КОМПОЗИТНЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ Российский патент 2012 года по МПК A61K49/18 A61K33/38 A61P35/00 B82B1/00 B82Y5/00 

Изобретение относится к нанотехнологии новых материалов, которые можно использовать в биомедицинской диагностике.

Известны многофункциональные наноструктуры для биомедициской диагностики на основе пористых наночастиц двуокиси кремния, содержащих порфирины (Shih-Hsun Cheng, Chia-Hung Lee, Meng-Chi Chen, Jeffrey S.Souris, Fan-Gang Tseng, Chung-Shi Yang, Chung-Yuan Мои, Chin-Tu Chen and Leu-Wei Lo. "Tri-functionalization of mesoporous silica nanoparticles for comprehensive cancer theranostics-the trio of imaging, targeting and therapy" // J.Mater. Chem. 2010. V.20. P.6149-6157). Недостатком этих частиц является отсутствие компонента с плазменным резонансом, который увеличивает диагностический и терапевтический потенциал наноструктур за счет использования резонансного рассеяния и поглощения света металлической частицей в составе композита.

Известны композитные наноструктуры, содержащие золотые наностержни, покрытые двуокисью кремния с включенными молекулами порфирина (Tingling Zhao, Hao Wu, Shao Q.Yao, Qing-Hua Xu, and Guo Qin Xu Nanocomposites Containing Gold Nanorods and Porphyrin-Doped Mesoporous Silica with Dual Capability of Two-Photon Imaging and Photosensitization // Langmuir 2010, V.26(18), P.14937-14942). Недостатками этих наночастиц являются: (1) потенциальная токсичность молекул цетилтриметламмония бромида (ЦТАБ), содержащихся на поверхности золотых наностержней; (2) несовместимость полос люминесценции обычного порфирина с полосой прозрачности биотканей.

Изобретение относится к нанотехнологии новых материалов, которые можно использовать в биологии, ветеринарии и медицине.

Задачей настоящего изобретения является создание нового класса композитных наночастиц, используемых в ранней люминесцентной диагностике злокачественных новообразований в комбинации с лазерной плазменной и фотодинамической диагностикой.

Техническим результатом настоящего изобретения является создание композитных наночастиц, сочетающих в себе плазменный резонанс в области прозрачности биотканей (760-1000 нм), флуоресценцию в видимой и ближней ИК-области, фотогенерацию синглетного кислорода, увеличенное (по сравнению с молекулярным фотодинамическим красителем) накопление в новообразованиях.

В предлагаемом решении предлагается использовать для диагностики и терапии злокачественных опухолей композитные наночастицы (наноструктуры), отличающиеся от известных тем, что они представляют собой золотосеребряные наноклетки, покрытые двуокисью кремния, которая функционализована 2,4-диметоксигематопорфирином иттербия.

Изобретение поясняется чертежами. На фиг.1 представлена схема синтеза предлагаемых наночастиц, синтеза композитных многофункциональных наночастиц на основе золотосеребряных наноклеток, покрытых двуокисью кремния и функционализованных 2,4-диметоксигематопорфирином иттербия (HP-Yb). Обозначения на схеме: EG-этиленгликоль, PVP-поливинилпирролидон, IPA-изопропиловый спирт, TEOS-тетраэтилортосиликат, APTES-3-аминопропилтриэтоксисилан, HP-Yb - 2,4-диметоксигематопорфирин иттербия, EDC-1-Этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид, DMSO-диметилсульфоксид. На фиг.2 приведены электронно-микроскопические изображения полученных композитных наночастиц с ядром из золотосеребряных наноклеток и пористой оболочкой из двуокиси кремния. На фиг 3 - спектры оптической плотности (2 мм кювете) композитных наночастиц до функционализации HP-Yb (кривая 1, концентрация частиц 2×10¹² частиц/мл), раствора HP-Yb с концентрацией 20 мкг/мл (2), конъюгатов композитных наночастиц с HP-Yb (3) и арифметическая сумма спектров 1 и 2 (кривая 4). На фиг.4 показаны кюветы с композитными флуоресцентными наночастицами (1, Au-Ag наноклетки + SiO₂ + HP-Yb), с композитными частицами без HP-Yb (2) и с раствором свободного Hp-Yb (3). Верхнее фото получено при освещении обычным белым светом, нижнее - при освещении ультрафиолетовой лампой.

Способ синтеза наночастиц заключается в следующем. На первом этапе синтезируются серебряные нанокубики размером 30-60 нм (40 нм в данном изобретении), которые используются далее как шаблоны для получения золотосеребряных наноклеток. На втором этапе на Au-Ag наноклетках формируется пористая нанооболочка из двуокиси кремния контролируемой толщины от 20 до 100 нм (около 40 нм в данном изобретении). На третьем этапе полученные частицы аминируются, функционализуются молекулами гематопорфирина иттербия и стабилизируются гуммиарабиком.

Реализация изобретения подтверждается следующим примером.

Используются следующие реактивы: нитрат серебра AgNO₃ (>99.9%, Aldrich, 20.913-9), золотохлористоводородная кислота (ЗХВК) (Sigma, 99.99%), этиленгликоль (EG) (99%, Aldrich, 293237; ЧДА, «Вектон», ГОСТ 10164-75), поливинилпирролидон (PVP) (M_w=55000, Sigma-Aldrich, 85.656-8), изопропиловый спирт (IPA) (ЧДА, «Вектон»), тетраэтилортосиликат (TEOS) (98%, Aldrich), 30% водный раствор аммиака (Aldrich), 3-аминопропилтриэтоксисилан (APTES) (98%, Sigma), ацетон (ЧДА, «Вектон»), этанол абсолютный (99.99%, Sharlau, 64-17-5), сульфид натрия нонагидрат Na₂S·9H₂O (ОСЧ, ГОСТ 2053-77), аргон сжиженный (99.99%), 1-Этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC) (Sigma), диметилсульфоксид (DMSO), кислота азотная (ХЧ, «Радиан», ГОСТ 4461-77), кислота соляная (ХЧ, «Радиан», ГОСТ 3118-77), вода MilliQ (18 мОМ/см, Millipore), гуммиарабик.

В качестве фотосенсибилизатора используется препарат Yb-DMHP IX (дикалиевая соль Yb-2,4-диметоксигематопорфирина IX), полученный согласно патенту РФ №2372099. Далее для краткости будем обозначать 2,4-диметоксигематопорфирин иттербия как НР-Yb.

- Этап 1 - синтез серебряных нанокубиков и золотосеребряных наноклеток

На первом этапе получали серебряные нанокубики со средним размером около 40 нм и узким распределением по размерам. Синтез Ag нанокубиков проводили по методу (Хлебцов Б.Н., Ханадеев В.А., Максимова И.Л., Терентюк Г.С., Хлебцов Н.Г. Серебряные нанокубики и золотые наноклетки: синтез, оптические и фототермические свойства // Российские нанотехнологии. 2010. Т.5, №7-8. С.54-62). Для этого 30 мл EG нагревали до 150 С в течении 50 минут. Добавляли последовательно под током аргона 0.35 мл 0.3 мМ раствора сульфида натрия в EG, 7.5 мл раствора PVP в EG с концентрацией 20 мг/мл, 2.5 мл раствора нитрата серебра в EG с концентрацией 48 мг/мл. Время реакции 18-20 минут. Реакция останавливалась добавлением 60 мл ацетона. Частицы центрифугировались 30 мин при 10000 g и перерастворялись в 40 мл этанола. В результате получали суспензию серебряных нанокубиков со средним размером 41±5 нм. Концентрация серебра около 1.25 мг/мл, концентрация частиц 2.2*10¹² шт/мл, оптическая плотность в максимуме (на 440 нм) 220.

Синтез золотосеребряных наноклеток проводили по методу гальванического замещения (Sun Y., Xia Y. Alloying and Dealloying Processes Involved in the Preparation of Metal Nanoshells through a Galvanic Replacement Reaction // Nano Lett. - 2003 - V.3. P.1569-1572). Готовили 1% раствор золотохлористоводородной кислоты (100 мг на 10 мл воды) и разводили его в 30 раз (финальная концентрация 1 мМ). На магнитной мешалке к 100 мл раствора PVP (1 мг/мл) добавляли 2 мл серебряных кубиков и нагревали смесь до 100°С. Далее дробно по 100 мкл добавляли 10 мл 1 мМ золотохлористоводородной кислоты. Цвет раствора изменялся от желтого до синего, при этом плазмонный резонанс экстинкции смещался до 770 нм.

Полученную суспензию остужали до комнатной температуры и добавляли 0.7 мл 30% аммиака. Плазмонный резонанс экстинкции смещался до 745 нм. Далее частицы 3 раза центрифугировали при 10000 g 30 минут и перерастворяли в воде. В конце отмывки частицы растворяли в 4 мл воды.

- Этап 2 - покрытие наноклеток оксидом кремния

К 4 мл суспензии наноклеток в воде добавляли 18 мл изопропилового спирта. На мешалке при комнатной температуре добавляли 0.5 мл аммиака и 50 мкл TEOS. Время реакции гидролиза 50 минут. Далее частицы 5 раз центрифугировали при 5000 g 10 минут и перерастворяли в этаноле. Финальный объем образца равен 10 мл. Толщина слоя оксида кремния может варьироваться от 20 до 100 нм изменением параметров синтеза.

- Этап 3 - функционализация наночастиц 2.4-диметоксигематопорфирином иттербия

Сначала проводили аминирование оболочки из оксида кремния, для чего к 10 мл суспензии наночастиц в этаноле добавляли 50 мкл APTES и выдерживали при 70°С 1 час. Частицы выпадали в осадок. Осадок центрифугировали при 2000 g 5 минут и перерастворяли в 10 мл воды. Для функционализации композитных наночастиц 2,4-диметоксигематопорфирином иттербия суспензию еще раз центрифугировали и к осадку добавляли 10 мл водного раствора Hp-Yb с концентрацией 200 мкг/мл. Ресуспендировали осадок ультразвуком. Для ковалентной сшивки карбоксилов гематопорфирина и аминов на частицах добавляли 1 мл раствора EDC в DMSO с концентрацией 1 мг/мл. Время реакции 2 часа. Затем центрифугировали суспензию при 5000 g 10 минут и перерастворяли в 10 мл воды. Отмывку проводили 5 раз. Для стабилизации полученных наночастиц добавляли 100 мкг гуммиарабика с концентрацией 2 мг/мл. Для оценки концентрации HP-Yb в конъюгатах была построена калибровочная кривая по максимуму поглощения при 400 нм. Согласно спектральным оценкам с одной композитной наночастицей связывалось около 70000 молекул HP-Yb.

Доказательство успешной реализации предлагаемого решения дано на фиг.2, где приведены ТЭМ (трансмисионная электронная микроскопия) изображения композитных наночастиц. В отличие от спектра 1 суспензии наноклеток с силикатной оболочкой, спектр 3 конъюгатов с HP-Yb после нескольких отмывок имеет характерный пик на 400 нм, совпадающий по положению с пиком свободного 2,4-диметоксигематопорфирином иттербия. Наконец, при освещении белым светом (в вверху) первые две кюветы имеют примерно одинаковый зелено-голубой цвет, а в кювете 3 с раствором HP-Yb наблюдается слабая розоватая окраска за счет селективного поглощения белого света. При освещении УФ лампой (нижнее фото) хорошо видна люминесценция в первой и третей кювете, в то время как суспензия самих композитных наночастиц без 2,4-диметоксигематопорфирина не изменила своего цвета.

Доказательство возможности фотогенерации синглетного кислорода с помощью полученных композитных наночастиц дано на фиг.5, где приведены данные относительной генерации синглетного кислорода раствором 2,4-диметоксигематопорфирином иттербия (В) в концентрации 20 мг/л и полученных наночастиц (А) (концентрация 2,4-диметоксигематопорфирина иттербия 20 мг/л) при облучении светом длиной волны 625 нм. Использована модель детекции фотогенерации синглетного кислорода по степени оксигенации гемоглобина, как описано в работах (Stratonnikov A.A., Douplik A.Yu., et al. Oxygen consumption and photobleaching in whole blood incubated with photosensitizer induced by laser irradiation. // J. Laser Physic. 2003. V.13. No.1. P.1-21. Stratonnikov A.A., EdinakN.E., Klimov D.V., at all. // Proc. SPIE. Int. Soc. Opt. Eng. 1996. V.49. P.2924.).

Доказательством улучшенной фармакокинетики препарата являются данные фиг.6 и фиг.7, на которых представлены сравнительные результаты по биораспределению чистого препарата HP-Yb и композитных наночастиц, функционализованных HP-Yb.

Для сравнительных экспериментов по биораспределению чистого препарата HP-Yb использовали мышей линии Balb/c с привитой карциномой Эрлиха. Водные растворы HP-Yb и композитных наночастиц с HP-Yb вводились в хвостовую вену. Для препарата HP-Yb вводимая доза была 0.1 мг/кг животного, конъюгаты наночастиц вводились в концентрации 4×10¹⁰ шт/мл, что соответствовало концентрации связанного HP-Yb примерно 10 мкг/мл. Через 20 часов после введения препаратов на люминесцентный анализ были взяты образцы тканей опухоли, печени, селезенки, мышцы и кожи. Интегральная интенсивность люминесценции образцов оценивалась с помощью прототипа онкофлуориметра. Облучали образцы биотканей, расположенные в 96-луночном планшете с низким уровнем собственного люминесцентного фона и диаметром лунки 6 мм. Проводили сканирование каждого образца, помещенного в отдельную лунку, волоконно-оптическим зондом по одной координате со скоростью 0.2 мм/сек. Интегральную интенсивность в интервале 900-1100 нм оценивали как нормированный средний сигнал вдоль кривой сканирования.

Наличие ИК-люминесценции в спектральной области 900-1060 нм (фиг.6), соответствующей окну прозрачности биотканей, позволяет оценивать люминесценцию образцов тканей, суспензий гомогенатов и даже в экспериментах in vivo. На фиг.7 представлены средние интегральные интенсивности ИК-люминесценции (900-1060 нм) образцов тканей мыши с привитой опухолью. Измерения проведены через 20 часов после введения препаратов чистого HP-Yb (А) и конъюгатов композитных наночастиц с HP-Yb (В). Цифрами на оси абсцисс обозначены опухоль (1), печень (2), селезенка (3), мышца (4) и кожа (5). Бары показывают ошибку измерений. Из фиг.7 видно, что биораспределение обоих препаратов имеет сходный характер с хорошим контрастом накопления в опухоли, при этом накопление конъюгатов превышает накопление раствора HP-Yb на 15-20%. Отличительные признаки предлагаемого решения обеспечивают следующие преимущества.

- Золотосеребряные наноклетки имеют плазменный резонанс в области спектральной прозрачности биотканей (750-1000 нм) и не содержат токсичных молекул ЦТАБ (цетилтриметиламмонийбромид), что обеспечивает меньшую токсичность препарата и лучшую биосовместимость.

- Молекулы 2,4-диметоксигематопорфирина имеют уникальную полосу люминесценции в ближней ИК-области спектра (900-1050 нм), где нет фоновой автолюминесценции биотканей, что позволяет детектировать композитные наночастицы в биоткани.

Изобретение относится к композитным наноструктурам, пригодным для фотодинамической диагностики злокачественных опухолей. Заявленные наноструктуры представляют собой золотосеребряные наноклетки, покрытые оболочкой из двуокиси кремния, которая сформирована путем гидролиза тетраэтилортосиликата в спиртовой среде. При этом поверхность оболочки из двуокиси кремния функционализирована 2,4-диметоксигематопорфирином иттербия. Технический результат заявленного изобретения заключается в создании композитных наночастиц, сочетающих в себе плазменный резонанс в области прозрачности биотканей (760-1000 нм), флуоресценцию в видимой и ближней ИК-области, фотогенерацию синглетного кислорода, увеличенное накопление в новообразованиях. 7 ил.

Композитные наноструктуры для фотодинамической диагностики злокачественных опухолей, отличающиеся тем, что они представляют собой золото-серебряные наноклетки, покрытые оболочкой из двуокиси кремния, сформированной путем гидролиза тетраэтилортосиликата в спиртовой среде, поверхность которой функционализована 2,4-диметоксигематопорфирином иттербия.