СПОСОБ РЕГУЛЯЦИИ ИММУНОГЕННОСТИ АНТИГЕНА Российский патент 2012 года по МПК A61K39/39 C07H3/06 C07H15/24 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно иммунологии; предлагается способ регуляции иммунного ответа на белковый антиген, встроенный в структуру иммуностимулирующего комплекса.

Создание нового поколения высокоэффективных вакцин связано с использованием изолированных антигенов, способных обеспечить сильный высокоспецифический иммунный ответ к бактериальным, вирусным патогенам и опухолевым клеткам и устранить нежелательные побочные эффекты. Для этой цели, как правило, используются белковые антигены, которые в отличие от антигенов на основе углеводов, индуцируют в организме долговременный иммунитет. Антигены, иммобилизированные на липидных носителях, обладают высокой иммунологической активностью, а сами носители - биодеградируемостью и отсутствием собственной иммуногенности.

Известны иммуностимулирующие ТИ-комплексы, объединяющие систему доставки антигенов и природных медиаторов на основе липидов из морских гидробионтов. Эти комплексы имеют ультрамикроскопическую тубулярную структуру, представленную тубулами с диаметром поперечного сечения около 40 нм, и состоят из тритерпенового гликозида кукумариозида A₂-2 (КД) из Cucumaria japonica, холестерина и моногалактозилдиацилглицерола (МГДГ) из морских макрофитов, взятых в соотношении 3:2:6 [пат. РФ №2311926, опубл. 10.12.2007 г., пат. РФ №2319506, опубл. 20.03.2008 г.]. В условиях экспериментальной иммунизации мышей этот комплекс с антигеном в виде мономерной формы порина из Yersinia pseudotuberculosis показал много меньшую токсичность адъювантных носителей антигена для вакцин нового поколения, основанных на принципиально новых, биологически активных компонентах из морских организмов.

Задача заявляемого изобретения - найти новый способ, позволяющий влиять на иммунный ответ белкового антигена, встроенного в ТИ-комплекс полученный на основе тритерпенового гликозида кукумариозида А₂-2 (КД) из Cucumaria japonica, холестерина и моногалактозилдиацилглицерола (МГДГ) из морских макрофитов при их весовом соотношении, равном 6:2:4.

Поставленная задача оптимальным образом решается регуляцией иммунногенности белкового антигена (тримера порина) из Yersinia pseudotuberculosis (YOmpF), инкорпорированного в ТИ-комплексы, использованием МГДГ с различным составом жирных кислот, выделенного из разных видов морских макрофитов.

Впервые обнаружено, что изменение состава жирных кислот липидного окружения антигена, встроенного в структуру ТИ-комплекса, способно обеспечить оптимальное изменение конформации белкового антигена и тем самым максимально способствовать усилению его иммунного ответа; впервые установлен механизм этого процесса.

Техническим результатом при решении поставленной задачи является расширение сырьевой базы для получения МГДГ, а в последствии - и ТИ-комплексов, зарекомендовавших себя в качестве носителя антигенов.

Исследование вклада биологически активных гликолипидов из морских гидробионтов в конформационные изменения и иммуногенность антигенов, инкорпорированных в структуру нетоксичных иммуностимулирующих комплексов - ТИ-комплексов, полученных ранее авторами заявляемого изобретения, а также исследование шаперонных свойств липидного окружения в зависимости от его физико-химических свойств для модуляции иммуногенных свойств белкового антигена - важные проблемы современной мембранологии и иммунологии. Оценка способа регуляции иммунногенности белкового антигена, инкорпорированного в ТИ-комплексы в рамках настоящей заявки, проводилась на примере максимально однородного и хорошо воспроизводимого иммуностимулирующего ТИ-комплекса, состоящего из смеси тритерпеновых гликозидов кукумариозида А₂-2 (КД), холестерина и полярного липида моногалактозилдиацилглицерида (МГДГ) из морских макрофитов, взятых в весовом соотношении 6:2:4. В результате экспериментальных исследований выявлено, что такое соотношение исходных компонентов при получении ТИ-комплекса обеспечивает наиболее эффективное формирование тубулярных наночастиц, являющихся носителями антигенов. К полученному ТИ-комплексу добавляют тример порина в фосфатно-солевом буферном растворе (pH 7,2) в дозах, соответствующих 0,1 мкг белка на 1 мкг содержания КД.

Известно, что МГДГ из различных по таксономическому положению морских макрофитов имеют различный по степени ненасыщенности жирнокислотный состав, что в определенной степени может определять различную биологическую активность МГДГ. Согласно известным данным, полиненасыщенные жирные кислоты омега-3 и омега-6 рядов в свободном виде обладают различным иммуномодулирующим действием, оказывая влияние на активацию Т-хелперов 1 и 2 класса, стимулируют Т-клеточную пролиферацию и образование цитокинов, влияют на состояние мембран клеток иммунной системы, в частности макрофагов [Calder P.C. Polyunsaturated fatty acids and inflammatory processes: New twists in an old tale. Biochimie. 2009. 91(6):791-5].

Известно также, что МГДГ из разных источников не влияет на структуру ТИ-комплексов, но проявляет самостоятельную иммуноадъювантную активность.

Возможность регуляции иммуностимулирующего эффекта ТИ-комплексов, в которые встроены белковые антигены, путем изменения жирнокислотного состава МГДГ и связанного с этим изменением конформации белкового антигена является новой функцией МГДГ, которая не вытекает с очевидностью из известных для них свойств.

Это было доказано экспериментальным путем: формированием ТИ-комплекса без антигена и ТИ-комплекса на основе МГДГ с различным жирнокислотным составом, в структуру которого введен антиген - тример порина из Yersinia pseudotuberculosis (YOmpF) /примеры 1-5/ при использовании МГДГ, выделенных из следующих морских макрофитов: Ulva fenestrata (отдел зеленые водоросли - Chlorophyta) /пример 1/, Ahnfeltia tobuchiensis (отдел красные водоросли - Rhodophyta) /пример 2/, Laminaria japonica (отдел бурые водоросли - Phaeophyta) /пример 3/, Sargassum pallidum (отдел бурые водоросли - Phaeophyta) /пример 4/, Zostera marina (морская трава - отдел Magnoliophyta) /пример 5/.

Показатели специфического гуморального иммунного ответа (уровень антипориновых антител в сыворотке крови животных) были дополнены цитокиновым профилем развивающегося иммунного ответа и жирнокислотным составом МГДГ используемых в эксперименте макрофитов.

На фиг.1 показано содержание антипориновых антител в сыворотке крови мышей при двукратной иммунизации свободным порином YOmpF (тримерная форма) и в составе ТИ-комплексов в дозе 0,1 мкг/мышь (через 14 сут после первой иммунизации). В экспериментах использован подкожный способ введения препаратов. По оси ординат - показатели содержания специфических антипориновых антител, определенных методом иммуноферментного анализа и выраженных в единицах оптической плотности при длине волны 490 нм (разведение сыворотки крови 1/100). По оси абсцисс - экспериментальные группы животных, иммунизированных тримером порина (ТП) в свободном виде или в составе ТИ-комплексов: ТИ(лам) - ТИ-комплексом, содержащим МГДГ из L. japonica, ТИ(анф) - ТИ-комплексом, содержащим МГДГ из A. tobuchiensis, ТИ(зост) - ТИ-комплексом, содержащим МГДГ из Z. marina, ТИ(сарг) - ТИ-комплексом, содержащим МГДГ из S. pallidum, ТИ(ульва) - ТИ-комплексом, содержащим МГДГ из U. fenestrata. Иммуностимулирующий эффект определяют по повышению уровня антипориновых антител, что является главным показателем свойств адъюванта. Порин в изолированной форме проявляет умеренно выраженную иммуногенность. ТИ-комплексы обеспечивают значительный адъювантный эффект в отношении порина. Уровень антипориновых антител увеличивается в 1.2-4 раза в зависимости от жирнокислотного состава МГДГ (p<0.05). Наибольший Иммуностимулирующий эффект отмечен в случае применения МГДГ из U. fenestrata и S. pallidum. Адъювантный эффект менее выражен при применении МГДГ из A. tobuchiensis и Z. marina и практически отсутствует у ТИ-комплексов с МГДГ из L. japonica.

Для характеристики адъювантных свойств МГДГ из разных видов морских макрофитов представляет интерес его способность изменять не только иммуностимулирующий эффект, но и тип развивающегося иммунного ответа, что может выражаться в изменении профиля цитокинов, вырабатываемых разными субпопуляциями Т-хелперов. На фиг.2 показано содержание цитокинов в сыворотке крови мышей линии BALB/c, иммунизированных свободным порином YOmpF (тримерная форма) и в составе ТИ-комплексов в дозе 0,1 мкг/мышь двукратно с интервалом в 7 дней (через 20 дней после первой иммунизации). По оси ординат - содержание цитокинов, определенное методом иммуноферментного анализа и выраженное в единицах оптической плотности при длине волны 450 нм. По оси абсцисс - экспериментальные группы животных, иммунизированные тримерным порином (ТП) в свободной форме и в составе ТИ-комплесов: ТИ(лам) - ТИ-комплексов, содержащих МГДГ из L. japonica, ТИ(анф) - ТИ-комплексов, содержащих МГДГ из A. tobuchiensis, ТИ(зост) - ТИ-комплексов, содержащих МГДГ из Z. marina, ТИ(сарг) - ТИ-комплексов, содержащих МГДГ из S. pallidum, ТИ(ульва) - ТИ-комплексов, содержащих МГДГ из U. fenestrata.

Иммунотоксичность дозы в 0,1 мкг тримерного порина на мышь отсутствует при наличии иммуногенности. Анализ системы цитокинов позволяет говорить об отсутствии признаков хронического раздражения иммунной системы: нет воспалительной стимуляции. Уровни GM-CSF свидетельствуют о меньшем риске возникновения осложнений вакцинального процесса при применении вакцинных комбинаций на основе ТИ-комплексов. Различия по содержанию цитокинов в сыворотке крови животных, иммунизированных порином в составе ТИ-комплексов с МГДГ из разных видов морских макрофитов, наиболее выражены по IL-12, стимулирующим дифференцировку Тх-клеток в Тх1-клетки, и в меньшей степени по стимулирующим гуморальный иммунный ответ IL-4, IL-6 и IL-10, синтезируемым Тх2-клетками.

Примерно одинаковые показатели специфического гуморального иммунного ответа в группах животных, иммунизированных ТИ-комплексами с МГДГ из U. fenestrata и S. pallidum (фиг.1) при имеющихся различиях в цитокиновом спектре (фиг.2), подтверждают наличие различных цитокиновых механизмов регуляции иммунного ответа в данных группах животных. В случае применения МГДГ из S. pallidum имеется связь с ростом IL-4. Тогда как в случае МГДГ из U. fenestrata подобной связи с приростом IL-4 не выявляется, и активация гуморального звена иммунного ответа носит опосредованный характер, в частности, через активацию провоспалительного цитокина IL-12.

МГДГ способен влиять на иммунные реакции за счет метаболитов полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) МГДГ. ПНЖК являются предшественниками разных оксилипинов, стимулирующих синтез цитокинов, которые обладают иммуномодулирующим действием, оказывая влияние на активность Т-хелперов 1 и 2 класса, стимулируя Т-клеточную пролиферацию, и обладают избирательной цитотоксичностью в отношении опухолевых клеток. Обнаружено, что особенности жирнокислотного состава МГДГ, включенного в структуру ТИ-комплекса, напрямую влияют на способность этих комплексов усиливать специфический гуморальный иммунный ответ и влиять на цитокиновый профиль, что в значительной степени подтверждается данными, приведенными в табл.1, в которой представлен состав жирных кислот препаратов МГДГ, использованных в заявляемом изобретении.

Таблица 1 Жирнокислотный состав моногалактозилдиацилглицеролов из морских макрофитов, взятых в летний период (% от суммы жирных кислот) Жирные кислоты Laminaria japonica Ahnfeltia tobuchiensis Zoster marina Sargassum pallidum Ulva fenestrata 14:0 5.0 0.4 - 3.7 - 16:0 5.5 10.5 5.8 13.2 1.1 16:1 4.0 1.4 1.6 3.2 0.3 16:4n-3 - - - 0.3 43.7 16:2 - - 2.5 - - 16:3n-3 - - 15.0 - - 17:0 - 1.0 - 1.4 - 18:0 0.5 0.9 1.1 1.6 0.2 18:1n-9 9.6 8.1 3.1 6.0 - 18:1n-7 - 1.5 - - 1.8 18:2n-6 11.1 0.6 10.0 16.3 2.1 18:3n-6 8.0 - - 1.6 0.3 18:3n-3 8.7 - 58.8 5.1 24.1 18:4n-3 20.3 - - 7.1 24.3 20:3n-6 - 0.6 - 6.0 - 20:4n-6 9.9 36.8 - 15.6 - 20:5n-3 15.9 36.8 1.2 12.6 - НЖК 11.5 13 7.7 21.0 1.3 МНЖК 14.0 11 4.7 11.3 2.5 ПНЖК 74.5 76 87.6 67.7 96.2 ИН 387 347 258 248 357 Насыщ./ненасыщ. 0.13 0.15 0.08 0.27 0.01 С₁₈ПНЖК 48.1 0.6 68.8 30.1 50.8 С₂₀ПНЖК 25.8 74.2 1.2 35.4 Сл. n-3 ПНЖК 44.9 36.8 75 25.9 93.1 n-6 ПНЖК 29 38.0 10.0 40.2 2.4 n-3/n-6 1.55 0.97 7.5 0.64 38.75 ЖК - жирная кислота, НЖК - сумма насыщенных жирных кислот, МНЖК - сумма мононенасыщенных жирных кислот, ПНЖК - сумма полиненасыщенных жирных кислот, ИН - индекс ненасыщенности жирных кислот, насыщ./ненасыщ. - отношение суммы насыщенных жирных кислот к сумме ненасыщенных жирных кислот, n-3/n-6 - соотношение между n-3 и n-6 ПНЖК. '-' жирная кислота не найдена.

МГДГ из морских макрофитов является самым ненасыщенным гликоглицеролипидом. Содержание полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) колеблется от 67.7 в МГДГ из S. pallidum до 96.2% в МГДГ из U. fenestrata. Состав и структура ПНЖК сильно различается в 5 использованных препаратах МГДГ. Так, сумма ПНЖК C₁₈ ряда самая высокая у Z. marina (68,8%) и самая низкая у A. tobuchiensis (0.6%), а сумма ПНЖК С₂₀ ряда, наоборот, самая высокая у A. tobuchiensis (74,2%) и самая низкая у Z. marina (1,2%). При этом соотношение n-3/n-6 ПНЖК у А. tobuchiensis намного ниже (0,97), чем у Z. marina (7,5). Но это соотношение максимально у U. fenestrata (38,75). У U. fenestrata главной жирной кислотой является 16:4n-3 (43,7%), а у Z. marina - 18:3n-3 (58,8%). У A. tobuchiensis самый высокий уровень арахидоновой кислоты 20:4n-6 (36,8%), а у S. pallidum самый высокий уровень суммы ПНЖК n-6 ряда (40,2%). За разнообразием состава и структуры ПНЖК стоят различные иммунологические свойства, проявляемые этими гликолипидами в составе ТИ-комплексов.

МГДГ в ТИ-комплексах выполняет роль липидного матрикса для инкорпорированного антигена. Поэтому иммунный ответ на антиген зависит от физического состояния окружающих его липидов, которое в первую очередь определяется составом жирных кислот.

Впервые обнаружено, что МГДГ с разным жирнокислотным составом может использоваться для взаимосвязанного воздействия на конформацию, антигенную структуру и иммуногенность белкового антигена на примере порина из Y. pseudotuberculosis.

Для подтверждения вышесказанного авторы заявляемого изобретения использовали несколько физико-химических методов - метод дифференциальной сканирующей калориметрии, спектрофлюоресценции, кругового дихроизма и иммуноблоттинга, которые обычно применяются для изучения конформации белков. Из названных методов наиболее показательным является метод иммуноблоттинга (фиг.5, 6), описанный в примере 6.

Изучение конформации тримера порина проводили с помощью метода дифференциальной сканирующей калориметрии, спектрофлюоресценции и кругового дихроизма.

Методом дифференциальной сканирующей калориметрии показано, что МГДГ с различным составом жирных кислот по-разному влияет на конформацию нативного порина в тримерной форме, судя по различному эффекту МГДГ на термодинамические параметры необратимого перехода из нативной конформации порина в денатурированную, что подтверждается данными, приведенными на фиг.3. На фиг.3 показано изменение температурной зависимости избыточной молярной теплоемкости порина YOmpF (тримерная форма) в свободном виде (белые кольца) и в комплексе с МГДГ из A. tobuchiensis (черные кольца), с МГДГ из U. fenestrata (белые треугольники), с МГДГ из Z. marina (черные треугольники) и с МГДГ из S. pallidum (белые четырехугольники). Скорость сканирования - 60° К/ч. Концентрация белка - 0.8 мг/мл буфера трис-HCl, 0.03 М, pH 8 с 0.125% октилглюкозида.

С помощью спектрофлюоресценции проведена оценка конформационных изменений в порине на уровне третичной структуры в зависимости от жирнокислотного состава МГДГ по спектрам суммарной флуоресценции остатков тирозина (Tyr) и триптофана (Trp) белка (фиг.4). Показано, что добавление МГДГ к порину приводит к различным изменениям третичной структуры порина, проявляющиеся в отчетливом повышении интенсивности флуоресценции и длинноволновом сдвиге максимума флуоресценции. Те липиды, которые давали наибольший иммуностимулирующий эффект (МГДГ из S. pallidum и U. fenestrata), в наименьшей степени способствуют увеличению интенсивности флуоресценции белка-антигена и наибольшей длинноволновому сдвигу максимума интенсивности флуоресценции порина. На фиг.4 показаны спектры флуоресценции порина YOmpF (тримерная форма) в свободном виде (кривая 1) и в комплексе с МГДГ из A. tobuchiensis (кривая 2), с МГДГ из S. pallidum (кривая 3), с МГДГ из Z. marina (кривая 4), с МГДГ из U. fenestrata (кривая 5).

Методом кругового дихроизма проведена оценка изменений элементов вторичной структуры белка, содержание которых показано в табл.2. Основной вторичной структурой порина является β-структура, содержание которой снижается с 65% в свободном порине до 58-63% в порине в комплексе с МГДГ. Во всех образцах порина отсутствует α-спиральная структура. В зависимости от жирнокислотного состава МГДГ меняется β-структура, β-изгибы и неупорядоченная структура.

Таблица 2 Содержание элементов вторичной структуры порина YOmpF (тримерная форма), рассчитанные по методу Провенчера-Глокера, % Образец β-структура β-изгиб неупорядоченная структура Порин 65 33 3 Порин + МГДГ из A. tobuchiensis 63 33 4 Порин + МГДГ из Z. marina 59 37 4 Порин + МГДГ из U. fenestrata 60 35 6 Порин + МГДГ из S. pallidum 58 36 7

Изменения в конформации порина, приводящие к изменению антигенной структуры порина, показаны также с помощью метода иммуноблотинга по степени взаимодействия белка с используемыми антителами с определенной специфичностью (фиг.5, 6). МГДГ из разных видов морских макрофитов в разной степени проявляют шаперонный эффект, то есть в разной степени способствуют поддержанию конформации нативного тримера и мономера порина и соответствующих антигенных детерминант. На фиг.5 показан эффект МГДГ из разных видов макрофитов на конформацию тримерного порина YOmpF при 4°С. ТМ - тримерный порин, ОМ - олигомерный порин, Ahn - порин + МГДГ из A. tobuchiensis, Sarg - порин + МГДГ из S. pallidum; Ulva - порин + МГДГ из U. fenestrata; Zost - порин + МГДГ из Z. marina, '-' - свободный порин. Конформационно специфичные поликлональные антитела (pAb) против нативного тримера YOmpF. МГДГ из A. tobuchiensis в наибольшей степени способствует поддержанию нативной конформации тримера порина при 4°С, а МГДГ из S. pallidum, наоборот, маскирует антигенные детерминанты нативного тримера, то есть проявляет антишаперонный эффект (фиг.5).

На фиг.6 (а, б) показан эффект МГДГ с разным жирнокислотным составом на конформацию нативного мономерного порина YOmpF при разной температуре: (а) - при 4°С, (б) - при 75°С. ДМ - денатурированный мономер, НМ - нативный мономер порина YOmpF, Ahn - порин + МГДГ из Ahnfeltia tobuchiensis, Sarg - порин + МГДГ из S. pallidum, Ulva - порин + МГДГ из U. fenestrata; Zost - порин + МГДГ из Z. marina; '-' - свободный порин. Действие МГДГ на нативный мономер порина при 4°С проявляется в образовании небольшого количества денатурированной формы порина, что особенно заметно для МГДГ из S. pallidum. В меньшей степени этот эффект проявляется для МГДГ из U. fenestrata, а минимальное действие оказали МГДГ из A. tobuchiensis и Z. marina. При высоких значениях температуры (75°С) резко увеличивается содержание денатурированной формы мономерного порина. В этих условиях действие МГДГ прямо противоположно действию при низких температурах, то есть МГДГ понижает содержание денатурированной формы порина. При этом МГДГ из A. tobuchiensis и U. fenestrata проявляют наибольшую активность, а МГДГ из Z. marina и, особенно, из S. pallidum - наименьшую.

Ранее не известные из уровня техники данные подтверждают, что в целом МГДГ из разных видов морских макрофитов с различным составом жирных кислот оказывает различный эффект как на конформацию нативного мономерного и тримерного порина, так и его антигенные детерминанты.

Путем экспериментальных исследований взаимосвязи между физико-химическими свойствами гликолипидов из морских макрофитов, конформацией белкового антигена, инкорпорированного в иммуностимулирующий комплекс, и его иммуногенности выявлены факторы, позволяющие осуществлять целенаправленную регуляцию иммуногенности антигена и обеспечивать моделирование типа иммунной реакции организма на антиген, что позволяет получать новые средства специфической профилактики против возбудителей псевдотуберкулеза и других инфекционных заболеваний.

В результате полученные данные свидетельствуют о возможности регуляции иммуногенности белкового антигена в составе ТИ-комплекса не только благодаря изменению количественного состава комплекса, но и его качественного состава (МГДГ с различным жирнокислотным составом).

Возможность осуществления изобретения подтверждена экспериментально.

При этом необходимо, чтобы МГДГ из разных видов морских макрофитов должны быть хроматографически чистыми, профиль их жирнокислотного состава подтвержден с помощью ГЖХ и хромато-масс-спектрометрии, а температура их фазового перехода установлена методом ДСК. МГДГ получают с помощью колоночной и тонкослойной хроматографии (Sanina N., Goncharova S., Kostetsky E. Seasonal changes of fatty acid composition and thermotropic behavior of polar lipids from marine macrophytes. Phytochemistry, 2008, Vol 69/7, pp 1517-1527).

Препарат КД получают из голотурии С. japonica с помощью высокоэффективной жидкостной хромато-масс-спектрометрии (Авилов С.А., Тищенко Л.Я., Стоник В.А. Строение кукумариозида А₂-2 - тритерпенового гликозида из голотурии С. japonica / Химия природ. соедин. 1984. №6. С.799-800). Структура КД должна быть подтверждена с помощью ЯМР и хромато-масс-спектрометрии.

Для исследования влияния МГДГ с разным жирнокислотным составом на иммуногенность белкового антигена порина YOmpF, инкорпорированного в ТИ-комплексы, были приготовлены пять ТИ-комплексов, в состав которых вошли: МГДГ из U. fenestrata, A. tobuchiensis, L. japonica, S. pallidum, Z. marina.

В качестве антигена, встроенного в 5 различных ТИ-комплексов, использована тримерная форма порина YOmpF, как наиболее иммуногенная.

Пример 1. Приготовление ТИ-комплекса, состоящего из КД:ХОЛ:МГДГ из U. fenestrata с весовым соотношением 6:2:4 и тримерного порина YOmpF.

5 мг МГДГ растворяют в 1 мл хлороформа, 5 мг холестерина растворяют в 1 мл хлороформа, а 4 мг КД растворяют в 1 мл дистиллированной воды. 70 мкл раствора тримера порина YOmpF с концентрацией 1 мг/мл фосфатно-солевого буфера, содержащего 0,125% октилгликозида, подвергают диализу в течение 12 часов против 10 мл чистого фосфатно-солевого буфера через целлофановую мембрану. Автоматической пипеткой на 200 мкл отбирают 66 мкл раствора МГДГ и 33 мкл раствора холестерина, упаривают досуха в струе воздуха при 60°С, к сухому остатку прибавляют 125 мкл раствора КД, в смесь добавляют 375 мкл фосфатно-солевого буфера pH 7,2 автоматической пипеткой на 1000 мкл. Суспензию озвучивают 5 минут ультразвуковым дезинтегратором при 10% максимальной мощности в режиме «7» (0.7 с работа, 0.3 с перерыв). Концентрация липидов в полученной суспензии составляет 1 мг/мл. Немедленно после обработки ультразвуком автоматической пипеткой на 200 мкл отбирают 100 мкл полученной липид-сапониновой суспензии и соединяют с 10 мкл раствора порина, взятого с помощью автоматической пипетки на 20 мкл, смесь встряхивают на миксере Vortex в течение 1 минуты. После встряхивания препарат оставляют при комнатной температуре на 2 часа. Непосредственно перед введением мышам к полученному препарату автоматической пипеткой на 1000 мкл прибавляют 890 мкл фосфатно-солевого буфера и перемешивают смесь 5-6 раз, переворачивая пробирку. Получают комплекс, в котором конечная концентрация липидов составляет 0,1 мг/мл, КД 0,1 мг/мл, порина 0,01 мг/мл.

Пример 2. Приготовление ТИ-комплекса, состоящего из КД:ХОЛ:МГДГ из A. tobuchiensis с весовым соотношением 6:2:4 и тримерного порина YOmpF. По примеру 1, но для получения ТИ-комплекса использовали МГДГ из A. tobuchiensis.

Пример 3. Приготовление ТИ-комплекса, состоящего из КД:ХОЛ:МГДГ из L. japonica с весовым соотношением 6:2:4 и тримерного порина YOmpF. По примеру 1, но для получения ТИ-комплекса использовали МГДГ из L. japonica.

Пример 4. Приготовление ТИ-комплекса, состоящего из КД:ХОЛ:МГДГ из S. pallidum с весовым соотношением 6:2:4 и тримерного порина YOmpF. По примеру 1, но для получения ТИ-комплекса использовали МГДГ из S. pallidum.

Пример 5. Приготовление ТИ-комплекса, состоящего из КД:ХОЛ:МГДГ из Z. marina с весовым соотношением 6:2:4 и тримерного порина YOmpF. По примеру 1, но для получения ТИ-комплекса использовали МГДГ из Z. marina.

Пример 6. Исследование эффекта МГДГ из разных видов морских макрофитов на конформацию и антигенную структуру порина из Y. pseudotuberculosis методом иммуноблоттинга

Используют нативную тримерную и мономерную формы порина YOmpF, поликлональные антитела кролика, полученные к нативной тримерной и термоденатурированной мономерной формам порина YOmpF (Cocalico, USA) соответственно. Гель-электрофорез проводят в 12%-ном полиакриламидном геле (BioRad), не содержащем додецилсульфата натрия (ДСН). Порин используют в концентрации 250 мкг/мл в 0.1 М Tris-HCl буфере, pH 6.5, содержащем 0.25% ДСН. Для получения комплексов порина с МГДГ 0.1 мг МГДГ смешивают с 0.5 мл Tris-HCl буфера, pH 6.5, содержащего 10 мМ NaCl, озвучивают на льду ультразвуковым дезинтегратором (фирма Branson). Полученную дисперсию липида смешивают с раствором порина в соотношении 1:1 по объему и инкубируют при 4°С или 75°С в течение 15 мин. Затем добавляют 2× буфер (1:1 по объему), содержащий 2% ДСН (10 мл буфера содержит 1 мл глицерина, 200 мг ДСН, 2,5 мл 4× геля и 1-2 кристалла бромфенолового синего). Образцы выдерживают перед нанесением на гель при комнатной температуре в течение 20 мин. Полученные образцы загружают в гель в количестве 20 мкл на лунку. Электрофорез проводят с помощью готового электрофорезного буфера 10Х (BioRad), разведенного в 10 раз (содержащего 0,1% ДСН в конечной концентрации). Электрофорез проводят в камере BioRad при 75-110 В в течение 1-1,5 часов. После электрофореза перед проведением блоттинга гель выдерживают 10 мин в катодном буфере (25 мM Tris, 40 мM глицина, 20% метанола, pH 9.4). Для количественной оценки белка гель перед блоттингом выдерживают в течение 30 мин в биоКумасси (BioRad). Инкубацию проводят в течение 30 мин, затем гель отмывают в течение 30-50 мин в дистиллированной воде и идентифицируют полосы белка. Белки переносят из полиакриламидного геля на мембрану методом сухого переноса (электроблоттинга). Для проведения электроблоттинга используют катодный буфер (25 мM Tris, 40 мM глицина, 20% метанола, pH 9.), анодный буфер №1 (0.3 М Tris, 10% метанола, pH 10.4), анодный буфер №2 (25 мM Tris, 10% метанола, pH 10.4). Пока гель находится в катодном буфере, в систему для блоттинга на анод накладывается 1 слой фильтровальной бумаги, смоченной в анодном буфере №1; 2 слоя в анодном буфере №2; 1 слой поливинилиден-дифлюорида (PVDF); гель; 3 слоя бумаги, смоченной в катодном буфере. Блоттинг проводят в течение 90 минут с помощью Milliblot-SDE аппарата для электроблоттинга; напряжение 2.5 мA/см² геля. После блоттинга PVDF-мембрану блокируют на ночь в 5% БСА в TBS-NP40 буфере (10 мМ Трис-HCl, pH 7.4/0.9% NaCl), содержащего 0.05% детергента Nonidet P-40. Мембрану отмывают в TBS-NP40 буфере 15 минут, затем инкубируют в течение часа с первыми антителами (1:10000 в TBS-NP40 буфере). Затем 3 раза по 15 мин отмывают в TBS-NP40 и инкубируют в течение часа со вторыми антителами, мечеными пероксидазой (1:10000, Amersham). 3 раза отмывают TBS-NP40 и 1 раз TBS. Затем мембрану обрабатывают проявляющими реагентами (Amersham) в течение минуты. Визуализацию проводят с помощью Fluor-S Max™ Multilmager (Bio-Rad).

Способ регуляции иммуногенности антигена предусматривает инкорпорирование антигена в структуру иммуностимулирующего комплекса (ТИ-комплекса) - носителя антигена. В качестве белкового антигена используют порин из Yersinia pseudotuberculosis, а его носителем является иммуностимулирующий комплекс в виде ультрамикроскопических тубул (ТИ-комплекс), состоящий из смеси тритерпенового гликозида кукумариозида А₂-2 (КД), холестерина и полярного липида моногалактозилдиацилглицерида (МГДГ) из морских макрофитов при весовом соотношении КД:холестерин:МГДГ 6:2:4. Варьирование липидного окружения антигена достигается за счет использования МГДГ с разным жирнокислотным составом, выделенным из различных видов морских макрофитов. Способ позволяет осуществлять целенаправленную регуляцию иммунного ответа на антиген не только благодаря изменению количественного состава комплекса, но и его качественного состава, и получать новые, оптимальные средства специфической профилактики против возбудителей псевдотуберкулеза и других инфекционных заболеваний. 2 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл.

1. Способ регуляции иммуногенности антигена путем его инкорпорирования в структуру иммуностимулирующего комплекса (ТИ-комплекса) - носителя антигена, состоящего из смеси тритерпенового гликозида кукумариозида А₂-2 (КД), холестерина и полярного липида моногалактозилдиацилглицерида (МГДГ) из морских макрофитов, отличающийся тем, что используют МГДГ с различным составом жирных кислот, выделенный из разных видов морских макрофитов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что весовое соотношение КД:холестерин:МГДГ в ТИ-комплексе составляет 6:2:4.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве антигена используют тример порина из Yersinia pseudotuberculosis (YOmpF).