СПОСОБ КОЛОРИМЕТРИЧЕСКОГО ДЕТЕКТИРОВАНИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КАТИОННЫХ ЗОЛОТЫХ НАНОСФЕР Российский патент 2012 года по МПК C12Q1/00 B82B3/00 B82B1/00 

Изобретение относится к области биотехнологии и биомедицинской генодиагностики и может быть использовано для обнаружения олигонуклеотидов с использованием катионных золотых наносфер.

В настоящее время известно достаточно много колориметрических методов детекции олигонуклеотидов-мишеней с использованием золотых наночастиц в качестве оптических меток. Сущность метода состоит в регистрации изменения оптического сигнала системы (по спектрам экстинкции) в результате биоспецифической гибридизации ДНК-ДНК. Схема детектирования может быть построена на механизме перекрестных (см. патент US №7259252, МПК C07H 21/00; US №7250499, МПК C07B 61/00) или неперекрестных (Sato, К.; Hosokawa, К.; Maeda, M. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 8102-8103; Doria, G.; Franco, R.; Baptista, P. IET Nanobiotechnol. 2007, 1, 53-57; Baptista, P.; Doria, G.; Henriques, D.; Pereira, E.; Franco, R. J. Biotechnol. 2005, 119, 111-117; Baptista, P.; Koziol-Montewka, M.; Paluch-Oles, J.; Doria, G.; Franco, R. Clin. Chem. 2006, 52, 1433-1434) сшивок зонд-мишень. В данных методах используются тиол-модифицированные олигонуклеотиды, прикрепленные к поверхности золотой наночастицы путем химической адсорбции.

Однако общим недостатком описанных выше методов является трудоемкость воспроизведения протокола на стадии синтеза коньюгатов золотых наночастиц и тиолированных олигонуклеотидов - зондов.

Известен способ колориметрического детектирования, в котором взаимодействие зонд-мишень осуществляется посредством электростатических взаимодействий между поверхностью наночастицы и молекул однонитевой ДНК (Li, H.; Rothberg, L. Anal. Chem. 2005, 77, 6229-6233) и не предполагает ковалентной модификации золотой наночастицы молекулами зонда. В результате солевой агрегации золотых наночастиц происходит изменение цвета раствора с красного на синий, что отражается в сдвиге максимума экстинкции плазменного резонанса в длинноволновую область. Методы основаны на использовании цитрат-стабилизированных гидрозолей золота со средним диаметром частиц 15 нм.

Недостатком указанного метода является наличие стадии приготовления гибридизационной смеси (зонд-мишень в буферно-солевом растворе), при этом стадия детекции протекает независимо от стадии гибридизации, что затрудняет мониторинг поведения системы.

Наиболее близким к предлагаемому решению является метод колориметрической детекции олигонуклеотидов с использованием золотых наностержней (Не, W.; Huang, C.Z.; Li, Y.F.; Xie, J.P.; Yang, R.G.; Zhou, P.F.; Wang, J. Anal. Chem. 2008, 80, 8424-8430).

Синтез золотых наностержней является трудоемким процессом, выход побочных продуктов синтеза влияет на воспроизводимость колориметрического теста.

Задачей настоящего решения является разработка колориметрической детекции олигонуклеотидов с применением катионных наносфер в качестве детектирующей платформы.

Техническим результатом является повышение чувствительности и воспроизводимости результатов при упрощении технологии.

Поставленная задача решается использованием ЦТАБ-стабилизированных (ЦТАБ - цетилтриметиламмонийбромид) золотых наносфер с варьирующим диаметром 15-30 нм в качестве меток. Данные метки являются катионными в отличие от анионных цитрат-стабилизированных золотых наносфер, это можно зарегистрировать при помощи измерения дзета-потенциала коллоида. Получение таких наночастиц не требует особых методик синтеза и является хорошо воспроизводимым протоколом, в отличие от использования наностержней. Данная детектирующая платформа была апробирована на моделях генной диагностики ВИЧ-1 и возбудителя сибирской язвы. Биоспецифическая гибридизация зонд-мишень приводит к изменению оптического сигнала системы, который может быть зарегистрирован визуально, спектрофотометрически или методом динамического рассеяния света.

Способ поясняется чертежами, на фиг.1 изображены спектры экстинкции (препарат - КЗ-15+ЦТАБ), на фиг.2 изображен средний диаметр КЗ-ЦТАБ и их агрегатов (метод динамического рассеяния света), где

1) препарат КЗ-15+ЦТАБ в буферно-солевом растворе (данные пробирки «1»);

2) зонд-модифицированный препарат КЗ-15+ЦТАБ (данные пробирки «2»);

3) КЗ-15+ЦТАБ после добавления комплементарной мишени (данные пробирки «3»).

Способ осуществляется следующим образом. Готовят гидрозоли золота с наночастицами среднего диаметра 15, 20 и 30 нм по методу Френса (Frens, G. Nature Phys. Sci. 1973, 241, 20-22). Затем смешивают полученный гидрозоль золота с 0.1 М раствором цетилтриметиламмонийбромида (ЦТАБ) в объемных отношениях 1:1. Синтетические олигонуклеотиды доводят до концентрации 100 нМ. Готовят буферно-солевой гибридизационный раствор на основе 50 мМ TRIS-HCl (TRIS - трис(гидроксиметил)метиламин) и 1.2 M NaCl.

Последовательно готовят следующие смеси при комнатной температуре в эппендорфах (пластиковые центрифужные пробирки) объемом 2 мл.

Условно обозначают пробирки как: 0, 1, 2, 3 и 4, золотые наночастицы - КЗ-ЦТАБ, Z-зондовая молекула (зонд), К+ - комплементарная мишень.

0 - КЗ-ЦТАБ (300 мкл)+вода (750 мкл);

1 - КЗ-ЦТАБ (300 мкл)+вода (450 мкл)+TRIS-HCl (50 мM, pH 7.4; 150 мкл)+NaCl (1.2 M; 150 мкл);

2 - КЗ-ЦТАБ (300 мкл)+вода (300 мкл)+TRIS-HCl (150 мкл)+NaCl (150 мкл)+Z (100 нM, 150 мкл);

3 - КЗ-ЦТАБ (300 мкл)+вода (150 мкл)+TRIS-HCl (150 мкл)+NaCl (150 мкл)+Z (150 мкл)+K+(100 нM, 150 мкл);

4 - КЗ-ЦТАБ (300 мкл)+вода (150 мкл)+TRIS-HCl (150 мкл)+NaCl (150 мкл)+Z (150 мкл)+Z (100 нM, 150 мкл).

Спектрофотометром Specord BS-250 (Analytik Jena, Германия) измеряют спектры экстинкции каждой смеси в диапазоне длин волн от 400-800 нм через 5 мин после приготовления. Через 30 мин регистрируют функцию распределения частиц по размерам методом динамического рассеяния света (Malvem Zetasizer Nano ZS instrument, Англия; Photocor, Россия). Как показали спектры смесей в пробирках «0-2 и 4» являются стабильными во времени и имеют розовый цвет, а смесь в пробирке «3» обесцветилась, что показывает образование агрегатов (слипание наночастиц в крупные кластеры) золотых наночастиц в результате биоспецифической гибридизации зонд-мишень.

В качестве КЗ-ЦТАБ могут быть использованы наночастицы размером от 15 до 30 нм, практика показывает, что наночастицы диаметром менее 15 нм имеют высокую удельную поверхность, что снижает чувствительность метода, а наночастицы диаметром более 30 нм склонны к агрегации в буферно-солевой среде (стадия «1»).

Данный способ был апробирован на моделях биоспецифических пар. В качестве биоспецифической модели авторы использовали 21-звенную комплементарную пару (Литех, Россия) олигонуклеотидов с последовательностью мишени, гомологичной участку генома вируса иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1), а также 23-звенную комплементарную пару (Синтол, Россия) олигонуклеотидов с последовательностью мишени, гомологичной участку генома Bacillus Anthracis (возбудителя сибирской язвы).

Разработанный способ может быть в дальнейшем апробирован на других моделях олигонуклеотидов.

Изобретение относится к области биотехнологии и биомедицинской генодиагностики. Предлагается способ колориметрической детекции олигонуклеотидов определенной последовательности с применением катионных наносфер в качестве детектирующей платформы. Способ предусматривает приготовление метки путем модификации золотых наносфер диаметром 15-30 нм 0,1 М раствором цетилтриметиламмонийбромида в объемных отношениях 1:1. Затем к полученной метке добавляют зонд - синтетитический олигонуклеотид, и исследуемый олигонуклеотид. Биоспецифическая гибридизация зонд-мишень приводит к изменению оптического сигнала системы, который может быть зарегистрирован визуально, спектрофотометрически или методом динамического рассеяния света. Данный способ обеспечивает повышение чувствительности и воспроизводимости результатов при упрощении технологии. 1 з.п., 2 ил.

1. Способ колориметрической детекции олигонуклеотидов, характеризующийся тем, что включает приготовление метки путем синтеза коллоидного раствора золотых наносфер диаметром 15-30 нм с последующей их модификацией катионным ПАВ, в качестве которого используют 0,1 М раствор цетилтриметиламмонийбромида в объемных отношениях 1:1, добавлением к полученной метке зонда - синтетического олигонуклеотида в буферно-солевой среде и использованием смеси в качестве нулевого контроля, приготовление исследуемого раствора метки с зондом, в который вводят исследуемый олигонуклеотид, приготовление негативного контроля - раствора метки с зондом, в который вводят некомплементарную мишень - олигонуклеотид, по изменению оптического сигнала исследуемого раствора по сравнению с контролем при регистрации спектров экстинкции и функции распределения по размерам судят о наличии комплементарного олигонуклеотида в исследуемом растворе.

2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что готовят два дополнительных контрольных раствора, один из которых представляет собой смесь метки с водой, а второй - метки в буферно-солевой среде.