Foser S. Isolation, structural characterization, and antiviral activity of positional isomers of monopegylated interferon alpha-2a (PEGASYS) / S.Foser, A.Schacher A, K.A.Weyer, D.Brugger, E.Dietel, S.Marti, T.Schreitmuller // Protein Expr Purif. - 2003 Jul; - 30 (1), - P.78-87], весьма актуальным становится расширение арсенала пегилирующих агентов, не затрагивающих аминогруппы полипептидов, что позволяет не только изменить места и способы прикрепления полимера к белку, а следовательно, получить новые конъюгаты, но и изменить количество и соотношение позиционных изомеров.

Наиболее близким аналогом изобретения по данной заявке являются пегилирующие агенты по патенту RU 2288212 (C07C 47/12, 2003), которые представляют собой альдегидные производные полиэтиленгликоля. Указанные пегилирующие агенты взаимодействуют с аминогруппами полипептидов.

Задачей данного изобретения является создание новых пегилирующих агентов, взаимодействующих с полипептидами преимущественно по аминокислотным остаткам тирозина и гистидина.

Целью изобретения являются пегилирующие агенты, содержащие ароматическую диазогруппу.

Указанная цель достигается использованием в качестве пегилирующих агентов предварительно диазотированных мПЭГ-эфиров или мПЭГ-амидов аминобензойных кислот с молекулярной массой от 20000 до 50000 Д и общей структурой:

,

где X - O или NH;

n - целое число в интервале от 455 до 1140.

Предложенные пегилирующие агенты взаимодействуют в слабощелочных средах преимущественно с тирозиновыми и гистидиновыми аминокислотными фрагментами полипептидов с образованием азогруппы. В результате образуется хромофор, поглощающий в видимой и ближней УФ-области электронного спектра и сообщающий окраску целевому конъюгату.

Пример 1. Диазотирование ароматической аминогруппы

Соответствующий мПЭГ-эфир или мПЭГ-амид аминобензойной кислоты с молекулярной массой от 20000 до 50000 Д растворяли при охлаждении в разбавленной HBr и приливали избыток раствора NaNO₂. По завершении диазотирования, избыток нитрита удаляли мочевиной и полученный бесцветный раствор мПЭГ-диазония ex tempore использовали для модификации пептидов.

Характеристика мПЭГ-диазония

А) Электронные спектры мПЭГ-диазония в 0,1 М растворе HCl относительно растворов нитрита натрия (1) и недиазотированного ПЭГ-амина (2) в 0,1 М HCl приведены на фиг.1.

Б) мПЭГ-диазоний взаимодействует в щелочной среде с гистидином (желтое окрашивание) и тирозином (красное окрашивание, переходящее при подкислении в желто-оранжевое) с образованием окрашенных соединений. На фиг.2 приведены электронные спектры продуктов азосочетания мПЭГ-диазония с гистидином (1) и тирозином (2) в 0,1 М Na₂CO₃.

Таким образом, мПЭГ-диазоний взаимодействует с гистидином и тирозином с образованием окрашенных азосоединений.

Пример 2. Пегилирование полипептидов на примере интерферона α-2b.

К охлажденному раствору интерферона α-2b в боратном буфере приливали избыток пегилирующего агента. Процесс пегилирования контролируют обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Пегилирование останавливали добавлением избытка тирозина, после чего немодифицированный интерферон и интерфероны с разной степенью пегилирования разделяли с помощью ионообменной или гель-фильтрационной хроматографии. Электронный спектр пегилированного интерферона приведен на фиг.3.

Из указанного спектра видно, что полученный конъюгат мПЭГ с интерфероном содержал:

- хромофор, образовавшийся в результате азосочетания мПЭГ-диазония с полипептидом и поглощавщий в видимой и ближней УФ-области электронного спектра (20000-34000 см^-1);

- ароматические фрагменты (35000-40000 см^-1), в том числе аминокислотные остатки триптофана, фенилаланина и тирозина, принадлежавщие белковой части конъюгата;

- полиэфирные и полипептидные связи, совместно поглощающие в области 45000-50000 см^-1 и, соответственно, принадлежавщие полимерному и белковому фрагментам конъюгата.

Изобретение относится к пегилирующему агенту, содержащему ароматическую диазогруппу и имеющему следующую общую структуру:

,

где Х - О или NH; n - целое число в интервале от 455 до 1140. Технический результат: получен новый пегилирующий агент, который связывается с полипептидами посредством азогруппы, в результате чего образуется ковалентный конъюгат, поглощающий в видимой и ближней УФ-области электронного спектра. 3 ил.

Пегилирующие агенты, содержащие ароматическую диазогруппу, представляющие собой диазотированные метоксиполиэтиленгликолевые эфиры или амиды аминобензойных кислот с молекулярной массой от 20000 до 50000 Да и с общей формулой
,
где Х - О или NH;
n - целое число от 455 до 1140.